专利名称：龙葵总碱的抗肿瘤作用及其药物制剂的制作方法 现代社会癌症已成为威胁人类生命健康的主要问题之一，世界卫生组织(WHO)报告表明，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。医疗界迫切需求安全有效的癌症治疗药物。 本发明所述的龙葵总碱来源于单味药材——龙葵(其中含有多种生物碱，有澳洲茄边碱、澳洲茄碱、茄微碱及茄达碱等，生物碱以果实总含量最高)，我们结合文献资料，运用现代科学方法，在制备工艺、质量标准、药效、毒理及稳定性等方面进行了研究，以龙葵总碱为原料制成药物制剂，用于癌症辅助治疗。目前，尚未见龙葵总碱及其制剂应用于在抗肿瘤药物方面的报道，国内尚没有有关龙葵总碱的制剂在SFDA注册，国内外专利(中国专利、日本专利、韩国专利、欧洲专利、美国专利等)均未出现与本发明相近的专利保护内容。
本发明的一个目的是提供一种抗肿瘤疗效显著、毒副作用小、使用安全的以龙葵为原料提取而得的龙葵总碱及其药物制剂。 本发明是通过如下技术方案实现的 本发明中龙葵总碱提取物中，龙葵总碱含量为50.0％以上。 龙葵总碱提取步骤如下 取龙葵全草与/或果实，加入50％～90％乙醇溶液提取2～3次，每次6～8倍量，回收乙醇，浓缩至相对密度1.25，浓缩液中加入2～4倍量的0.1mol/l酸性溶液，充分搅拌，冷藏，过滤，滤渣用盐酸溶液洗涤1～3次，合并滤液和洗涤液，以弱极性或中等极性树脂吸附。树脂吸附后先用水冲洗树脂柱/床至流出液近中性；再以0.1mol/l碱性溶液冲洗树脂柱/床至流出液近无色，再以含醇量30％～40％乙醇液冲洗树脂柱/床至流出液近无色。弃去。再以50～90％乙醇进行洗脱，至洗脱液显无色，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，以0.5～1.5mol/l的碱性溶液调PH值至8～10，静置，冷藏，收集沉淀。自然晾干，即可得龙葵总碱提取物。 以上所述的碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁和氨水溶液；所述的酸性溶液选自醋酸、盐酸、硫酸和柠檬酸溶液；所述的方法1洗脱用有机溶剂为甲醇、无水乙醇、正丁醇、氯仿、苯的一项或者两项或者三项以任意比例形成的混合相；所述的方法2用有机溶剂为甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、苯的一项或者两项或者三项以任意比例形成的混合相。
本发明的药物制剂含有1％～99％的龙葵总碱含量为50％～99％的龙葵总碱提取物和99％～1％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，优选含有45％～95％的龙葵总碱含量为50％～99％的龙葵总碱提取物和55％～5％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有75％～90％的龙葵总碱含量为50％～99％的龙葵总碱提取物和25％～10％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
按药剂学方法，可以将本发明的龙葵总碱提取物制备成多种临床药物剂型作为抗肿瘤药物，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、混悬剂、口服液体制剂等；所述非肠道给药剂型为注射液、输液剂、冻干注射剂、注射乳剂、气雾剂、栓剂等。
本发明的抗肿瘤药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、粘合剂、着色剂、防腐剂等。本发明抗肿瘤药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的澳洲茄碱提取物为一定的药物原料，再配伍其它已允许合用的中药或化学药品。
本发明的龙葵总碱及其药物制剂具有抗肿瘤作用，是通过以下的药效学实验得到证实的。
实验例1注射用龙葵总碱体外对肿瘤的抑制作用 注射用龙葵总碱分为五组剂量(0.4、2、10、40、120μg·ml-1)，分别体外作用于10种肿瘤细胞。从整个实验可以看出，在120μg/ml及40μg/ml剂量下，注射用龙葵总碱对于10种肿瘤细胞的均表现出很强的抑制作用，随着注射用龙葵总碱浓度的降低，肿瘤抑制率逐渐下降，当注射用龙葵总碱浓度降至0.4μg/ml时，肿瘤细胞基本不受影响。注射用龙葵总碱对各种肿瘤细胞的半数抑制率经计算分别为11.69μg/ml(SMMC-7721)、17.22μg/ml(BGC-803)、14.63μg/ml(A549)、14.58μg/ml(LOVO)、13.19μg/ml(B16)、7.39μg/ml(NCI-H460)、13.40μg/ml(KETR-3)、32.42μg/ml(PC-12)、6.99μg/ml(ECA-109)、143.01μg/ml(S180)。
从肿瘤细胞形态上看，在120μg/ml及40μg/ml剂量作用下，肿瘤细胞结构均遭到破坏，细胞数量稀少；随着注射用龙葵总碱剂量的降低，肿瘤细胞形态趋于完整，但数量仍较少；在0.4μg·ml-1剂量下，注射用龙葵总碱对肿瘤的抑制作用消失，细胞形态完整，数量较多。
综上所述，注射用龙葵总碱对于各种肿瘤细胞在体外均有较强的抑制作用，能明显抑制肿瘤细胞在体外的生长，改变肿瘤细胞的形态，引起肿瘤细胞的死亡。结果见表1～10。
表1注射用龙葵总碱体外对SMMC-7721的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表2注射用龙葵总碱体外对BGC-803的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表3注射用龙葵总碱体外对A549的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表4注射用龙葵总碱体外对LOVO的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表5注射用龙葵总碱体外对B16的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表6注射用龙葵总碱体外对NCI-H460的抑制作用(x±S，n＝12)

