专利名称：二肽基肽酶-4抑制剂的制作方法二肽基肽酶-4抑制剂二肽基肽酶_4(0丨？印衍(^1 P印tidase-4、以下记作“DPP-4”)是丝氨酸蛋白酶的1种，是识别从肽的N末端第2脯氨酸或丙氨酸而切断的酶。已知DPP-4在哺乳动物组织中广泛分布，特别是存在于肾脏、肝脏、肠道上皮、胎盘及血浆中。在哺乳类中的DPP-4的作用未完全明了，但被认为在神经肽的代谢、T细胞的活化、癌细胞之向内皮细胞的附着或 HIV的向细胞内的侵入等中发挥重要的作用。作为DPP-4的底物，已知与营养、代谢、免疫系统及痛觉等关联的肽。在其中也是，作为使示葡萄糖依赖性的胰岛素的分泌亢进作用的胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-Like Peptide-I 以下记作“GLP-1 ”)或胃抑制多肽(Gastric Inhibitory Polyp印tide或葡萄糖依赖性促胰岛素肽)失活的酶，DPP-4受到关注(非专利文献1)。作为GLP-I的生理作用，除了从胰腺的β细胞的葡萄糖依赖性的胰岛素的分泌作用之外，有胰高血糖素的分泌抑制作用、胰腺β细胞的保护及增殖作用、胃排泄的抑制、在肝脏的糖原合成酶促进作用等。再者，在中枢中，作用于下丘脑的饱中枢而引起摄食量的减少(非专利文献2)。也已知通过抑制DPP-4活性等来抑制GLP-I的分解，则葡萄糖浓度依赖性地促进胰岛素分泌的等GLP-I有的生理活性增强。从这些的事实期待，有DPP-4抑制作用的化合物对在1型糖尿病及2型糖尿病等中确认的糖耐受不良、餐后高血糖、空腹时高血糖或伴随其的肥胖-糖尿病性并发症等示效果。另外，由于促进胰岛素分泌，促进向肌肉的糖的摄入， 也期待辅助向运动时的肌肉的能供给的作用。DPP-4也相关于被称为神经肽Y、内吗啡肽1、内吗啡肽2、物质P的神经肽的代谢。 从而，抑制DPP-4的化合物通过抑制这些的生理活性肽的分解，也可期待作为精神分裂症、 抑郁症、不安、癫痫，应激性疾病的治疗药或镇痛药。再者DPP-4已知与各种的细胞因子类或趋化因子类的代谢，或作为免疫担当细胞的T细胞的活化、癌细胞的向内皮的附着、血液细胞的增殖等相关，所以，经这些的作用，抑制DPP-4的化合物被认为在糖尿病之外，对类风湿性关节炎、自身免疫疾病、哮喘或食物过敏等的过敏疾病、癌、癌转移、HIV感染、贫血、 血小板减少症等的预防和/或改善有用。作为DPP-4抑制剂，多数报告通过化学合成得到的化合物(专利文献1，2，3，4)。 这些之内，几种已经作为糖尿病治疗药而实用化。另一方面，作为天然物来源的DPP-4抑制齐U，已知明胶来源的肽(专利文献幻、乳酪蛋白来源的肽(专利文献6)、水解型单宁(专利文献7)、红辣椒等的植物提取物(专利文献8)等。另外，为了预防和/或治疗经DPP-4的症状，报告可使用将蛋白质通过公知的方法水解，而可实用使得到的物(专利文献9)。现有技术文献专利文献专利文献1 特表2005-500321号公报专利文献2 特表2004-535455号公报专利文献3 特表2004-536115号公报专利文献4 特开2000-327689号公报专利文献5 :W02008/066070号公报专利文献6 特开2007-394 号公报专利文献7 特开2008-28(^91号公报专利文献8 特开2007-277163号公报专利文献9 特表2008-500304号公报非专利文献非专利文献1 日药理志125，379 384(2005)非专利文献2 :Expert Opin. Investig. Drugs 1091-1102(2004)
