一种制备胶体金标记的装载有pd药物的纳米脂质体的方法【技术领域】。[0002]帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。2001年的调查显示在超过50岁的人群中(无论男女)，患病率已经达到了广2%。在我国，65岁以上人群H)的患病率大约是1.7%。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质DA (dopamine，多巴胺)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与H)多巴胺能神经元的变性死亡过程。左旋多巴(L-dopa)和金刚烷胺是治疗H)的有效药物，但是L-dopa极易被氧化，易在外围组织脱羧变为无法跨越血脑屏障(BBB)的多巴胺，真正进入中枢神经系统的L-dopa极少，这使得药效降低。金刚烷胺所需剂量大，且靶向性不高、副作用明显。另外，L-dopa结构不稳定,易被氧化,对光和热敏感,在空气和光照条件下极易失去生物活性，这些特点极大地限制了它们的应用。[0003]脂质体(liposomes)是一种人工膜,它是由脂质分子构成的双分子层囊泡,可作为亲水性、疏水性或是两性物质的载体，又由于其可被生物降解，无毒性和无免疫原性，在纳米药物载体中脱颖而出，被广泛用于药物、质粒、多肽、蛋白、病毒、细菌等多种物质的载运。文献指出，对纳米脂质体进行粒径、电荷、表面特性的修饰，就可以跨越BBB，成为治疗中枢神经系统疾病的药物载体；临床使用，具有减少药物用量，提高药物吸收利用率，降低药物毒性和副作用等优势。而目前制备出的药用脂质体粒径普遍大于lOOnm，极易被巨噬细胞吞噬，不易跨越BBB，脑靶向性差。此外，人们对H)药物在细胞内的代谢途径还不甚了解，这就需要通过标记来指示药物在脑细胞内的代谢途径。胶体金是氯金酸在还原剂作用下聚合成的金颗粒，直径在fl50nm之间，颜色呈桔红色到紫红色，具有高电子密度、介电特性和催化作用。1962年，胶体金被第一次作为一种电子显微镜水平的示踪标记物，1971年胶体金被引入免疫化学。目前，胶体金已被广泛应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0004]本发明的目的是提供一种制备胶体金标记的装载有ro药物(左旋多巴或金刚烷胺)的纳米脂质体的方法，该方法所得到的脂质体粒径小、稳定性好，且有金定位标记。[0005] 本发明解决其技术问题采取的技术方案是这样的:本发明利用乙醇注入法制备胶体金标记的装载有ro药物(左旋多巴或金刚烷胺)的纳米脂质体，在不同反应条件如:原料配比、超声时间、pH值等，均得到了包封率较高、粒径小、稳定性好、具有长效缓释作用的产物。并且进入脑细胞后胶体金可以指示细胞内ro药物代谢途径。
[0006]具体的，本发明的制备方法包括如下步骤:
(1)避光条件下称取左旋多巴或金刚烷胺溶于去离子水中，在棕色容量瓶定容，制成左旋多巴或金刚烷胺ro药物母液；按照质量比111奴_脂:= ( 5:1广(10:1)，取大豆卵磷脂与胆固醇，将其溶于无水乙醇，为防止有机溶剂挥发，在烧杯口上盖一层锡箔纸，成无水乙醇溶液；分别吸取适量的ro药物母液、胶体金母液溶于PBS缓冲液中，调PH= 6.0~9.0，配制成胶体金-^)药物溶液，其中，1^药物与胶体金的质量比为1%)药物:mK#^=(10:I)~(20:1);胶体金与大豆卵磷脂的质量比为m胶体金:m大豆卵磷脂=(1:1200)~(1:2000);
