专利名称：脑衰蛋白反应媒介蛋白－1的制作方法本申请案请求美国专利申请序号第60/301,075号，于2001年6月26日申请的优先权，为了所有目的，其完整内容系作为参考资料并入。与60-66kDa蛋白相关的CRMP族的五成员(CRMP-1，CRMP-2，CRMP-3，CRMP-4，以及CRMP-5)，分别已被不同实验室因不同目的而克隆出来。CRMP族蛋白之一特征功能为神经元轴突的排斥引导。CRMPs在此过程中的功能角色已被研究出来(Quinn et al.(1999)JNeurobiol 41158-64)。上述CRMPs的五成员具有50％-70％氨基酸序列相似性(Hamajima et al.(1996)Gene 180157-63)，且其曾被提出会经由相互结合形成异源四聚物(Wang & Stittmatter(1997)JNeurochem 692261-9)。然而，每一CRMPs成员在神经系统发生时皆显示独特的表现型态，且会应答神经生长因子诱导的神经元分化(Byk et al.(1998)Eur J Biochem 25414-24)。CRMP-2被发现与艾兹海默症患者的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)有关(Gu et al.(2000)Biochemistry 394267-75)。CRMP-3与CRMP-5被认定为小细胞肺癌伴有副新生神经症状的忠者的自体抗体(Yu et al.(2001)AnnNeurol 49146-54；以及Honnorat et al.(1999)Eur J Neurosci 114226-32)。
本发明是基于脑衰蛋白反应媒介蛋白-1(CRMP-1)至少与某些肿瘤转移有关的发现。一CRMP-1编码区之核苷酸序列例示如下5 ATGTCGTACC AGGGCAAGAA GAGCATCCCG CACATCACGA GTGACCGACT CCTCATCAAA60GGTGGACGGA TCATCAACGA TGACCAATCC CTTTATGCTG ACGTCTACCT GGAGGATGGA120CTTATCAAAC AAATAGGAGA GAACTTAATC GTTCCTGGTG GAGTGAAGAC CATTGAAGCC10 180AACGGGCGGA TGGTTATTCC CGGAGGTATT GATGTCAACA CGTACCTGCA GAAGCCCTCC240CAGGGGATGA CTGCGGCTGA TGACTTCTTC CAAGGGACCA GGGCGGCACT GGTGGGCGGG30015ACCACGATGA TCATTGACCA TGTTGTTCCT GAACCTGGGT CCAGCCTACT GACCTCTTTC360GAGAAGTGGC ACGAAGCAGC TGACACCAAA TCCTGCTGTG ATTACTCCCT CCACGTGGAC420ATCACAAGCT GGTACGATGG CGTTCGGGAG GAGCTGGAGG TGCTGGTGCA GGACAAAGGC20 480GTCAATTCCT TCCAAGTCTA CATGGCCTAT AAGGATGTCT ACCAAATGTC CGACAGCCAG540CTCTATGAAG CCTTTACCTT CCTTAAGGGC CTGGGAGCTG TGATCTTGGT CCATGCAGAA60025AATGGAGATT TGATAGCTCA GGAACAAAAG CGGATCCTGG AGATGGGCAT CACGGGTCCC660GAGGGCCATG CCCTGAGCAG ACCTGAAGAG CTGGAGGCCG AGGCGGTGTT CCGGGCCATC72030 780 ACCATTGCGG GCCGGATCAA CTGCCCTGTG TACATCACCA AGGTCATGAG CAAGAGTGCAGCCGACATCA TCGCTCTGGC CAGGAAGAAA GGGCCCCTAG TTTTTGGAGA GCCCATTGCC840GCCAGCCTGG GGACCGATGG CACCCATTAC TGGAGCAAGA ACTGGGCCAA GGCTGCGGCG90035TTCGTGACTT CCCCTCCCCT GAGCCCGGAC CCTACCACGC CCGACTACTT GACCTCCCTA960CTGGCCTGTG GGGACTTGCA GGTCACAGGC AGCGGCCACT GTCCCTACAG CACTGCCCAG102040 1080 AAGGCGGTGG