专利名称：毕赤酵母制备人白细胞介素29成熟肽的方法人白细胞介素^(interleukin 29，IL-29)是近年发现的一种新的细胞因子， 其结构和功能与I型干扰素(interferon, IFN)相似，因此又称为IFN- λ 1 (Sheppard P， Kindsvogel W, Xu W, et al. (2003)IL-28, IL_29and their class II cytokine receptor IL-28R. Nature Immunol. 4(1) :63-68 ；Kotenko SV,Gallagber G,Baurin W,et al. (2003) IFN-Xs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature Immunol.4 (1) :69-77)。人IL-四基因定位于19号染色体长臂(19ql3. 13)，包含5个外显子，其基因结构与IL-IO家族成员的基因结构相似，但与I型干扰素的基因结构(只含一个外显子)有明显差异(Onoguchi K, Yoneyama M, Takemura A, et al. (2007) Viral infections activate types I and IIIinterferon genes through a common mechanism. J Biol Chem. 282 (10) 7576-7581)。IL-四的mRNA全长856bp，其开放读码框为603bp，编码的蛋白质肽链含200 个氨基酸残基，肽链氨基端的19个氨基酸残基构成信号肽序列，因此，人IL49的成熟肽是含181个氨基酸残基的多肽链。IL-四基因表达盒中启动子的结构与I型干扰素的非常相似，都包含与β-干扰素启动子结合蛋白3、干扰素启动子结合蛋白7的结合位点以及至少有一个功能性的核因子κB结合位点。人IL-四通过与细胞膜上的受体复合物结合，起始信号的转导和发挥生物学作用。IL-四和IL-观共用一个由IL48R1和IL-10R2组成的异二聚体受体复合物，其中 IL-28R1为结合亚基，IL-10R2为辅助亚基。IL48R1是IL-四和IL-28的共用受体中所特有的结合亚基，对IL-29的细胞应答具有特异性，辅助亚基IL-10R2也是I型干扰素、 IL-10、IL-22和IL-26的受体组成部分，其在造血和非造血细胞中普遍表达，对IL-29的细胞应答无特异性(Witte K, Gruetz G, Volk HD, et al. (2009)Despite IFN-Iambda receptor expression, blood immune cells, but not keratinocytes or melanocytes, have an impaired response to type III interferons implications for therapeutic applications of these cytokines. Genes Immun. 10(8) :702-714)。人IL-29与I型干扰素共享相同的Jak-STAT信号传导途径，激活相同的 Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcription) fW一组共同的基因表达。IL-四首先与其受体复合物形成II^8R1-IL29-IL10R2三元络合物，然后通过定位在细胞内的两条受体链转导信号，启动信号级联反应，使STAT1、STAT2、 STAT3、STAT4和STAT5的酪氨酸残基磷酸化，然后促使ISGF3 (干扰素刺激基因幻进入细胞核与ISRE(干扰素刺激应答元件)相互作用，从而产生效应(Zhou Ζ, Hamming 0J, Ank N, et al. (2007)Type III interferon (IFN) induces a type I IFN-Iike responsein a restricted subset of cells through signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases. J Virol. 81 (14) 7749-7758)。因此，IL-四表现出一些与I型干扰素相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性。研究发现，人体表达IL48R1的细胞谱系较少，人体不同器官的IL48R1表达水平有明显差异。在胃肠道、呼吸系统、心脏和一些腺体细胞的IL-28R1高水平表达，而大脑细胞表达水平最低(Katrin W,Ellen ff,Robert S，et al. (2010) IL-28A，IL-28B，and IL-29 Promising cytokines with type I interferon-like properties. Cytokine & Growth Factor Reviews. 21 (4) :237-251)。这些发现提示IL-29的生物学作用具有较独特的细胞靶向性，即IL-29作用的靶细胞呈局限性，明显区别于I型干扰素作用的靶细胞。人IL-四具有与I型干扰素相似的抗病毒和抗肿瘤活性，而其受体分布的组织差异和较独特的细胞靶向性，可避免IL19对多种细胞产生广泛的生物学效应，从而有效的降低毒性作用。这些性质提示IL19作为药物的副作用可能比I型干扰素的更小，由此显现出IL-四潜在的临床应用前景，有希望研制开发出临床疗效高而副作用比I型干扰素更小的新一代干扰素药物。
