专利名称：由一种位置异构体表示的稳定的干扰素α聚乙二醇缀合物的制作方法干扰素(IFN)是ー组生物活性蛋白质或糖蛋白，其由多种细胞对病毒感染应答而生产，或者因某种化学和生物物质对细胞的影响而产生(Isaacs & Lindeman, 1957 ；Pestka等人，2007)。IFN与细胞受体的缀合导致多种介导抗病毒、免疫调节和抗增殖IFN效应的细胞内蛋白的诱导(Pestka等人,2004 ；Bekisz, 2004)。不同的人类IFN基因被克隆并在细菌和动物细胞中表达，因此已产生多种重组IFN(Pestka等人，2004 ;Pestka，2007)。包含重组IFN的药物用于临床实践以治疗多种病毒、肿瘤和免疫疾病(Pestka 等人,2004 ;Chevaliez & Pawlotsky, 2009)。目前，基于干扰素的药物用于临床实践以治疗多种病毒、肿瘤和免疫疾病(Pestka等人，2004)。IFN药物最广泛地用于治疗病毒性肝炎(Chevaliez & Pawlotsky，2009)，该病是最严重的社会问题之一。如今全世界约有3. 5亿病人被こ型肝炎病毒慢性感染，并有I.7亿病人被丙型肝炎慢性感染(MarCellin，2009)。丙型肝炎在大多数情况下呈现慢性病程，其导致严重后果ー肝硬化和肝细胞癌(Modi & Liang，2008)。根据世界卫生组织报告，从1961年起慢性肝炎和肝硬化作为美国和西欧国家中的死因从第10位提高到第5位(Marce11 in,2009)。包含IFN的药物普遍用于治疗白血病和实体瘤，包括复发性黑色素瘤(Bukowski等人，2002 ；Decantris 等人，2002 ；Qintas-Cardama 等人，2006)。包含天然IFN的药物的效カ受皮下组织快速吸收、大体积分布、相对低的稳定性、短半衰期、高免疫原性和毒性的限制(Wills，1990)。因此，施用之后几小时内，观察到血浆中IFN浓度快速下降，且注射24小时后血浆中已不能检测到干扰素(Chatelut等人，1999)。干扰素浓度的快速下降导致病毒复制继续和病毒颗粒浓度升高(Lam等人，1997)。因此，需要经常注射干扰素以达到血浆中的有效治疗浓度，导致剂量依赖的副作用。因此使用IFN-α 2b的慢性丙型肝炎(CHC)的单ー疗法在12个月中仅在15_20%的病人中引起持续的病毒学应答，而在具有基因型Ib和高病毒负载的病人中完全没有观察到药物效力(McHutchinson 等人，1998)。当使用持续释放药物特别是PEG化IFN时，IFN的治疗效カ可得到增强(Manns等人，2001 ；Hadziyannis等人，2004 ；Zeuzem等人，2001)。PEG化IFN由干扰素分子与聚合物化学缀合产生，所述聚合物例如由环氧こ烷的重复残基组成的单甲氧基聚こニ醇(MPEG)，其在一端具有甲氧基，在另一端具有羟基。MPEG分子可具有不同的分子量和立体化学结构(线型或分枝型)。对于PEG化反应，MPEG末端的羟基由多种反应功能基团活化。活化的MPEG可在ー个或多个位置共价缀合蛋白质,取决于活化基团的性质和反应条件(Zalipsky& Hurris, 1997 ；Roberts 等人，2002)IFN的PEG化导致更好的药代动力学、延长的半衰期、减少的血液浓度波动、降低的免疫原性和毒性、升高的体内活性(体外活性降低)；提高的稳定性(Glue等人，2000;Reddy 等人,2001)。体外系统中的降低活性取决于PEG分子量。缀合分子量彡5000Da的小PEG分子引起体外活性的微小变化(Grace等人，2005)。包含如此质量PEG的PEG化蛋白与未修饰蛋白的药效和药代动力学性质难以区分。缀合更高分子量的PEG由于无效缀合受体导致体外生物学活性的显著降低，但在此情况下可见PEG化蛋白的药代动力学和药效性质明显提高(Delgado等人，1992),导致体内生物学活性升高(Bailon & Berthold, 1998)。PEG结构也影响生物学活性和药代动力学性质，缀合线型PEG比缀合分枝型PEG结构具有更大的分布体积(Caliceti 等人,2003)。PEG-IFN缀合物的抗病毒活性和生物学性质还取决于使用不同的活化MPEG，因为其功能基团随修饰不同蛋白质氨基酸残基的能力以及与蛋白质形成的化学键类型而变化(Roberts等人,2002)。能够与蛋白质的自由氨基缀合的活化MPEG最广泛地用于蛋白质的PEG化(琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺琥珀酸酷、trisilate、三嗪、羟基琥珀酰亚胺酷、缩醛等等)。