接下来详细地说明本发明。4本发明的DPP-4抑制剂是将小豆或菜豆用微生物或者微生物产生的蛋白质分解酶处理而得到的。即本发明也涉及DPP-4抑制剂的制备方法，其特征在于，将小豆或菜豆用微生物或者微生物产生的蛋白质分解酶处理。在本发明中，认为上述豆类中的蛋白质的肽键经水解而片段化(低分子化)的产物作为DPP-4抑制剂的有效成分而相关。从而，本发明中也包括以小豆或菜豆来源的蛋白质的水解物作为有效成分的DPP-4抑制剂。在本发明中，在小豆或菜豆的处理中使用的微生物不特别限定，但优选产生蛋白质分解酶的微生物，出安全性的观点来看，优选食品制备中使用的微生物。作为那样的微生物，具体而言，可举曲霉、乳酸菌、纳豆菌等。此中特别优选曲霉。另外，在本发明中，在小豆或菜豆的处理中使用的蛋白质分解酶而言，只要是可水解肽键的微生物来源的蛋白质分解酶，就不特别限定，但优选以曲霉、乳酸菌或纳豆菌作为来源的蛋白质分解酶，更优选以曲霉作为来源的蛋白质分解酶。再者，在本发明中，将大豆用曲霉或曲霉来源的蛋白质分解酶处理而得到的产物也可作为DPP-4抑制剂使用。在本发明中使用的，或者作为使用的酶的来源的曲霉与在国内外的食品的制备相关联，只要是安全的就不特别限定，例如，可使用在酱油、酱、酒等的生产中使用的。那样的曲霉而言，除了例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、溜曲霉(Aspergillus tamari)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)等的曲霉属之外，还可举红曲霉等。在其中也是，出蛋白酶活性高的方面，优选使用酱油用曲霉，更优选米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)等，特别优选米曲霉(Aspergillus oryzae)。另外，利用使如上述一样的曲霉在豆、米、麦、麸等上附着生长的，所谓的曲、种曲也可。在本发明中使用的，或者成为使用的酶的来源的乳酸菌而言，只要是通过代谢生成乳酸的细菌类，就不特别限定，具体而言，可举乳杆菌(Lactobacillus)属、双歧杆菌(Bifidobacterium)属、肠球菌(Enterococcus)属、乳球菌(Lactococcus)属、片球菌 (Pediococcus)属、明串珠菌(Leuconostoc)属等。另外，在本发明中使用的，或者成为使用的酶的来源的纳豆菌而言，可举枯草芽孢杆菌纳豆变种(Bacillus subtilis var. natto)。在一般而言，蛋白质分解酶有水解肽的肽键的肽酶或水解蛋白质的肽键的蛋白酶等。本发明中使用的蛋白质分解酶是纯化的单一的肽酶或单一的蛋白酶也可，是含多个肽酶或蛋白酶等的组合物也可。另外，是以不损害肽酶或蛋白酶的活性的程度含其他酶的组合物也可。使用的蛋白质分解酶而言，如后述，利用市售品也可，利用将产生蛋白质分解酶的微生物破碎，或部分纯化而得到的菌体处理物或部分纯化酶也可。再者，产生蛋白质分解酶的重组菌的菌体处理物或以该重组菌作为来源的酶也可。重组菌的制备可使用通常的基因工程学方法。