本发明的目的是提供一种利用酵母表达重组人IL-29(hIL_29)成熟肽的制备方法及其酵母工程菌。本发明提供的技术方案如下(1)本发明的第一方面，提供一种hIL-四成熟肽的重组真核表达载体，该载体是将pPIC9KM (源于hvitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为 201110410391.0)与本发明所述的hIL-四成熟肽编码基因(SEQ ID No :1)经过重组而获得，该重组真核表达载体为pPIC9KM-hIL49如图1所示；而且，本发明将pPIC9KM的α因子中的限制性内切酶》ιοΙ识别位点CTC GAG与蛋白酶Kex2的识别位点GAG AAA AGA (编码产物为Glu-Lys-Arg)，通过PCR方法引入hIL-四成熟肽编码基因(SEQ ID No :1)的氨基端，使该重组真核表达载体表达的hIL-四产物为天然型hIL-四成熟肽(SEQ ID No:2)，其肽链不会因引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。(2)本发明的第二方面，提供一种表达人IL-四成熟肽的重组酵母工程菌GS115/ hIL-29，该工程菌是毕赤酵母GS115anvitrogen公司)被本发明所述的重组真核表达载体 pPIC9KM-hIL-29转化而获得，而且pPIC9KM中的信号肽基因序列与hIL-四成熟肽的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-四成熟肽至培养液中。(3)本发明的第三方面，提供一种制备hIL-四的方法，该方法包括以下步骤a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加0.5 (ν/ν)的甲醇为诱导剂， 诱导重组酵母工程菌表达hIL-四成熟肽；b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；c)除盐后的培养上清用强阳离子交换层析柱分离纯化培养液中的hIL-四成熟4肽，收集含有hIL-四成熟肽的洗脱液；d)将含有hIL-四成熟肽的洗脱液用分子筛层析方法进一步纯化；e)用SDS-PAGE和^festern blotting方法分析鉴定纯化的hIL-四成熟肽。图1为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL_29的构建图谱图2为人IL-四成熟肽编码基因的PCR扩增结果图3为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL_29的双酶切鉴定结果
图4为纯化的重组人IL-四成熟肽的SDS-PAGE检测结果

取质粒pUCm-四和载体pPIC9KM(源于hvitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为201110410391.0)分别用限制性内切酶Β ο I和Not I进行双酶切， 回收约560bp的目的基因片段和载体pPIC9KM的大片段，用T4DNA连接酶(BBI公司)于 16°C水浴连接16h，将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含卡那霉素的LB培养板，37°C培养过夜，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组真核表达质粒并命名为pPIC9KM-hIL-29 ；用Xho I和NotI对重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL49进行双酶切鉴定，同时进行测序鉴定，双酶切鉴定结果如图3所示，酶切出的大片段和小片段分别与载体 PPIC9K"和目的基因的大小相符合，测序结果证实pPIC9KM-hIL-29中的人IL-四成熟肽编码基因序列与pUCm-四中的完全一致。实施例三、重组真核表达质粒转化酵母GS115及其高拷贝重组工程菌的筛选提取经测序鉴定的pPIC9KM-hIL49用限制性内切酶Ml I酶切后，用0. 7%的琼脂糖凝胶电泳分离并回收线性化的pPIC9KM-hIL-29 ；将线性化的pPIC9KM_hIL_29与酵母 GS115感受态细胞混合后，按照毕赤酵母表达手册anvitrogen公司)的方法进行电转化。将转化产物涂布于不含His的MD培养板，30°C培养2 3天，挑选MD平板上生长旺盛的优势菌落接种于含0. 5mg/mL G418的YPD平板，30°C培养2 3天，挑选生长旺盛的优势菌落接种于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培养2 3天，如此重复培养并依次增加 G418浓度至％ig/mL，从含％ig/mL G418的YPD平板筛选得到高拷贝整合的毕赤酵母重组工程菌 GS115/hIL-29。实施例四、人IL-四成熟肽的诱导表达、纯化及分析将重组工程菌GS115/hIL49接种BMGY培养基，于30°C、220 250rpm/min条件下振荡培养至菌液0D600为1 3时，转换为BMMY培养基继续培养，每隔24h加入终浓度为的甲醇诱导表达，连续培养96h，离心收集培养上清，先用SDS-PAGE检测培养上清中hIL-四成熟肽的表达情况，然后用羊抗人IL-29多克隆抗体(R&D公司)进行Western blotting鉴定表达的hIL-四成熟肽。将培养上清先用截流分子量为IOkDa的超滤膜浓缩， 再用SP-S^harose Fast Flow离子交换层析和kphadex G_75凝胶过滤层析纯化，纯化产物经SDS-PAGE检测和Wfestern blotting鉴定，SDS-PAGE结果显示纯化的重组hIL-四成熟肽为单一蛋白条带，其分子量为20kDa，如图4所示；Western blotting结果显示单一反应条带。


本发明提供了一种人白细胞介素29(hIL-29)成熟肽的制备方法及表达hIL-29成熟肽的毕赤酵母工程菌。本发明的具体制备方法包括以下步骤1)人工合成引物；2)从健康人外周血单个核细胞经反转录PCR得到hIL-29成熟肽的编码基因；3)构建含有hIL-29成熟肽编码基因的重组真核表达载体，融合于毕赤酵母表达调控元件获得重组毕赤酵母工程菌；4)培养重组毕赤酵母工程菌，于培养液添加甲醇诱导毕赤酵母工程菌表达hIL-29成熟肽；5)采用离子交换层析和分子筛层析从培养液上清纯化hIL-29成熟肽。本发明构建的重组毕赤酵母工程菌可进行高密度培养并且分泌型表达天然型hIL-29成熟肽，适用于工业化制备人白细胞介素29。