目前已知下列PEG-IFN缀合物。已知ー种PEG-IFN-a 2a缀合物，其中线型PEG分子量为l_5000Da (美国专利5，382，657，1995)。MPEGこニ醇衍生物用于缀合，该反应在pH = 10在室温下进行O. 5-4小吋。3倍过量的PEG用于IFN的PEG化反应。在使用的条件中，PEG与IFN的结合通过不同赖氨酸(Lys-31、Lysl33> Lysl34> Lys23> Lysl31> Lysl21> Lys70> Lys83> Lys49 和Lysll2)的自由氨基的空间可进入性与碳酰胺键的形成而发生(Monkarsh等人，1997)。因此，PEG-IFN-α 2a由得到的PEG-IFN-a 2a缀合物的位置异构体的混合物组成，其中每个异构体包含单个PEG。与未修饰IFN比较，异构体的抗病毒比活性范围在6% (对于Lysl 12)到40% (对于Lysl33)。由11个异构体组成的所得缀合物的总比活性为未修饰IFN的34%。这些缀合物的体外活性也取决于PEG的分子量，范围在45% (对于2500Da PEG)到25% (对于IOOOODa PEG)。得到的缀合物的缺点如下I.使用こニ醇活化的低分子量(彡5000Da)MPEG。结果PEG-IFN缀合物与未修饰IFN的药代动力学參数仅有微小差异。因此该缀合物未进入临床试验；2.由于PEG通过不同赖氨酸的自由氨基与IFN分子缀合，形成大量具有不同比活性的位置异构体。已知由天然IFN-a 2b与分子量13 000_17000Da的线型(俄罗斯专利2311930，2004)或分枝型(俄罗斯专利2382048，2008) MPEG衍生物缀合获得的PEG-IFN-a 2b缀合物。该反应使用50-100倍摩尔过量的活化PEG在pH 9. 5进行60小时(对于线型MPEG)或者在pH 7. 5进行12小时(对于分枝型MPEG)。结果获得了 PEG-IFN缀合物，其总抗病毒活性为未修饰IFN活性的29到38%之间。没有关于缀合物稳定性、位置异构体数量及其抗病毒比活性的数据。这些缀合物的缺点如下I.使用活化MPEG的三氟こ基磺酸单甲氧基(tresylate)衍生物，其在水溶液中的半衰期少于20分钟。以前曾显示在PEG的三氟こ基磺酸酯衍生物与蛋白质的反应中，除了通过氨基的稳定酰胺键之外，还形成了不稳定的氨基磺酸酯键(Gais & Ruppert, 1995)；2.三氟こ基磺酸单甲氧基活化的PEG与蛋白质的结合通过所有空间可进入的赖氨酸的自由氨基完成(Roberts等人，2002)，其导致多种位置异构体的形成；3.在高pH值(pH = 10)长时间(60小时)进行IFN的PEG化反应可改变IFN结构；4. IFN的PEG化反应中显著过量的活化PEG (PEG/蛋白质的摩尔比为50-100/1)导致获得广品的闻成本； 已知由天然IFN- a 2b与分子量7500-35 OOODa的分枝型三嗪衍生物MPEG缀合获得的ー种PEG-IFN- a 2b缀合物(俄罗斯专利2298560，2004)，其总抗病毒活性相当于未修饰IFN活性的6. 4%。没有关于缀合物稳定性、位置异构体数量及其抗病毒比活性的数据。获得的缀合物的缺点如下I.使用活化MPEG的氯化三嗪衍生物，其能够与除了自由氨基之外的其它氨基酸ー丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸和组氨酸的官能团缀合，导致出现多种异构体，其中某些具有不稳定的键。另外，现在因为高毒性而不使用三嗪衍生物(Veronese & Pasut, 2005)；2.所述PEG-IFN缀合物的比活性低。已知由IFN- a 2a与分子量40kDa的分枝型PEG缀合获得的ー种PEG-IFN- a 2a缀合物(俄罗斯专利2180595，1997)。对于缀合，使用MPEG的ー种N-羟基琥珀酰亚胺酷衍生物，其选择性地与蛋白质的可用自由氨基反应以形成稳定的酰胺键。该反应以3 I的MPEG/蛋白质比例在pH 9、4°C进行2小吋。该反应被终止且获得的缀合物通过吸附剂Fractogel EMD CM 650 (M)纯化。纯化缀合物的产率为40-45 %。在这种情况下，获得的IFN-PEG缀合物由6种位置异构体组成，其中每种都通过赖氨酸-LyS31、LyS121、LyS 131、Lys 134、Lys 70和Lys 83的自由氨基通过稳定键与ー个PEG分子缀合(Vailon等人，2001 ;Foser等人，2003)。