为了使蛋白质经分解而容易从肠道吸收，优选将蛋白质分解成更低分子的肽，从其样的观点，本发明中使用的蛋白质分解酶优选含肽酶。另外，已知蛋白质的脯氨酸残基周边是蛋白酶、肽酶一般难以作用。X-脯氨酰二肽基氨基肽酶是将氨基末端的X-脯氨酸(X是任意的氨基酸残基)用二肽单位特异性地游离的酶，有此酶活性的蛋白质分解酶被认为，容易将蛋白质更低分子化。从这样的观点开看，本发明中使用的微生物或蛋白质分解酶更优选有X-脯氨酰二肽基氨基肽酶活性。 再有，米曲霉(Aspergillus oryzae)已被报告产生X-脯氨酰二肽基氨基肽酶(H.Tachi， Phytochemistry，31(11)，3707-3709 (1992))。在本发明中使用市售品的蛋白质分解酶时，对其种类不特别限定，但作为食品添加物而可适宜地使用市售的。可举例如，々7彡廿^ A G、蛋白酶A“7 7 7 T、蛋白酶A“7 ι 乂，，SD、蛋白酶M "T 7，，G、蛋白酶M "T 7 "SD(以上、天野酶株式会社制)、义^千一A LP、^彡f 一A FP、^彡f 一A LPL (以上、新日本化学工业株式会社制)、"V午一七NP-2 ( Y夕A卜药品工业株式会社制)、才〗J工 > 夕一七ONS (工^ f匕· ^ 7 ^株式会社制)等。再有，作为上述的蛋白质分解酶，变更形状的也可在本发明中使用。形状可以是颗粒状，也可为粉末状或液状。只要可水解蛋白质，就可在本发明中使用。在上述的蛋白质分解酶之中，从X-脯氨酰二肽基氨基肽酶活性的强度的方面，也更适宜地使用々7 S廿4 A G。成本发明的DPP-4抑制剂的原料的小豆是小豆属小豆(Vigna angularis)、大豆是大豆属大豆(Glycine max)、菜豆是菜豆属菜豆(Phaseolus vulgaris)，也包括在菜豆， 花豆、大手亡、鹑豆、大福豆等的品种。另外，关于大豆，从无将基因重组大豆(GM0大豆)的蛋白质用微生物或微生物来源的蛋白酶水解之时的，对于安全性或过敏原性的充分的数据的事实来看，优选使用非基因重组(nonGMO)大豆。另外，nonGMO大豆可从DPP-4抑制活性或味等的方面也相比GMO大豆更适宜地使用。上述的本发明中使用的豆类以豆本身作为原料也可，以如纳豆、酱油、豆浆、馅或其类似品等一样以豆类作为原料而制备的组合物，或如豆腐渣或脱脂豆等一样从豆类制造其他食品之后的残渣等作为原料利用也可。上述豆类可作为直接用于制备本发明的DPP-4抑制剂的原料而使用，但进行干燥、破碎、粉碎、加热、加压、脱脂、酸处理、碱处理、榨汁、提取等的预处理也可。另外这些预处理是将2种以上组合实施也可。再者，从上述豆类材料分离蛋白质或富含蛋白质的成分之后，作为用于制备本发明的DPP-4抑制剂的原料也可。在本发明中，将上述豆类用微生物处理的方法不特别限定。可举例如，将豆类材料根据必要经上述预处理之后，在其表面生长微生物，或使微生物生长之后，通过添加水而再反应来将豆类中的蛋白质的肽键水解的方法。再者，也可举在将豆类材料或者它们的处理物悬浮和/或溶解于水等的液体的状态下使微生物生长的方法，或使微生物在液体的豆类加工物中生长的方法等。另外，在本发明中，将上述豆类用蛋白质分解酶处理的方法也不特别限定。可举将豆类材料根据必要经上述预处理之后，通过在其表面播撒蛋白质分解酶，或在将豆类材料或者它们的处理物悬浮和/或溶解于水等的液体的状态下使与蛋白质分解酶作用，从而将豆类中的蛋白质的肽键水解的方法之外，还有向液体的豆类加工物添加蛋白质分解酶的方法等。