注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表7注射用龙葵总碱体外对KETR-3的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表8注射用龙葵总碱体外对S180的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表9注射用龙葵总碱体外对PC12的抑制作用(x±S，n＝12)

注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 表10注射用龙葵总碱体外对ECA109的抑制作用(x±S，n＝12)
注与正常对照组相比＊＊P＜0.01 实验例2注射用龙葵总碱对Hep肝癌移植性肿瘤的影响 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、5-Fu组(25mg/kg)、华蟾素组(3g/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，分别静脉注射给予相应药物(模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，给药容积均为10ml/kg。给药8天后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率。实验重复2次。

实验结果小鼠接种Hep肝癌肿瘤后，4天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。注射用龙葵总碱对小鼠体重增长率、胸腺指数、脾指数无明显影响。注射用龙葵总碱静脉注射三个剂量组的抑瘤率均大于口服组。结果见表11～15。
表11注射用龙葵总碱对Hep肝癌移植性实体瘤抑瘤率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表12对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠体重增长率的影响(第一次实验)(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表13对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响(第一次实验)(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表14对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠体重增长率的影响(第二次实验)(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表15对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响(第二次实验)(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
实验例3注射用龙葵总碱对S180移植性实体瘤抑瘤率的影响 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、5-Fu组(25mg/kg)、华蟾素组(3g/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，分别静脉注射给予相应药物(模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，给药容积均为10ml/kg。给药8天后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率。实验重复2次。

试验结果小鼠接种S180移植性实体瘤后，3天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。注射用龙葵总碱对小鼠体重增长率、胸腺指数、脾指数无明显影响。注射用龙葵总碱静脉注射三个剂量组的抑瘤率均大于口服组。结果见表16～20。
表l6注射用龙葵总碱对S180移植性实体瘤抑瘤率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表17对S180移植性实体瘤小鼠体重增长率的影响(第一次实验)(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表18对S180移植性实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响(第一次实验)(x±S)

注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表19对S180移植性实体瘤小鼠体重增长率的影响(第二次实验)(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表20对S180移植性实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响(第二次实验)(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
实验例4注射用龙葵总碱对Walker-256移植性鼠肝癌的影响 实验方法将模型大鼠随机分为5组，每组10只。即即模型组、华蟾素组(25mg/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg)。各组大鼠分别给予相应受试药物，给药容积为10ml/kg，连续给药10天。给药10日后，脱颈椎处死大鼠，记录重量大小，按照下面公式计算肿瘤体积。肿瘤组织用10％甲醛固定，待做组织病理学观察。