GCAAGGACAA CTTTACCCTG ATCCCCGAGG GTGTCAACGG GATAGAGGAGCGGATGACCG TCGTCTGGGA CAAGGCGGTG GCTACTGGCA AAATGGATGA GAACCAGTTT1140GTCGCTGTCA CCAGCACCAA TGCAGCCAAG ATCTTTAACC TGTACCCAAG GAAAGGGCGG120045ATTGCCGTGG GCTCGGATGC CGACGTGGTC ATCTGGGACC CCGACAAGTT GAAGACCATA12601260 5 GTCAACAAGG GCATGGGCCG CTTCATTCCG CGGAAGGCGT TCCCGGAGCA CCTGTACCAG1440CGCGTCAAAA TCAGGAATAA GGTTTTTGGA TTGCAAGGGG TTTCCAGGGG CATGTATGAC1500GGTCCTGTGT ACGAGGTACC AGCTACACCC AAATATGCAA CTCCCGCTCC TTCAGCCAAA10 1560TCTTCGCCTT CTAAACACCA GCCCCCACCC ATCAGAAACC TCCACCAGTC CAACTTCAGC1620TTATCAGGTG CCCAGATAGA TGACAACAAT CCCAGGCGCA CCGGCCACCG CATCGTGGCG168015CCCCCTGGTG GCCGCTCCAA CATCACCAGC CTCGGTTGA (SEQ ID NO1) 1719CRMP-1的氨基酸序列如下MSYQGKKSIPHITSDRLLIKGGRIINDDQSLYADVYLEDGLIKQIGENLIVPGGVKTIEANGRMVIPGGIDVNTYLQKPSQGMTAADDFFQGTRAALVGGTTMIIDHVVPEPGSSLLTSFEKWHEAADTKSCCDYSLHVDITSWYDGVREELEVLVQDKG20 VNSFQVYMAYKDVYQMSDSQLYEAFTFLKGLGAVILVHAENGDLIAQEQKRILEMGITGPEGHALSRPEELEAEAVFRAITIAGRINCPVYITKVMSKSAADIIALARKKGPLVFGEPIAASLGTDGTHYWSKNWAKAAAFVTSPPLSPDPTTPDYLTSLLACGDLQVTGSGHCPYSTAQKAVGKDNFTLIPEGVNGIEERMTVVWDKAVATGKMDENQFVAVTSTNAAKIFNLYPRKGRIAVGSDADVVIWDPDKLKTITAKSHKSAVEYNIF25 EGMECHGSPLVVISQGKIVFEDGNINVNKGMGRFIPRKAFPEHLYQRVKIRNKVFGLQGVSRGMYDGPVYEVPATPKYATPAPSAKSSPSKHQPPPIRNLHQSNFSLSGAQIDDNNPRRTGHRIVAPPGGRSNITSLG(SEQ ID NO2). CRMP-1亦曾记载于SWISS-PROT登记Q14194号，基因银行基因位D78012，以及基因银行基因位BAA11190。其亦被认为是二氢嘧啶酶相关蛋白-1(dihydropyrimidinase related protein-1，DRP-1)。本发明的一方面是提供一治疗性多肽给予一个体的方法。该方法包括鉴定一个体是需要治疗以预防，减轻，或休止一肿瘤转移；提供一细胞，该细胞包含一外源核酸，其编码一具有氨基酸序列编号SEQ ID NO2的多肽或其功能性片段；允许人类细胞表达一多肽，以及施予该多肽至一个体。该细胞可以为人类细胞，例如人纤维母细胞。该个体可以为人或实验动物。此处所谓「功能性片段」代表一核酸或一多肽，具有至少一编码序列编号SEQ ID NO2的多肽活性，可以抑制肿瘤转移。片段的功能性可由表达该片段于CL1-5肺癌细胞并评估转染的细胞于体外重建基底膜侵入性试验中侵入基底膜的能力而测定。一功能性片段将会抑制CL1-5肺癌细胞的侵入表现型。CRMP-1核酸具有选自下述群组的序列(1)包含与SEQ ID NO1的核苷酸序列至少80％同源的核酸；(2)包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的至少150个核苷酸的片段的核酸；(3)编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核酸；以及(4)编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的片段的核酸，其中该片段包含至少50个SEQ ID NO2的氨基酸。