在本发明中，将通过上述方法得到的，微生物、或者，蛋白质分解酶的处理物直接作为DPP-4抑制剂利用也可，但在不失DPP-4抑制活性的范围内进行除臭、脱色等也可。另外，为了浓缩DPP-4抑制活性成分，进行提取、沉淀、过滤、超滤、柱层析等的方法、或者由这些的方法的组合的分级分离也可。 DPP-4活性可通过，例如，向人DPP-4酶，作为底物加甘氨酰_L_脯氨酸4_甲基香豆酰-7-酰胺而温育，将生成的7-氨基-4-甲基香豆素的量用荧光光度计定量来测定。在本发明中，在上述测定中，比较作为DPP-4抑制活性的评价的对象的待测样品存在时(样品)和不存在时(溶剂对照)的DPP-4活性，对于溶剂对照的DPP-4活性，将显著降低DPP-4 活性的样品评价为有“DPP-4抑制活性”。本发明的DPP-4抑制剂而言，优选将溶剂对照的 DPP-4活性作为100%之时，样品的DPP-4活性成70%以下的，更优选成60%以下的，特别优选成50%以下的。 另外，本发明的DPP-4抑制剂，不仅有DPP-4抑制活性，在优选的实施方式中，有具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的情况。α-葡萄糖苷酶活性可通过，例如向酵母来源α-葡萄糖苷酶，作为底物加蔗糖而温育，将生成的葡萄糖用市售的葡萄糖定量试剂盒定量来测定。 在本发明中，在上述测定中，比较作为α-葡萄糖苷酶抑制活性的评价的对象的待测样品存在时(样品)和不存在时(溶剂对照)的α-葡萄糖苷酶活性，对于溶剂对照的α-葡萄糖苷酶活性，将显著降低α -葡萄糖苷酶活性的样品评价为有“ α -葡萄糖苷酶抑制活性”。 本发明的DPP-4抑制剂而言，优选将溶剂对照的α-葡萄糖苷酶活性作为100%之时，共具样品的α-葡萄糖苷酶活性成90%以下的α-葡萄糖苷酶抑制活性的，更优选共具成80% 以下的α-葡萄糖苷酶抑制活性的。一般而言，已知水解蛋白质而得到肽的制法易出苦味或臭味。但是，将小豆或菜豆用微生物或者微生物产生的蛋白质分解酶处理而得到的本发明的DPP-4抑制剂、或者， 将大豆用曲霉或曲霉来源的蛋白质分解酶处理而得到的本发明的DPP-4抑制剂苦味或臭味少，特别是，在使用曲霉或曲霉来源的蛋白质分解酶时，可制备呈味性优良的DPP-4抑制剂。从而，本发明的DPP-4抑制剂特别优选可在优选呈味性优良的经口摄取用的组合物中利用。作为其中说道的经口摄取用组合物是说人或家畜、宠物等经口摄取的组合物，具体而言是说食品、药品、饲料等。本发明的DPP-4抑制剂，如上述一样作为经口摄取用组合物使用也可，作为如经肠营养剂等一样直接施用到消化管内而由消化管吸收的组合物使用也可。另外，直接作为饮食用、医药用、饲料用等利用也可，但作为含有其的组合物而在饮食用、医药用、饲料用等的用途中使用也可。本发明的DPP-4抑制剂在如上述一样的用途中使用时，不限定其形态， 例如，作为饮食用，除了一般食品之外，可作为功能性食品(保健功能食品(特定保健用食品、营养功能食品)、健康食品、营养辅助食品、运动辅助物等)等的辅助物利用。或者，作为医药用，除了医疗用药品之外，可作为OTC等可容易入手的药品或准药品、化妆品等而利用。将本发明的DPP-4抑制剂作为一般食品或功能性食品摄取时，直接摄取也可，另夕卜，作为与公知的载体或助剂等的添加剂混合的组合物，成型为胶囊剂、锭剂、颗粒剂等易服用的形态而摄取也可。