专利名称：一种西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法一种西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法西瓜枯萎病由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染所致，是西瓜上为害最严重的病害，在世界各西瓜产区均造成较大损失。植株一旦发病即很难治愈，是严重制约西瓜生产的病害之一。绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是已被广泛应用的报告基因，1962年在发光水母中发现。由于其本身是一种发光蛋白，具有稳定、直观、操作方便的荧光性质和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接进行定位检测和观察等优点，克服了分子生物学研究中传统报告基因的不足。将绿色荧光蛋白基因转化西瓜枯萎菌，所获得的转化子接种西瓜，研究其侵染过程，对于香蕉枯萎菌的防治将会提供一定的理论基础。原生质体转化方法是GFP转化的手段之一，相比基因枪法和电激法，其不受昂贵仪器使用的限制，仅需试验室的一些常规仪器。但原生质体的制备是细胞融合和遗传转化的关键，高质量的原生质体可以提高转化的成功率与效率。不同属、种，甚至不同专化型菌株由于菌体自身存在差异，在新鲜菌丝的培养方法及裂解酶的选择上会存在差异。`
步骤三、取5 μ g质粒DNA及200 μ I原生质体在离心管中混匀,之后将该离心管于室温下静置20min，接着加入1-1.25ml 40% PTC至该离心管中，轻轻混匀后于室温下再放置20min以获得反应液，接着将往该反应液中加入IOOmL冷却至50°C的含0.9%琼脂再生培养基混匀后，倒于含0.9%琼脂的再生培养基上，28°C倒置培养3-5d后获得转化子，连续转接4次至含150ug/ml潮霉素B的PDA上以筛选获得性状稳定的转化子，即获得用于绿色荧光蛋白标记的西瓜枯萎病病原菌原生质体。本发明一种西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法的有益效果在于:确定了原生质体形成的适宜条件，为西瓜枯萎病菌原生质体转化、基因表达等遗传操作奠定基础，且大大缩短了研究所需时间，提高了转化效率。 实施例一1、菌源的准备将鉴定的西瓜枯萎病病原菌(137)接种到PSA培养基上培养7天，备用。二、试验试剂采用购自广东省微生物研究所的溶壁酶(Lywallzyme)制备10mg/mL溶壁酶酶液，具体地，称取所需的溶壁酶酶量，用0.8mol/L的渗透压稳定剂将其溶解，该渗透压稳定剂选用 NaCl、KCl、鹿糖(sucrose)和山梨醇(sorbitol)4 种。三、西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备过程步骤一、将在PSA培养基中培养7天所获得的分生孢子接种到150mLPDB培养基上；并将该PDB培养基置于恒温摇床上进行振荡培养24h，温度设定为28°C，转速180r/min,振荡培养结束后将培养液经4层纱布过滤获得菌丝，且将获得的菌丝采用0.8mol/LNaCl进行充分洗涤；步骤二、在50mL已灭菌的三角瓶中加入5mL预先配制好的10mg/mL溶壁酶酶液、250mg步骤一中洗涤后的菌丝，接着将该三角瓶置于恒温摇床上进行振荡培养3.5温度设定为30°C，转速80r/min ;振荡培养结束后采用3层擦镜纸对三角瓶内的溶液进行过滤，将过滤获得的滤液置于灭菌过的15mL尖底离心管中进行转速4000rpm、温度4°C、为时IOmin的初次离心以收集孢子，然后弃上清将孢子用Iml STC溶解之后再转入灭菌过的15mL尖底离心管中进行二次离心以获得2 X IO7个/mL的孢子液，二次离心的转速为3500rpm、温度为常温、时间为IOmin ；步骤三、取5 μ g质粒DNA及200 μ I原生质体在离心管中混匀，之后将该离心管于室温下静置20min，接着加入Iml 40% PTC至该离心管中，轻轻混匀后于室温下再放置20min以获得反应液，接着将往该反应液中加入IOOmL冷却至50°C的含0.9%琼脂再生培养基混匀后，倒于含0.9%琼脂的再生培养基上，28°C倒置培养5d后获得转化子，连续转接4次至含150ug/ml潮霉素B的PDA上以筛选获得性状稳定的转化子，即获得用于绿色荧光蛋白标记的西瓜枯萎病病原菌原生质体。为了简化说明并便于比较本发明各实施例的相异处，在以下另外两个实施例的说明中，仅针对相异处进行说明，而不再对相同处作重复赘述。实施例二本实施例与实施例一相比的不同点在于:在西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备过程步骤二中振荡培养的时间为4h ;步骤二中二次离心获得的是3.5X IO7个/mL的孢子液；步骤三中加入离心管的40% PTC的量为1.25ml ;步骤三中倒于含9%琼脂的再生培养基上培养的时间为3d。实施例三本实施例与实施例一相比的不同点在于:在西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备过程步骤二中振荡培养的时间为3.5h，步骤二中二次离心获得的是5X IO7个/mL的孢子液；步骤三中加入离心管的40% PTC的量为1.13ml ;步骤三中倒于含9%琼脂的再生培养基上培养的时间为4d。综上，本发明确定了原生质体形成的适宜条件，为西瓜枯萎病菌原生质体转化、基因表达等遗传操作奠定基 础，且大大缩短了研究所需时间，提高了转化效率。
本发明西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法，将在PSA培养基培养获得的分生孢子接种到150mL PDB培养基上进行振荡培养，接着将培养液过滤，把过滤获得的菌丝采用0.8mol/L NaCl进行充分洗涤；之后将洗涤后的菌丝采用溶壁酶酶液溶解后依次经初次离心、二次离心以获得2-5×107个/mL的孢子液，然后将孢子液经过系列操作以获得性状稳定的转化子，即获得用于绿色荧光蛋白标记的西瓜枯萎病病原菌原生质体。本发明的优点在于为西瓜枯萎病菌原生质体转化、基因表达等遗传操作奠定基础，且大大缩短了研究所需时间，提高了转化效率。

2013年6月26日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日 公开号201110439701.