CRMP-1多肽具有选自下述群组的序列(1)包含与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少80％同源的序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的片段，其中该片段包含至少50个SEQ IDNO2的氨基酸；(3)由含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸编码的多肽；以及(4)由与SEQ ID NO1的核苷酸序列至少80％同源的核酸编码的多肽。在某些实施例中，治疗性多肽可以为抗体或其抗原结合片段，其与一CEMP-1多肽反应或特异性结合。
本发明的另一方面为用以治疗一个体肿瘤转移的第一方法。该方法包括确定一个体需要治疗肿瘤转移；提供一细胞，该细胞包含一编码一具有SEQ IDNO2的氨基酸序列的多肽或其功能性片段的外源核酸；以及允许该细胞于一个体的体内表达一多肽，而治疗该个体的肿瘤转移。
本发明的另一相关方面亦为一用以治疗一个体肿瘤转移的第二方法。该方法包括确定一个体需要治疗肿瘤转移；以及送入一细胞至该个体，该细胞包含一编码一具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或其功能性片段的外源核酸，以及该细胞适于表达足够量的该多肽以减轻肿瘤转移的症状，而治疗该个体的肿瘤转移。
本发明的又一方面为一诊断一个体的肿瘤侵入潜在性或转移的方法。该方法包含提供一个体的样品；测定样品中CRMP-1的表达程度；比较样品表达与一参考表达值；以及分类样品表达低于该参考表达值的个体为具有肿瘤侵入潜在性或转移。样品表达或参考表达分别是评估大量的(1)由一CRMP-1核酸转录的mRNA；或(2)一CRMP-1的多肽。该CRMP-1的多肽可被检测，例如采用抗体，如Y21抗体。本方法也可用于(1)监控一个体肿瘤治疗过程；或(2)监控一个体的肿瘤转移治疗情形。
参考表达值可以随意或与一参考样品或一参考状态相关。参考样品可以为一个或多个(1)正常个体的样品；(2)体外细胞的样品，如一肿瘤细胞株，如一肺腺癌株，如此处所述的细胞株；(3)由具有转移症状并正进行治疗的个体所得的样品；以及(4)被评估的个体的样品，例如该个体的早期样品或正常样品。在监控一疗程时，本法更包含比较样品CRMP-1多肽水平或CRMP-1核酸表达水平与该个体治疗前或疾病发生前的样品水平。在某些实施例中，个体CRMP-1的多肽水平或CRMP-1的核酸表达水平是在治疗过程中的一间隔期(如规律的间隔期)决定。
CRMP-1基因产物或mRNA的表达水平可以单纯地由至少10、50、100、或1000其它基因或基因产物的表达水平测定。例如美国专利申请号第60/300,991号，2001年6月26日申请，即描述了其它基因之表达水平对于监控非常有用。
本发明的另一方面为一种鉴定试验化合物有用于预防或治疗肿瘤转移的方法。本方法包含以下步骤将一细胞接触一试验化合物；以及测定是否试验化合物调整了细胞中CRMP-1核酸或CRMP-1多肽的表达。该试验化合物可以作为CRMP-1多肽之拮抗物。此处「拮抗物」是指一分子，当其与CRMP-1之多肽结合时，会增加或延长CRMP-1作用的过程。
试验化合物可以为一巨分子或小分子，例如一分子具有分子量小于每摩尔约10,000克，一有机或无机化合物具有分子量小于每摩尔约5,000克，一有机或无机化合物具有分子量小于每摩尔约1,000克，一有机或无机化合物具有分子量小于每摩尔约500克。巨分子包含例如，多肽，蛋白质复合物，或核酸(如DNA，RNA，或肽核酸)。小分子包含例如，肽，肽类似物(如S类肽)，核酸，核酸类似物，寡核苷酸，寡核苷酸类似物，核苷酸，核苷酸类似物，有机或无机化合物(如异源有机或有机金属化合物)。
本发明的特征也为一治疗肿瘤转移的药学组合物。该组合物包含一有效剂量的一药剂以及一药学上可接受的载体。该药剂可以为一CRMP-1之多肽，一CRMP-1的核酸，或一可调控CRMP-1表达水平的试验化合物，其中CRMP-1的表达是评估大量的(1)由CRMP-1核酸转录的nRNA；或(2)CRMP-1的多肽。该药学组合物可包含一传送剂，例如脂质粒或病毒载体。该组合物或传送剂可以接合于一肿瘤靶部位(tumor targeting moiety)，例如一抗肿瘤特异抗原的抗体。本发的特征也为一抗体，结合于具有SEQ ID NO2的多肽。例如，该抗体可以为此处所述的抗体，或其功能性片段，如一抗原结合片段。