另外，以营养强化的目的，添加维生素Α、C、D、E等的各种维生素类而联用也可。再者，与其他功能性食品等作为合剂也可。作为合剂的其他功能性食品而言，不特别限定，但可举血糖降低作用、脂质降低作用、抗肥胖作用等的代谢调节作用，或血压降低作用、骨质疏松预防和/或改善作用等的已知的功能性食品。再者，混合到食物材料中，可在口香糖、巧克力、糖果、果冻、饼干、咸饼干等的点心类；冰淇淋、冰点心等的冷点心类；茶、清凉饮料、营养饮料、美容饮料等的饮料；乌冬面，中华面、意大利面、方便面等的面类；鱼板、竹轮、鱼肉山芋饼等的糜制品；调味汁、蛋黄酱、沙司等的调味料；人造奶油、黄油、色拉油等的油脂类；面包、火腿、汤、甑煮食品、冷冻食品等的一般食品中使用。将本发明的DPP-4抑制剂作为医药用而使用时，其剂形不特别限定，可举例如，胶囊剂、锭剂、颗粒剂、注射剂、栓剂、贴附剂等。在制剂化中，可适宜添加药剂学容许的其他制剂原料、例如，赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、氧化防止剂、着色剂、凝集防止剂、吸收促进剂、溶解辅助剂、稳定化剂等来制备。再者，将本发明的DPP-4抑制剂作为医药用使用时，与其他抗糖尿病药、抗肥胖药、抗骨质疏松药等的药品作为合剂也可。作为其他抗糖尿病药或抗肥胖药不特别限定，但可举例如，磺酰基尿素系药、双胍系药、α -葡萄糖苷酶抑制药、胰岛素制剂、胰岛素分泌促进药、胰岛素增感药、PPAR激动药(PPARa激动药、PPAR γ激动药、PPARa+ γ激动药)、β3 肾上腺素受体激动药、醛糖还原酶抑制药、DPP-4抑制药、AMP激酶活化药、1型11 β -羟基类固醇脱氢酶(ΙΙβ-HSDl)抑制药、脂肪酶抑制药、食欲抑制药等等。抗骨质疏松药而言， 可举活性型维生素D3制剂、雌激素制剂、选择的雌激素受体调节剂、双膦酸盐制剂、维生素 Κ2制剂、钙制剂等。α-葡萄糖苷酶是在肠内将麦芽糖或蔗糖等的二糖类分解为单糖类的酶。通过抑制a -葡萄糖苷酶，可抑制多糖类及二糖类的吸收，显著地抑制餐后的过血糖，从而知对于糖尿病的预防或改善有效。但是，如从机制明了，无法确认α-葡萄糖苷酶抑制剂对由葡萄糖摄取的血糖值升高的效果。另外，α-葡萄糖苷酶抑制剂如果不在就餐直前摄取，则得不到其效果等，也有服用方法的限制。本发明的DPP-4抑制剂不仅对由葡萄糖摄取的血糖值升高有效果，还有不限服用时期的优点。再者，本发明的DPP-4抑制剂，如上所述，更优选共具有DPP-4抑制活性和a -葡萄糖苷酶抑制活性的两方，从而可期待更强的血糖值降低效^ ο综上所述，含有本发明的DPP-4抑制剂的组合物可作为用于糖尿病的预防和/或改善的组合物而利用。另外，本发明的DPP-4抑制剂也可作为血糖升高抑制剂、血糖降低药、胰岛素分泌促进剂、活性型GLP-I量增多剂、胰高血糖素分泌抑制剂、胰β细胞再生促进剂和/或向肌肉的糖的摄取促进剂使用。另外，本发明也是将上述DPP-4抑制剂施用于施用对象的，糖尿病的预防和/或改善方法。另外本发明也是将上述DPP-4抑制剂施用于施用对象的，血糖值的升高抑制方法。 糖尿病的预防也包括糖尿病的发生风险的轻减。另外，上述的情况的施用对象而言，优选糖尿病患者、糖尿病高风险者(虽然在正常域，但血糖值升高的，被指从遗传的要因或生活习惯成糖尿病的风险高的人)，但也包括健康者。