实验结果注射用龙葵总碱中、大剂量组的肿瘤体积和模型组相比，显著缩小，具有统计学意义(P＜0.05)。病理学检查评分显示注射用龙葵总碱中、大剂量组可以减小肿瘤体积，抑制肿瘤生长(P＜0.05)。
病理检查显示 (1)Walker-256癌性腹水种植到肝脏后，在肝脏内形成肿块，肿块内瘤细胞异型性明显，大小、形态不一，核大、深染、核分裂相易见。肿瘤细胞排列紧密，部分区域有坏死及出血。肿瘤无包膜，向周边部肝细胞呈浸润性生长。
(2)应用注射用龙葵总碱后荷瘤大鼠数目减少，形成的肿瘤体积减小，坏死明显。肿瘤周边出现部分结缔组织包膜，并见单个核细胞浸润。上述结果说明注射用龙葵总碱中、大剂量药物对种植性Walker-256肝癌有抑制作用。结果见表21～22。
表21对Walker-256移植性鼠肝癌肿瘤体积的影响(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表22对Walker-256移植性鼠肝癌病理评分的影响(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
实验例5注射用龙葵总碱对荷Hep肝癌小鼠白细胞、血小板的影响 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、5-Fu组(25mg/kg)、华蟾素组(3g/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，分别静脉注射给予相应药物(模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，给药容积均为10ml/kg。给药8天后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率。

实验结果小鼠接种Hep肝癌肿瘤后，4天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。注射用龙葵总碱对小鼠白细胞、血小板、体重增长率、胸腺指数、脾指数无明显影响。注射用龙葵总碱静脉注射三个剂量组的抑瘤率均大于口服组。结果见表23～26。
表23注射用龙葵总碱对Hep肝癌移植性实体瘤抑瘤率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表24对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠体重增长率的影响(第一次实验)(x±S，n＝10)

注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表25对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响(第一次实验)(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
表26对Hep肝癌移植性实体瘤小鼠白细胞、血小板计数的影响(x±S)
注和模型组相比较，＊＊P＜0.01。
实验例6注射用龙葵总碱对荷瘤(Hep)小鼠60Co放疗的增效减毒作用 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、放疗组、放疗加华蟾素组(3g/kg)和放疗加注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，除模型组外，其他各组小鼠接种24h后均用60Co照射一次，照射剂量为500Cgy，射后2h，放疗加华蟾素组，放疗加注射用龙葵总碱小、中、大剂量组分别静脉注射给予相应药物，模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药。8天后眼眶取血，测定血常规。取血后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率；取胸腺、脾脏，称重，按照下面公式计算胸腺指数和脾指数。


实验结果小鼠接种Hep肝癌移植性实体瘤后，模型组4天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量大于1g，放疗及放疗加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。放疗加注射用龙葵总碱三个剂量组瘤重均小于放疗组(P＜0.05，P＜0.01)，表明注射用龙葵总碱对60Co放疗具有一定的增效作用。放疗加注射用龙葵总碱三个剂量组的白细胞和血小板计数均大于放疗组，但无统计学意义。放疗加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠体重增长率均高于放疗组(P＜0.01)，放疗加注射用龙葵总碱大剂量的胸腺指数高于放疗组(P＜0.05)，具有统计学意义。结果见表27～30。
表27对荷瘤(Hep)小鼠抑瘤率的影响(x±S)
注和模型组相比较△△P＜0.01；和放疗组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表28对荷瘤(Hep)小鼠白细胞、血小板计数的影响(x±S)

注和模型组相比较，△△P＜0.01；放疗组相比较，＊P＜0.05， 表29对荷瘤(Hep)小鼠体重增长率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和放疗组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表30对荷瘤(Hep)小鼠胸腺指数、脾指数的影响(x±S)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和放疗组比较＊P＜0.05。
实验例7 注射用龙葵总碱对荷瘤(S180)小鼠CTX化疗的增效减毒作用 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、CTX组(10mg/kg)、CTX(10mg/kg)加华蟾素组(3g/kg)和CTX(10mg/kg)加注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，分别静脉注射给予相应药物(模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，8天后眼眶取血，测定血常规。取血后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率；取胸腺、脾脏，称重，按照下面公式计算胸腺指数和脾指数。