本发明的另一方面为一基因构建体，其包含一编码一标记蛋白质之标记基因。该标记基因可操作性地与一CRMP-1调控序列连结，如CRMP-1启动子。在一实施例中，该标记基因是框架内(in-frame)融合于至少CRMP-1编码序列的一段。该构建体可以用于一种评估CRMP-1基因表达的方法。该方法包含将一含有该基因构建体的细胞接触一试验化合物以及评估大量及/或不存在该标记蛋白。本发明特征也为一宿主细胞，其包含该基因构建体，例如一哺乳类细胞，一肺癌细胞。
本发明的范畴亦包含采用前述药剂进行制造一治疗肿瘤转移的药物。
本发明的一个或多个实施例的详细内容将说明于下。本发明的其它特征，目的，以及优点经由本说明书及申请专利范围将更为显著。
CRMP-1的多肽，核酸，以及CRMP-1特异性抗体CRMP-1的多肽可用于多种方法。例如，CRMP-1的多肽可用于筛检CRMP-1多肽的底物，筛检调控CRMP-1活性的化合物，以及治疗特征为减少CRMP-1活性的疾病，例如至少某些肿瘤转移，如肺癌。
CRMP-1的多肽可以由细胞或组织来源采用标准蛋白质纯化技术分离，例如与重组DNA表达技术组合。CRMP-1的多肽可以表达于一异源系统，例如培养细胞或转基因动物。在异源系统表达时会造成实质上与天然细胞同样的翻译后修饰。CRMP-1多肽的序列可以不同于序列编号SEQ ID NO2的序列，例如至少一个但少于15，10，或5个氨基酸残基的不同。或者，亦不同于SEQID NO2的序列的至少一个残基但少于20％，15％，10％或5％之残基。该不同处可以为非重要残基或保守置换。
保守氨基酸置换指具有相似侧链的残基的互换。例如，一具有脂肪族侧链氨基酸群为甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，以及异亮氨酸；一具有脂肪族-氢氧基侧链氨基酸群为丝氨酸以及苏氨酸；一具有含酰胺侧链氨基酸群为天门冬氨酸以及谷氨酰胺；一具有芳香族侧链氨基酸群为苯丙氨酸，酪氨酸，以及色氨酸；一具有碱性侧链氨基酸群为赖氨酸，精氨酸，以及组氨酸；一具有酸性侧链氨基酸群为天门冬酰胺，谷氨酸，及组氨酸；一具有含硫侧链之氨基酸群为半胱氨酸与甲硫氨酸。依所需，氨基酸在同群者可以互换。某些附加保守性氨基酸取代基团为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；赖氨酸-精氨酸；丙氨酸-缬氨酸；以及天门冬氨酸-谷氨酰胺。
CRMP-1核酸可用于，例如表达CRMP-1多肽(例如于宿主细胞或生物体之细胞)以检测CRMP-1 mRNAs(如于一生物样品)或CRMP-1基因的基因学上改变，以及调控CRMP-1多肽活性。CRMP-1核酸可以包含一片段以作为探针或引物而检测或扩增CRMP-1核酸或CRMP-1片段编码CRMP-1多肽的一部分，例如一CRMP-1多肽的免疫原或生物活性部分。该片段可包含一序列对应于一区(domain)，一区域(region)，或一功能位置。CRMP-1探针与引物也可提供。传统上探针/引物是分离或纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸通常包含一核苷酸序列可于严瑾条件下与正义或反义的SEQ ID NO1的序列有至少7，12，或15，或约20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，或75个连续核苷酸杂交的部分。CRMP-1核酸包含不同于SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸分子。这种差异可能是因为基因密码的退化，并造成一编码有同样CRMP-1多肽的核酸。CRMP-1核酸具有核苷酸序列编码一具有氨基酸序列不同于SEQ IDNO2的序列至少1，但少于5，10，20，或50个氨基酸残基的蛋白质。
CRMP-1特异性抗体或其片段(如其抗原结合片段)可以用于检测与分离CRMP-1多肽，调节CRMP-1多肽的生物利用性，以及调控CRMP-1活性。此处所谓「抗体」是指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即一抗原结合片段。此处所谓「免疫球蛋白」是指一蛋白质包含一个或以上的多肽实质上编码自免疫球蛋白基因。已知的人类免疫球蛋白基因包含κ、λ、α(IgAl与IgA2)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、∈以及μ固定位置基因，以及无数的免疫球蛋白多变区基因。