(2)按上述比例取一定体积胶体金H)药物溶液于烧杯中，置于4(T60°C水浴中，然后缓缓搅拌，边搅拌边将卵磷脂和胆固醇的无水乙醇溶液匀速滴入烧杯，滴加完后，保温继续缓缓搅拌，或转移至旋转蒸发仪中，减压恒温蒸发，直至乙醇完全挥发，将脂质体悬浮液水浴超声处理5~20 min，得到淡粉色脂质体悬浮液；
(3)用去离子水分别配制蔗糖质量(克):水体积(毫升)分别为1%、3%、5%的蔗糖溶液，取等量的不同浓度的蔗糖溶液按从浓到稀的顺序依次沿离心管内壁缓缓注入离心管，加注完成后，在不同浓度的蔗糖溶液之间可看到折光率不同的界面，将少量制备好的金标记装载有H)药物的纳米脂质体悬浮液慢慢注入离心管使其平铺于蔗糖溶液上方，将离心管置于低温超速离心机中，离心 ，转速6500 rpm,时间25min,离心后,胶体金标记的装载F1D药物纳米脂质体在蔗糖溶液中分层明显，去除上清液，吸取悬浮液中层，再将其置于棕色瓶中，充N2密闭，放入冰箱4 °C保存，备用。
[00〇7]本发明的方法，步骤(1)中，m大豆卵磷脂:m麵醇=8:1，mL_dopa:m胶体金:m大豆麵脂=20:
1:2000, PBS 缓冲液 pH=7.4。
[00〇8] 本发明的方法，步骤(1)中，m大豆卵磷脂:!!％固醇=8:1, m盐酸金刚鎌:m胶体金:m大豆麵脂=
20:1:1200o
[0009]本发明的方法，步骤(2)中，水浴温度为45~55°C，水浴超声处理时间10 min。
[0010]将上述方法制得的金标记装载有H)药物的纳米脂质体用透射电镜进行观察，磷钨酸负染后，可观察到脂质体呈典型单室，双分子膜规整、均一、连续，呈圆形微球体(见图1)。经相应的水合介质稀释后，用激光散射粒度测定仪测定脂质体的粒径分布，有效粒径为78±20nm (见图2)。用ζ -电位仪出测其ζ -电位为-48.8mv (见图3)。
[0011]从图1中可以看出，采用乙醇注入法制备的金标记左旋多巴纳米脂质体形貌规整，为单室球形囊泡，粒径大小均匀，均在IOOnm以下。金标记载左旋多巴药物纳米脂质体的粒径分布采用动态光散射(DLS)技术测定，如图2所示。从图2中可以看出，纳米脂质体的粒径大小主要分布在6(T90nm之间。
[0012]ζ -电位(Zeta电位)是表征分散系稳定性的重要指标。当ζ _电位的绝对值>30mV，表明脂质体的稳定性较好。从图3可以看出，脂质体的ζ -电位为-48.8mV，表明采用乙醇注入法制备的金标记载H)药物纳米脂质体的稳定性较好。
[0013]本发明取得的有益效果如下:
利用上述方法，制得了金标记装载ro药物(左旋多巴或金刚烷胺)纳米脂质体，脂质体稳定性较好，包封率较高，形貌规整，粒径符合纳米尺度，且有金定位标记，可增加ro药物的稳定性，提高生物利用率，同时减少药物用量，降低毒性。制备方法简单、操作简便，反应易控制。产物可用于研究纳米左旋多巴(或金刚烷胺)脂质体的给药效果，改善左旋多巴(或金刚烷胺)的毒副作用，增强脑靶向性。还可作为一种探针用于研究纳米脂质体的脑代谢途径。



[0014]图1是金标记装载ro药物(左旋多巴)纳米脂质体负染电镜图(TEM照片)。
[0015]图2是金标记装载ro药物(左旋多巴)纳米脂质体粒径分布图。
[0016]图3是金标记装载ro药物(左旋多巴)纳米脂质体ζ -电位图。
[0017]以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
[0018]实施例1 一种制备胶体金标记的L-dopa纳米脂质体的方法(L-dopa包封率为62.52%，胶体金包封率为72%)