实验结果小鼠接种S180移植性实体瘤后，3天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，CTX及CTX加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。CTX加注射用龙葵总碱三个剂量组瘤重均小于CTX组，其中CTX加注射用龙葵总碱中、大剂量组和CTX组相比，有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。表明注射用龙葵总碱对CTX具有一定的抗肿瘤增效作用。CTX加注射用龙葵总碱三个剂量组的白细胞和血小板和CTX组相比，无显著差异。CTX加注射用龙葵总碱大剂量组小鼠的胸腺指数显著高于CTX组(P＜0.05)，CTX加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠的体重增长率均显著高于CTX组(P＜0.05，P＜0.01)。结果见表31～34。
表31对荷瘤(S180)小鼠抑瘤率的影响(x±S)
注和模型组相比较△△P＜0.01；和CTX组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表32对对荷瘤(S180)小鼠白细胞、血小板计数的影响(x±S)

注和模型组相比较，△△P＜0.01。
表33对对荷瘤(S180)小鼠体重增长率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和CTX组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表34对对荷瘤(S180)小鼠胸腺指数、脾指数的影响(x±S)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和CTX组比较＊P＜0.05。
实验例8注射用龙葵总碱对荷瘤(Hep)小鼠MMC化疗的增效减毒作用 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、MMC组(1mg/kg)、MMC(1mg/kg)加华蟾素组(3g/kg)和MMC(1mg/kg)加注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，分别静脉注射给予相应药物(模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，8天后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率。取胸腺、脾脏，称重，按照下面公式计算胸腺指数和脾指数。


实验结果小鼠接种Hep肝癌移植性实体瘤后，4天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，MMC及MMC加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。MMC加注射用龙葵总碱三个剂量组瘤重均小于MMC组，其中MMC加注射用龙葵总碱中、大剂量组和MMC组相比，有统计学意义(P＜0.01)。表明注射用龙葵总碱对MMC具有一定的抗肿瘤增效作用。MMC加注射用龙葵总碱三个剂量组的白细胞、血小板、胸腺指数和脾指数和MMC组相比，无显著差异。MMC加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠的体重增长率均显著高于MMC组(P＜0.01)。结果见表35～38。
表35对荷瘤(Hep)小鼠小鼠抑瘤率的影响(x±S)
注和模型组相比较△△P＜0.01；和MMC组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表36对荷瘤(Hep)小鼠白细胞、血小板计数的影响(x±S)

注和模型组相比较，△△P＜0.01；和MMC组比较＊P＜0.05。
表37对荷瘤(Hep)小鼠体重增长率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和MMC组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表38对荷瘤(Hep)小鼠胸腺指数、脾指数的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和MMC组比较＊P＜0.05。
实验例9注射用龙葵总碱对荷瘤(Hep)小鼠5-Fu化疗的增效减毒作用 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、5-Fu组(15mg/kg)、5-Fu(l5mg/kg)加华蟾素组(3g/kg)和5-Fu(15mg/kg)加注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)和LK口服组(2mg/kg)，每组10只，分别静脉注射给予相应药物(模型组注射等容积生理盐水，5-Fu组隔日注射一次)，8天后处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按下面公式计算抑瘤率。

实验结果小鼠接种Hep肝癌移植性实体瘤后，4天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，5-Fu及5-Fu加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。5-Fu加注射用龙葵总碱三个剂量组瘤重均小于5-Fu组，其中5-Fu加注射用龙葵总碱大剂量组和5-Fu组相比，有统计学意义(P＜0.01)。表明注射用龙葵总碱对5-Fu具有一定的抗肿瘤增效作用。5-Fu加注射用龙葵总碱三个剂量组的白细胞、血小板、脾指数和5-Fu组相比，无显著差异。5-Fu加注射用龙葵总碱大剂量组小鼠的胸腺指数显著高于5-Fu组(P＜0.05)，5-Fu加注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠的体重增长率均显著高于5-Fu组(P＜0.05)。结果见表35～38。
表35对荷瘤(Hep)小鼠抑瘤率的影响(x±S)
注和模型组相比较△△P＜0.01；和CTX组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表36对荷瘤(Hep)小鼠白细胞、血小板计数的影响(x±S)
注和模型组相比较，△△P＜0.01。
表37对荷瘤(Hep)小鼠体重增长率的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和5-Fu组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表38对荷瘤(Hep)小鼠胸腺指数、脾指数的影响(x±S，n＝10)
注和模型组相比较，△△P＜0.01；和5-Fu组比较＊P＜0.05。
实验例10注射用龙葵总碱对荷瘤小鼠TNF-α，IL-2的影响 实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1∶3稀释，取ICR小鼠70只，♀♂各半，体重18～22g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、5-Fu组(25mg/kg)、华蟾素组(3g/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服组(2mg/kg)，每组10只，另取10只小鼠作为正常对照组。分别静脉注射给予相应药物(正常对照组和模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)。给药容积均为10ml/kg。给药8天后，眼眶取血，常规分离血清，-20℃保存，待测TNF-α和IL-2；脱颈椎处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按照下面公式计算抑瘤率；取胸腺、脾脏，称重，按下面公式计算胸腺指数和脾指数。