CRMP-1特异性抗体可以采用习知技术生产。这种抗体可包含，但不限于，多株，单株，嵌合，单链，Fab片段，以及由Fab表现库产生的片段。抗CRMP-1单克隆抗体可以采用由一连续细胞株培养的抗体分子产生的任何技术制备。这些技术的例子有杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术，EBV杂交瘤技术(Kohleret al.(1975)Nature 256495-497；Kozbor et al.(1985)J.Immunol.Methods 8131-42；Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030；或Cole et al.(1984)Mol.Cell.Biol.62109-120)。此外，也可以利用由「嵌合抗体」生产技术发展而来的技术，该技术是拼接小鼠抗体基因至人类抗体基因以得到具有适当抗原特异性与生物活性的分子(Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.SciUSA 816851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312604-608；或Takeda et al.(1985)Nature 314452-454)。或者，用于生产单链抗体的技术也适用，利用习知方法，以产生CRMP-1特异性单链抗体。CRMP-1特异性抗体可以由诱导体内淋巴细胞群的生产或筛检免疫球蛋白库或文献记载的高特异性结合剂组(Orlandi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833-3837；或Winter et al.(1991)Nature 349293-299)。
为了产生CRMP-1特异性抗体，包含山羊，兔，大鼠，小鼠，人类，及其它等许多宿主可注射CRMP-1多肽以免疫。依据宿主种类，可采用许多不同的佐剂以增加免疫反应。这些佐剂包含，但不限于，Freund氏法，矿物胶如氢氧化铝，以及界面活性物质如溶卵磷脂，复合多元醇(pluronic polyols)，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，以及二硝基酚。CRMP-1特异性抗体可完全为人类抗体，例如以基因工程处理而具有产生来自人类免疫球蛋白序列的抗体的小鼠制造的抗体，或非人类抗体，例如鼠类(小鼠或大鼠)，山羊，灵长类(如猴子)，骆驼抗体。产生鼠类抗体的方法皆为习知技术。可参考，例如Wood et al.国际专利申请案WO91/00906；Kucherlapatiet al.PCT申请案WO 91/10741；Lonberg et al.国际专利申请案WO 92/03918；或Kay et al.国际专利申请案92/03917。CRMP-1特异性抗体可以为一多变区，或其部分生产于一非人类的生物体，例如大鼠或小鼠。抗体生产于非人类的生物体后，例如大鼠或小鼠，会被修饰，例如于许多骨干或固定区域，以减少于人类中的抗原性，这些也都包含于本发明的范畴。
整段序列之CRMP-1多肽或CRMP-1多肽的抗原肽片段可作为免疫原或鉴别由其它免疫原造成的CRMP-1特异性抗体，其它免疫原为如细胞，膜制备等。CRMP-1多肽的抗原性肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列中至少8个氨基酸残基，并包含CRMP-1多肽的抗原决定蔟。抗原性肽可包含至少10，15，20，或30个CRMP-1多肽的氨基酸残基。
治疗方法CRMP-1多肽可用于基因治疗方法以传送编码有CRMP-1多肽的类似物或拮抗物的核酸。本发明特征为体内转染并表达CRMP-1多肽于一特定细胞种类的表达载体，以便在一该多肽表达失常的细胞中重建CRMP-1多肽之功能，或者仿真其功能。CRMP-1多肽表达构建体可以在任何生物有效载体投与，例如任何可以在体内有效传送CRMP-1基因至细胞的配方或组合物。表达构建体可包含核酸序列编码有CRMP-1多肽操作性地结合于一异源启动子，如一诱发启动子。基因疗法方法可包含给予诱发启动子的诱导剂至该个体。
施予方法包含插入目标基因于病毒载体，包含重组逆转录病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒，以及单纯疱疹病毒-1，或重组细菌或真核质粒。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA可藉助于例如阳离子脂质粒(lipofectin)或衍生化(如抗体结合)，聚离胺酸结合，Gramacidin S，人造病毒套膜或其它这类细胞内载体，以及直接注射该基因构建体或以CaPO4沉淀法于体内进行。