通过位置31、121、131和134的赖氨酸与PEG缀合的异构体占全部缀合物的94%。由6种位置异构体组成的全部缀合物的活性为天然IFN- a 2a的1_7%(Bailon等人，2001 ;Boulestin等人，2006)。尽管在体外抗病毒活性低，该缀合物与未修饰IFN相比较具有改良的药代动力学性质(Silva等人，2006，Boulestin等人，2006)，目前以商品名 “ Pegasy s ” 出售(由 “ Hoffmann-La Roche” 生产)。获得的缀合物的缺点如下I.使用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的PEG导致与所有空间可进入的氨基缀合，结果获得的缀合物是6种比活性不同的异构体的混合物。2.获得的缀合物的体外抗病毒活性低。本发明的原型是美国专利5，951，974，1999中描述的PEG-IFN-a 2b缀合物。琥珀酰亚胺碳酸酯基团活化的分子量5000到12 OOODa的线型MPEG(SC-MPEG)用于PEG化反应。根据所述方法获得了与分子量12kDa的PEG缀合的IFN，目前其以商品名“PegIntron”出售用于治疗病毒性肝炎(“Schering-Plough”,美国)。发现所述PEG-IFN- a 2b缀合物(药物“Peglntron” )由13种位置异构体组成，其中姆种都包含ー个与蛋白质分子的多个部分缀合的PEG分子(Wang等人2000 ；Grace等人,2001 ;Youngster等人,2002)。据显示PEG分子与干扰素缀合不仅通过自由氨基赖氨酸(Lys31> Lys 49、Lys 83、Lys 121、Lys 131、Lys 133、Lys 134 H Lys 164)和(Cysl),而且通过组氨酸咪唑环(His7、 His34)、酪氨酸(Tyrl29)和丝氨酸OH基团(Serl63)。单个异构体的含量在O. 8% (Tyrl29)到47% (His34)之间变化。由13种位置异构体组成的Peglntron的抗病毒活性为天然蛋白质的28%。单个异构体的比活性为天然IFN-a 2b的11%到37%之间(Youngster等人，2002)。通过His34与PEG缀合的主要异构体具有最高的比活性(天然蛋白质的37% )。IFN的自由氨基与PEG通过稳定键缀合，而在约占47%的主要异构体中，PEG与组氨酸咪唑环(His34)通过不稳定的(在水溶液中)氨基甲酸酯键缀合(Roberts等人,2002)。所述缀合物的药代动力学參数优于未修饰的IFN(Silva等人，2006)。获得的缀合物的缺点如下I.使用琥珀酰亚胺碳酸酯活化的PEG不仅缀合IFN的自由氨基，还缀合其它氨基酸的官能团。结果获得的缀合物由13种抗病毒比活性不同的位置异构体的混合物组成；2.在所述PEG-IFN缀合物的主要(His_34)异构体中形成不稳定的咪唑-碳酸酯(氨基甲酸酷)键导致的事实是“Pegintron”施用之后所述缀合物水解释放天然IFN并发挥其生物学效应。因此，药物“Pegintron”最好视为前体药物，其注射之后水解形成活性干扰素(Foster，2004)。由于所述PEG-IFN缀合物在溶液中的不稳定性，“PegintronIU-R以冻干粉形式储存。
本发明的目标是获得一种新颖的稳定的PEG化的IFN，其具有IFN-α的活性，由一种位置异构体组成，具有改良的稳定性，具有降低的免疫原性，改良的药代动力学參数，具有PEG分子量与缀合物抗病毒活性的最优组合，适合医用，以及基于所述PEG-IFN缀合物的药用组合物。通过构建一种新颖的具有干扰素α活性的功能活性PEG-IFN缀合物解决了上述问题，其中分子量10 000到40 OOODa的PEG线型分子严格通过N端半胱氨酸的α氨基通过稳定键与IFN-α分子结合，产生具有如下结构式(I)的化合物
本发明涉及制药业和医药，特别涉及新颖的PEG-干扰素衍生物，以及发现一种新颖的功能活性的高度稳定的干扰素聚乙二醇缀合物，其通式为其中n-从227到10 000的整数值，因此PEG的分子量为约10 000-40 000Da；m-≥4的整数；IFN-具有IFNα活性的天然或重组多肽本发明还涉及包含所公布的结构式(I)的缀合物的药物、包含PEG-IFN缀合物和治疗可接受的赋形剂的药用组合物，其适合治疗病毒感染和癌症，以及与原发性或继发性免疫缺陷相关的疾病。本发明涉及结构式(I)的缀合物在医药产品中的应用，涉及用于预防和/或治疗与原发性或继发性免疫缺陷相关的疾病的方法，其包括施用有效治疗剂量的结构式(I)的缀合物，并涉及含有所述药用组合物的容器。