实验结果小鼠接种S180移植性实体瘤后，3天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，注射用龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(P＜0.01)。模型组小鼠血清TNF-α、IL-2含量均低于正常对照组，注射用龙葵总碱各组均可以升高血清TNF-α、IL-2含量，其中注射用龙葵总碱中、大剂量组和模型组相比，具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。结果见表39～41。
表39注射用龙葵总碱对S180移植性实体瘤抑瘤率的影响(x±S)
注和模型组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表40注射用龙葵总碱对S180移植性实体瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响(x±S)
注和正常对照组组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表41对S180移植性实体瘤小鼠血清TNF-α和IL-2含量的影响(x±S)
注和正常对照组相比较，△△P＜0.01；和模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
实验例11注射用龙葵总碱对小鼠血清溶血素量的影响 实验方法ICR小鼠70只，体重20～24g，雌雄各半。然后随机分为7组，每组10只，即正常对照组、模型组、黄芪注射液组(6.7g/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)和LK口服组(2mg/kg)。各组小鼠静脉注射给予相应受试药物(正常对照组和模型组静脉注射给予等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，给药容积为10ml/kg，连续给7日。给药后第4、6日，除正常对照组其余各组分别腹腔注射30mg/kg环磷酰胺，正常对照组注射等容积生理盐水。各组小鼠从第3日开始分别腹腔注射5％绵羊红细胞生理盐水悬液0.2ml进行免疫，共4日。
末次灌胃给药后30min，小鼠眼眶取血，分离血清50μl，生理盐水稀释500倍。取稀释血清1ml，加入5％绵羊红细胞0.5ml以及10％补体(新鲜豚鼠混合血清经SRBC<10∶1>于4℃吸收30min后置于-20℃备用)1ml，混匀后置于37℃恒温水浴中30min，然后移至冰浴中终止反应。1500rpm离心5min，取上清液1ml，加都氏试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g加入蒸馏水1000ml)3ml，放置10min后，于540nm处测吸收度值。
SRBC半数溶血时的吸收度值取5％SRBC0.25ml加都氏液至4ml，放置10min后，比色读取吸收光度值。按下面公式计算每只小鼠样晶的半数溶血值(HC50)。

实验结果造模后小鼠血清溶血素量下降，模型组与正常对照组比较有显著性差异(p＜0.05)，表明小鼠经造模后血清血溶素水平明显下降；注射用龙葵总碱三个剂量组均能明显升高小鼠血清血溶素量水平，与模型组比较有显著性差异(p＜0.05)。结果见表42。
表42对小鼠血清溶血素的影响(x±S)
注和正常对照组相比，△△P＜0.01；和模型组相比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
实验例12注射用龙葵总碱对小鼠炭粒廓清的影响 实验方法ICR小鼠90只，体重18～22g，雌雄各半。然后随机分为6组，每组15只，即正常对照组、黄芪注射液组(6.7g/kg)和注射用龙葵总碱小、中、大剂量组(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)和LK口服组(2mg/kg)。静脉注射给予相应受试药物(正常对照组和模型组静脉注射给予等容积生理盐水，口服组灌胃给药)，给药容积为10ml/kg，连续给5日。末次给药后30min，尾静脉注射25％的印度墨汁0.1ml/10g，于2min和10min分别眼眶取血20μl，加入盛有2ml的碳酸钠溶液(浓度1mg/ml)试管中，在680nm出测吸光度值OD2min和OD10min，将采完血液的小鼠处死，取肝、脾脏称重。按下列公式计算廓清指数k及吞噬指数a。结果进行组间t检验。