体内引入CRMP-1核酸至细胞的方法可采用一含核酸，如cDNA的病毒载体，该cDNA编码CRMP-1多肽。以病毒载体感染细胞具有高比率的靶细胞可接受该核酸的优点。此外，病毒载体内编码分子，例如由含cDNA病毒载体，可有效率地表达于保有病毒载体的核酸的细胞中。
逆转录病毒载体及腺病毒相关病毒载体可用于重组基因传送系统，以于体内传送外源基因，特别是在人类。这些载体提供有效地基因入细胞的传送，且移转的核酸可稳定地嵌入宿主的染色体DNA。特别细胞株(称为「包装细胞(Packaging cells)」)的发展只产生复制-缺陷逆转录病毒，该病毒增加逆转录病毒用于基因治疗的利用性，并且缺陷逆转录病毒的特征为用于基因治疗目的的基因转移(可参考Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。复制缺陷逆转录病毒可采用由辅助病毒的标准方法被包装成病毒体以用于感染靶细胞。产生重组逆转录病毒并用以于体外或体内感染细胞可参考Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel，F.H.et al.(eds.)Greene Publishing Association，(1989)，Section9.10-9.14以及其它标准实验室手册。适合的逆转录病毒例子包含熟于此技艺人士所熟知的pLJ，pZIP，pWE以及pEM。适合于制备兼具亲环境或亲两者的包装病毒株例子包含yCrip，yCre，y2以及yAm。逆转录病毒已被用于导入多种基因进入许多不同细胞型态，包含表皮细胞，在体外以及/或体内(请参考Eglitis，et al.(1985)Science 2301395-1398；Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.SciUSA 853014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry etal.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury et al.(1991)Science 2541802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu et al.(1993)J Immunol.1504104-4115；美国专利的4,868,116号；美国专利第4,980,286号；PCT申请第WO 89/07136号；PCT申请第WO 89/02468号；PCT申请第WO 89/05345号；以及PCT中请第WO 92/07573号)。
另一有用的病毒基因传送系统包含腺病毒来源的载体。腺病毒的基因组可操作为编码并表达所需基因产物但可以在正常溶细胞病毒生命期维持不活化形式而复制。请参考Berkner et al.(1988)Bio Techniques 6616；Rosenfeld et al.(1991)Science 252431-434；以及Rosenfeld et al.(1992)Cell 68143-155。适合的腺病毒载体为熟于此技艺人士熟知者为源于腺病毒株Ad type 5 d1324或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)。重组腺病毒具有某些情形下不能感染非分裂细胞而可用于感染许多细胞型态，包含表皮细胞(Rosenfeld et al.(1992)如前述)的优点。而且，该病毒粒子相当稳定因此适于纯化与浓缩，且如上述可被修饰以改变其感染范围。此外，导入腺病毒DNA(与其包含的外来DNA)并不会嵌入宿主基因组，而是以基因游离体(episomal)的形式存在，因而避免导入DNA嵌入宿主基因组(例如逆转录病毒DNA)而可能发生原位嵌入性突变的潜在问题。甚者，腺病毒基因组携带外来DNA的容量相对于其它基因导入系统较大(可达8千个碱基)(Berkber et al.如前述；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57267)。