按照!!!大^^卩憐脂:i%_ = 8:1,称取大豆卵磷脂和胆固醇,溶于无水乙醇中；按照mL_dQpa:m胶体金:m大豆卵憐脂=20:1:2000,吸取相应的L-dopa母液和胶体金母液，加入一定量的PBS (pH=7.4)溶液中溶解。将胶体金L-dopa的PBS溶液加入于20mL烧杯中，置于45~55°C水浴中，边搅拌边滴加卵磷脂和胆固醇的无水乙醇溶液，滴加完后，继续恒温搅拌，至乙醇完全挥发出去。将脂质体悬浮液水浴超声处理10 min，得到淡粉色脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液缓缓注入装有蔗糖密度梯度液的离心管内，6500转/分，离心25min，然后置于棕色瓶中，充N2密封，放入冰箱4°C保存，备用。检测其包封率，结果显示L-dopa包封率为62.52%，胶体金包封率为72%。
[0019]其中，胶体金标记的L-dopa纳米脂质体包封率的计算方法如下:
(1)胶体金包封率的计算方法
选取不同浓度的胶体金溶液，用紫外分光光度计在测其523nm处特征吸收峰的吸光度值，绘制浓度(X)与吸光度(y)的标准曲线，线性关系式为y=15708.82177x+ 0.00102，R2=0.99997，线性关系良好。
[0020]用去离子水分别配制质量(克):水体积(毫升)为1%、3%、5%的蔗糖溶液，将不同浓度的蔗糖溶液各2mL按从浓到稀的顺序依次沿离心管内壁缓缓注入离心管，加注完成后，在不同浓度的蔗糖溶液之间可看到折光率不同的面界线，将制备好的胶体金标记的L-dopa纳米脂质体悬浮液ImL慢慢注入离心管使其平铺于蔗糖溶液上方。将离心管置于低温超速离心机中，以6500转/分,离心25min。离心后,可见到胶体金标记的L-dopa纳米脂质体在蔗糖溶液中分层明显，吸取中间层即为纯化好的脂质体。取少量胶体金标记的L-dopa纳米脂质体于IOmL小烧杯中，滴加适量5%曲拉通X-100溶液，充分混匀后乳浊液变澄清，取一定量的清液，用紫外-可见分光光度计测定胶体金溶液在523nm波长处的吸光度值。将此测定值带入胶体金标准曲线方程中，得到脂质体中包封的胶体金浓度。再将此浓度带入包封率计算公式，即可得到胶体金标记的L-dopa纳米脂质体中胶体金的包封率。
[0021 ] 包封率(EE%)=(被包封的胶体金的质量/包封前胶体金总质量)X 100%
(2)L-dopa包封率的计算方法配制lmg/mL的L-dopa标准溶液，用去离子水分别稀释5倍、10倍、20倍、50倍、100倍，用紫外分光光度计测其在280nm波长处的吸光度，绘制浓度(x)与吸光度(y)的标准曲线，线性关系式为y=13160.71429x+0.08179，R2=0.9993，线性关系良好。
[0022]用去离子水分别配制质量(克):水体积(毫升)为1%、3%、5%的蔗糖溶液，将不同浓度的蔗糖溶液各2mL按从浓到稀的顺序依次沿离心管内壁缓缓注入离心管，加注完成后，在不同浓度的蔗糖溶液之间可看到折光率不同的界面，将制备好的胶体金标记的L-dopa纳米脂质体悬浮液ImL慢慢注入离心管使其平铺于蔗糖溶液上方。将离心管置于低温超速离心机中，以6500转/分离心25min。离心后，可见到胶体金标记的L-dopa纳米脂质体在蔗糖溶液中分层明显，去除上清液及脂质体层后，取脂质体下层清液最上层lmL，用紫外-可见分光光度计测定L-dopa溶液在280nm波长处的吸光度值。将吸光度值带入y=13160.71429x+0.08179中，得到脂质体中未包封的L-dopa浓度。再根据下面包封率计算公式，即可得到胶体金标记的L-dopa纳米脂质体的包封率。
[0023]包封率(EE%)= 1-(脂质体中未包封的L-dopa的质量/反应时所加入的L_dopa