实验结果和正常对照组相比，注射用龙葵总碱中、大剂量组均可以增加小鼠的碳粒廓清指数及吞噬指数，具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，表明注射用龙葵总碱可以增强小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能。结果见表43。
表43对小鼠碳粒廓清率的影响(x±S，n＝15)
△△p＜0.01，与空白对照组比较；＊p＜0.05，＊＊p＜0.01与模型组比较。
本发明的龙葵总碱及其药物制剂具有毒副作用低的特点，是通过以下的一般药理学、毒理学及安全性实验得到证实的。
实验例13注射用龙葵总碱急性毒性实验 1、注射用龙葵总碱一次静脉注射给药的小鼠LD50为42.5mg/kg，其95％的置信限为38.0～47.6mg/kg，拟临床人用剂量为0.2mg/kg，LD50是临床人用剂量的212.5倍。
2、注射用龙葵总碱一次腹腔注射给药的小鼠LD50为31.4mg/kg，其95％的置信28.8～34.2mg/kg，拟临床人用剂量为0.2mg/kg，LD50是临床人用剂量的157倍。
3、注射用龙葵总碱一次静脉注射给药的大鼠LD50为12.8mg/kg，其95％的置信限为11.5～14.3mg/kg，拟临床人用剂量为0.2mg/kg，LD50是临床人用剂量的64倍。
4、注射用龙葵总碱一次腹腔注射给药的大鼠LD50为36.1mg/kg，其95％的置信限为32.9～39.7mg/kg，拟临床人用剂量为0.2mg/kg，LD50是临床人用剂量的180.5倍。
5、6月龄左右Beagle犬6条，体重约7kg左右，3♀3