实施例以下，举实施例再具体说明本发明，但本发明不受这些的实施例限定。DPP-4抑制活性的测定法在本发明中，使用市售的测定试剂盒(BI0M0L社制DPP_4Drug Discovery kit)，根据试剂盒附带的说明书来测定DPP-4活性，通过比较其值来评价DPP-4抑制活性。接下来， 简单地示测定方法。
向测定试剂盒上附属的白色的96Half-Area板中，向空白的孔中放入50 μ L、向对照的孔中放入35 μ L、向样品的孔中放入25 μ L的缓冲液(50mM Tris, pH7. 5)。接下来，向样品孔添加10 μ L样品之后，向对照和样品的孔中添加15yL酶溶液(人DPP-4酶)，用板混合器充分混合。接下来，向全部的孔加50 μ L成DPP-4的底物的甘氨酰-L-脯氨酸4-甲基香豆酰-7-酰胺(孔中的总液量ΙΟΟμ 、于37°C温育，进行酶反应。温育在可温度调节的荧光强度测定装置(P0WERSCANHT大日本制药制)之中进行，温育开始后立即和12分钟后，以激发波长380nm、测定波长460nm进行测定，测定酶反应的结果生成的7-氨基-4-甲基香豆素。再有，样品的DPP-4活性是将对照中的DPP-4活性的值作为100%，如以下一样算
出οDPP-4 活性(% ) = {(A-B) / (C-D)} X 100式中A表示温育开始12分钟后的样品孔的荧光强度、B表示温育开始后立即的样品孔的荧光强度、C表示温育开始12分钟后的对照孔的荧光强度、D表示温育开始后立即的对照孔的荧光强度。此时呈现，DPP-4活性的值越低，抑制活性越强。实施例1豆类的曲霉处理物的制备将市售的大豆、小豆、大手亡、大福豆、紫花豆、四棱豆各自Ikg在蒸煮后粗碾碎， 根据需要炒熬割碎处理之外调节到水分量达到约50%之后，装备滤器而放入可供给无菌空气的容器中，于121°C高压蒸气灭菌30分钟。接下来，将使用曲霉(米曲霉(Aspergillus oryzae)KBN616 ；株式会社e才7々制)而得到的麸曲3g在洁净台内使不混入曲霉以外的微生物地接种到灭菌的原料中，向容器内供给着无菌空气地于31°C仅用曲霉进行发酵48 小时。其后，将在洁净台内得到的各自的发酵物75g放入灭菌的玻璃容器中，加灭菌蒸留水150mL而用硅栓封口，不添加食盐地，在不存在曲霉以外的微生物的条件下于30°C进行3天处理而得到曲霉处理液。其后，将各自的曲霉处理液于90°C加热30分钟之后，过滤而得到澄明的液。将其使用分子量筛截3000的离心式超滤装置(Millipore制7 ^ ^ ^ > YM-3)以14000g离心分级分离100分钟，将得到的滤液冷冻干燥，得到各自的豆类的曲霉处理物。将得到的豆类的曲霉处理物溶解到水中至达到lOmg/mL的浓度而作为样品(作为DPP-4活性测定时的浓度lmg/mL)，将各样品的DPP-4抑制活性用上述的方法评价。结果示于表1。表1


本发明以提供将食品作为原料得到的，在味、吸收性的方面也适宜于经口摄取用途的，DPP-4抑制剂及含有该DPP-4抑制剂的预防和/或改善糖尿病的组合物作为课题。本发明提供DPP-4抑制剂，其特征在于，将小豆或菜豆用微生物或者微生物产生的蛋白质分解酶处理而得到。在其中也是通过将小豆用曲或曲霉来源的蛋白质水解酶水解而将小豆中的蛋白质片段化而得到适宜的DPP-4抑制剂。