的质量)x 100%
实施例2 —种制备胶体金标记的盐酸金刚烷胺纳米脂质体的方法(盐酸金刚烷胺包封率为56.54%，胶体金包封率为76.78%)
按照m大豆卵磷脂:m 胆固醇=8:1，称取大?卵憐脂和胆固醇，溶于无水乙醇中；按照m盐酸金刚織:m胶体金:m大旨=20:1:1200，吸取相应的盐酸金刚烷胺母液和胶体金母液，加入一定量的PBS (pH =7.4)溶液中溶解。将胶体金盐酸金刚烷胺的PBS溶液加入于20mL烧杯中，置于45飞5°C水浴中，边搅拌边滴加卵磷脂和胆固醇的无水乙醇溶液，滴加完后，继续恒温搅拌，至乙醇完全挥发出去。将脂质体悬浮液水浴超声处理10 min,得到淡粉色脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液缓缓注入装有蔗糖密度梯度液的离心管内，6500转/分，离心25min，然后置于棕色瓶中，充N2密封，放入冰箱4°C保存，备用。检测其包封率，结果显示盐酸金刚烷胺包封率为56.54%，胶体金包封率为76.78%。
[0024]其中，胶体金标记的盐酸金刚烷胺纳米脂质体包封率的计算方法如下:
(I)胶体金包封率的计算方法
选取不同浓度的胶体金溶液，用紫外分光光度计在测其523nm处特征吸收峰的吸光度值，绘制浓度(X)与吸光度(y)的标准曲线，线性关系式为y=15708.82177x+ 0.00102，R2=0.99997，线性关系良好。
[0025]将制备好的盐酸金刚烷胺胶体金脂质体悬浊液置于截留分子量为3500的透析袋中，透析液为一定量PH的PBS缓冲液，透析一定时间，透析后即得到盐酸金刚烷胺胶体金脂质体。将制备好的盐酸金刚烷胺胶体金脂质体置于棕色瓶中，充N2密闭，置于冰箱中4°C保存备用。
[0026]取少量胶体金标记的盐酸金刚烷胺纳米脂质体于IOmL小烧杯中，滴加适量5%曲拉通X-100溶液，充分混匀后乳浊液变澄清，取一定量的清液，用紫外-可见分光光度计测定胶体金溶液在523nm波长处的吸光度值。将此测定值带入胶体金标准曲线方程中，得到脂质体中包封的胶体金浓度。再将此浓度带入包封率计算公式，即可得到胶体金标记的盐酸金刚烷胺纳米脂质体中胶体金的包封率。
[0027]包封率(EE%)=(被包封的胶体金的质量/包封前胶体金总质量)X 100%(2)盐酸金刚烷胺包封率的计算方法
本实验通过测定不同浓度经溴酚蓝染色的盐酸金刚烷胺溶液的氯仿提取液的吸光度来绘制盐酸金刚烷胺的标准曲线。具体方法如下:分别取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，
3.0mLlmg/mL盐酸金刚烷胺溶液置于分液漏斗中，分别加入0.5mL溴酚蓝溶液，均加双蒸水补至5mL，摇匀之后分别向分液漏斗中加入5mL氯仿，振摇提取10分钟，分取氯仿液于离心管中，2500转/分离心10分钟，取澄清氯仿溶液，在(409± I) nm波长处测定其吸光度，绘制浓度与吸光度的标准曲线。
[0028]纯化透析后，未包裹进脂质体的盐酸金刚烷胺经过透析袋，会慢慢进入到透析液中，此时迅速小心地取出透析袋，将纯化好的盐酸金刚烷胺胶体金脂质体吸出，装入棕色瓶充N2密封备用。吸取透析液，利用上述盐酸金刚烷胺的测定方法用紫外分光光度计测其在(409 ± I) nm处的吸光度值，将此测定值带入盐酸金刚烷胺标准曲线方程中，得到未被脂质体包封的盐酸金刚烷胺浓度。再将此浓度带入包封率计算公式，即可得到盐酸金刚烷胺胶体金脂质体中盐酸金刚烷胺的包封率。
[0029]包封率(EE%)=1-(未包封的盐酸金刚烷胺的质量/包封前盐酸金刚烷胺的总质量)X 100%O