，采用近似致死量法观察Beagle犬单次静脉滴注注射用龙葵总碱急性毒性反应，按50％递增法间隔一个剂量给药，剂量为1.2、2.7、6.0mg/kg。给药后6.0mg/kg组雄性、雌性Beagle犬均出现活动减少、精神沉郁，24小时内进食量下降，其它未见异常反应。因此估计犬单次静脉滴注注射用龙葵总碱近似致死量(ALD)约大于6.0mg/kg。
实验例14注射用龙葵总碱长期毒性实验 40只Beagle犬，雌雄各半，体重6kg左右随机分为4组，每组10只(5雌5雄)，静脉滴注注射用龙葵总碱。设0.75、1.50和3.00mg/kg/day 3个剂量组和1个对照组，分别为拟临床人日用量的3.75、7.5、15倍，给药期为26周，停药后恢复4周，连续给药2周，停药2周为一个周期。
给药后26周结果显示，0.75、1.50和3.00mg/kg组Beagle犬体征、进食量、体重、外观行为、活动、粪便形状与对照组类似，均未见明显异常反应。3.00mg/kg组谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和肌酸激酶(CK)给药6周、14周、26周逐渐升高，血清白蛋白(ALB)于给药14周、26周低于对照组，伴有γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)和甘油三脂(TG)的一过性增高，与对照组比较均有显著性或极显著性统计学差异(p＜0.01，p＜0.05)，其中ALT较AST升高幅度大(ALT/AST＞1)；1.50mg/kg组谷丙转氨酶(ALT)和肌酸激酶(CK)给药14周、26周均高于对照组，有显著性或极显著性统计学差异(p＜0.01，P＜0.05)，结合自身前后比较，提示ALT呈剂量依赖和时间-毒性反应关系，1.50、3.00mg/kg剂量下肝细胞轻度损伤；但停药4周血清生化检查结果正常，表明停药4周恢复良好。血液学、心电图、凝血因子、体温以及尿液检查各剂量组指标与对照组相似，均在正常值范围内波动，提示肾功能无损伤，蛋白质、脂肪、糖代谢基本正常。
Beagle犬静脉滴注注射用龙葵总碱0.75～3.00mg/kg 26周，3.00、1.50mg/kg剂量组除给药部位有血管内皮细胞增生等刺激性反应外，可引起肝细胞可逆性轻度损伤以及生精细胞可逆性减少，3.00mg/kg剂量组还可引起卵泡的可逆性减少，显示中毒的靶器官为肝脏、睾丸、卵巢。0.75mg/kg剂量组给药26周可见雄性Beagle犬生精细胞减少，提示该剂量下仍具有一定的生殖毒性，恢复4周给药组生精细胞恢复正常，肝细胞水肿呈良好恢复趋势，其他未见与药物有关的毒性表现。提示Beagle犬静脉滴注注射用龙葵总碱≤0.75mg/kg/day，以mg/kg计算，达到拟人临床用量(0.2mg/kg)3.75倍，在该用药条件下，除出现生精细胞可逆性减少外，用药26周是安全的。同时提示人临床应用注射用龙葵总碱应注意该药对生殖系统的毒性作用，以及注意监测肝功能指标；另考虑到用药期间出现不同程度的给药局部血管刺激性，提请人临床应用注意控制给药速度，缓慢滴注。
注射用龙葵总碱1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg三个剂量组和一个对照组，分别为拟临床人日用量的7.5、15、30倍，大鼠腹腔注射给药26周(给药期间给药二周、停药二周，恢复期4周)，检测一般情况以及相关指标 1、给药与停药期间，三个剂量组及对照组大鼠健康状况良好，大鼠精神状况、行为活动及外观体征等方面均无异常变化；体重增长正常，体重较同期对照组大鼠略低，但无显著性差异。
2、血液学指标检查结果显示，26周检测中，中、高剂量组PT延长，与对照组比较有显著性差异；其它指标与对照组比较无显著性差异。停药4周检测中，三个剂量组大鼠血液学各指标与对照组比较均无显著性差异。
3、血液生化指标检查结果显示，注射用龙葵总碱13周、26周检测中，三个剂量组ALT、AST有不同程度升高，呈剂量依赖关系，其中高剂量组与对照组比较有显著性差异；26周中、高剂量组CK浓度略升高，高剂量组与对照组比较有显著性差异；其它血液生化指标无异常，与对照组比较无显著性差异。
4、脏器系数检查结果显示，给药组肝、脾脏器系数较对照组增大，其中26周高剂量组与对照组比较有显著性差异，其它心、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、卵巢、子宫、睾丸、附睾等主要脏器指数与对照组比较无显著差异。
5、脏器组织学检查结果显示，13周、26周检查中个别大鼠出现了轻度、中度肝脏水肿，26周检查中极个别大鼠睾丸呈现轻度至重度萎缩，提示药物对肝脏、肺脏及睾丸有一定的毒副作用；肝、脾，消化管道及胰腺浆膜面纤维结缔组织增生、纤维化，说明药物经腹腔注射时对局部有刺激作用。上述这些毒副作用及腹膜刺激反应随药物剂量的降低而减轻，并且在停药后病变可逆性恢复或有恢复的倾向。其它所检脏器包括心脏、肾脏、食道、唾液腺、气管、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、大脑、小脑、脑干、颈段脊髓、胸段脊髓、腰段脊髓、脑垂体、坐骨神经、膀胱、前列腺、附睾、卵巢、子宫、乳腺、主动脉、胸骨及骨髓、淋巴结、用药局部等脏器，光学显微镜下未见受试药物引起实质细胞变性坏死，间质血管扩张、充血、炎细胞浸润等病理变化。
实验例15注射用龙葵总碱一般药理学实验 1、注射用龙葵总碱静脉注射2、4、8mg/kg三个剂量后，对小鼠自主活动次数与正常对照组比较无明显差异(p＞0.05)； 2、注射用龙葵总碱静脉注射后并立即腹腔注射戊巴比妥钠，注射用龙葵总碱4、8mg/kg可以显著缩短小鼠入睡潜伏期(P＜0.01)，对睡眠时间及入睡率无明显影响。提示注射用龙葵总碱在受试剂量范围内对戊巴比妥钠致小鼠催眠具有协同作用。
3、注射用龙葵总碱药静脉注射1、2、4mg/kg后对大鼠协调平衡运动均无明显影响。大鼠在转棒上掉落次数与正常对照组比较无明显差异(p＞0.05)。提示注射用龙葵总碱在受试剂量范围内对大鼠协调平衡运动无明显影响。
4、注射用龙葵总碱静脉滴注0.64、1.28、2.56mg/kg三个剂量后，家犬血压、心电图、呼吸与正常对照组比较无明显差异(p＞0.05)。提示该药在受试剂量范围内对家犬心血管系统及呼吸系统基本无明显影响。
综上所述，本品在受试剂量范围内除对小鼠有一定的镇静作用外，对小鼠自主活动、大鼠协调平衡运动、家犬心血管系统及呼吸系统基本无明显影响。
实验例16注射用龙葵总碱的过敏性、溶血性和局部刺激性等安全性实验研究 1、溶血性实验结果表明，注射用龙葵总碱浓度在0.05mg/ml浓度以下可供静脉注射用； 2、血管刺激性实验结果表明，注射用龙葵总碱以(0.05mg/ml)5ml静脉注射给药3次后，具有轻微血管刺激性反应，但是恢复14日后血管内皮刺激反应可以恢复； 3、肌肉刺激性实验结果表明，注射用龙葵总碱(0.05mg/ml)1ml肌肉注射3次后，不引起肌肉刺激性反应； 4、热原实验结果表明，注射用龙葵总碱2.0ml/kg(0.05mg/ml)静脉注射符合不致热注射剂的要求； 5、豚鼠主动全身过敏实验表明，注射用龙葵总碱1.0mg/kg、2.0mg/kg未引起豚鼠主动全身过敏反应； 6、大鼠被动皮肤过敏实验表明，注射用龙葵总碱1.0mg/kg，3.0mg/kg静脉注射未引发大鼠被动皮肤过敏反应； 7、异常毒性实验表明，注射用龙葵总碱以0.05mg/ml浓度静脉注射，小鼠异常毒性实验合格。


以上所述的碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁和氨水溶液；所述的酸性溶液选自醋酸、盐酸、硫酸和柠檬酸溶液；所述的柱层析洗脱用有机溶剂为甲醇、无水乙醇、正丁醇、氯仿、苯的一项或者两项或者三项以任意比例形成的混合相。
实施例2注射剂的制备 称取龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物10g，加入至10000ml注射用水中用0.1mol/l的盐酸调节PH值至6～7，搅拌30分钟，加入一定活性炭，继续搅拌半个小时，过滤，过0.22μm滤膜后，灌装即可。
实施例3冻干粉针剂的制备 称取龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物10g，加1000ml注射用水，80℃～90℃保温搅拌，完全溶解后，加入100g的甘露醇，搅拌使溶解；调节pH值至6～7，无菌精滤，定量分装于管制玻璃瓶中，冷冻干燥，即得。
实施例4输液剂的制备 称取龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物10g，用适量生理盐水溶解后，以0.1mol/l的盐酸调节PH值至6～7，搅拌30分钟，加入一定活性炭，继续搅拌半个小时，过滤，过0.22μm滤膜后，加入适量生理盐水至50L，搅拌灌装即得每50ml含龙葵提取物10mg得输液剂。
实施例5片剂的制备 称取龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物1000g，药用淀粉1000g，混合均匀，用淀粉浆制粒，干燥、整粒后，压片，每片含龙葵总碱100mg。
实施例6丸剂的制备 称取400g聚乙二醇4000，溶化，加入龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物100g，搅拌均匀，倾入保温管中，恒温，使药液在80～90℃下滴入冷却过的液体石蜡中，滴完后，将药丸倒在滤纸上吸干石蜡油，即得。
实施例7胶囊剂的制备 称取龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物1000g，药用淀粉1000g，混合均匀，装入2号胶囊，每粒含龙葵总碱100mg。
实施例8散剂的制备 称取龙葵总碱含量在50％以上的龙葵总碱提取物1000g，淀粉1000g，混合均匀，分装，即得。


本发明公开了一种抗肿瘤疗效显著、使用安全、毒副作用较小的龙葵全草与/或果实提取物及其药物制剂及制备方法。该龙葵全草与/或果实提取物中，龙葵总碱含量为50％以上。本发明的龙葵总碱提取物药物制剂含有1％～99％的龙葵总碱含量为50％～99％的龙葵总碱提取物和99％～1％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)。药效学实验结果表明龙葵总碱体外对各种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用；对Hep、S180移植性实体瘤均具有较强的抑瘤作用；对动物移植性肿瘤放、化疗具有显著的抗肿瘤增效作用，说明该提取物具有很好的抑瘤作用。药理、毒理学实验亦证明其使用较安全。本发明工艺先进，工业实用性强，成本相对较低。