另一适合携带CRMP-1基因的病毒载体系统为腺病毒相关病毒(AAV)。腺病毒相关病毒为自然发生的缺陷病毒，其需要其它病毒，例如腺病毒或辅助病毒作为辅助病毒以达成有效的复制与有生产力的生命周期(请参考Muzyczka etal.(1992)Curr.Topics in Micro.And Immunol.15897-129)。这也是少数可以嵌入其DNA至不分裂细胞中的病毒之一，且显示高频度的稳定嵌入性(请参考Flotte et al.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski et al.(1989)J.Virol.639822-9828；and McLaughlin et al.(1989)J.Virol.621963-1973)。具有少到300碱基对的AAV载体仍可以包装与嵌入。外来DNA的空间限制为约4.5kb。AAV载体如Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260所述者可以用于导入DNA至细胞。多种核酸已被采用AAV载体导入不同细胞型态(请参考Hermonat et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford et al.(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin et al.(1984)J.Virol.51611-619；以及Flotte et al.(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。
除了上述的病毒载体方法，也可以采用非病毒方法在动物组织表达CRMP-1多肽。大部分非病毒基因克隆方法系基于哺乳动物用于摄入以及细胞间转移大分子的正常机制。在某些实施方案中，本发明的非病毒基因传送系统依赖于细胞内吞途径使靶细胞摄入CRMP-1核酸。这些基因导入系统的例子包含脂质粒来源的系统，聚赖胺酸结合体，以及人造病毒套膜。其它实施例包含质粒注入系统，曾被叙述于Meuli et al.(2001)J Invest Dermatol.116(1)131-135；Cohen et al.(2000)Gene Ther 7(22)1896-905；或Tam et al.(2000)GeneTher 7(21)1867-74。
在一代表实施例中，编码CRMP-1多肽的核酸可截留于表面正价的脂质粒(例如lipofectin)，且(必要时)以抗靶组织细胞表面抗原的抗体标记(Mizuno etal.(1992)No Shinkei Geka 20547-551；PCT公开第WO91/06309号；日本专利申请第1047381号；以及欧洲专利公开第EP-A-43075号)。
在临床设置时，治疗性CRMP-1核酸基因传送系统可以采用任何方法导入病患，所有方法皆为习知。例如，基因传送系统的药学制备可以导入全身性，如静脉注射，以及在对于基因传送载体提供的转染特异性显著的标的细胞进行特异性蛋白转导(transduction)，细胞型态或组织型态表达是由于转录调节序列控制受体基因表达，或其重组。于其它实施型态，重组基因的起始传送会更受到导入动物的位置所限制。例如，基因传送载体可以导管导入(请参考美国专利第5,328,470号)或以立体注射导入(Chen et al.(1994)PNAS 913054-3057)。
基因治疗构建体的药学制备主要包含于一可接受稀释剂中的基因传送系统，或包含包埋有基因传送载体的缓释基质。或者，只要完整的基因传送系统可以由重组细胞顺利生产，例如逆转录载体，该药学制备可包含一个或多个会生产该基因传送系统的细胞。
诊断方法本发明亦提供一种诊断肿瘤在一个体的侵入潜在性或转移性的方法。本方法也可用于(1)监控一个体的治疗过程；或者(2)评估一怀疑或已知具有肿瘤疾病的个体。
本方法包含由一个体获得样品(如生检，血液，或其它组织样品)；测定样品中CRMP-1表达水平；比较样品表达与参考表达值；以及当样品表达低于参考表达值时分类个体为具有肿瘤侵入潜在性或转移性。每个样品表达或参考表达是评估大量的(1)由CRMP-1核酸转录的mRNA；或(2)CRMP-1多肽。样品包含由个体分离的组织，细胞以及生物液体，以及存在于个体内的组织，细胞与液体。样品之一例为血清。
CRMP-1基因表达水平可由对应于细胞中CRMP-1基因的mRNA水平测量。该测量可以由原位和体外试验决定，例如杂交或扩增试验，其包含，但不限于，Northern分析，聚合酶链反应以及探针阵列。检测mRNA水平之一诊断方法牵涉接触该mRNA与一可与所欲检测的基因编码mRNA杂交的核酸探针。核酸探针可以为如全长的CRMP-1核酸，如SEQ ID NO1的序列，或其部分，如具有至少7，15，30，50，100，250或500核苷酸长度而足以于严瑾条件下特异性杂交至CRMP-1 mRNA或基因组DNA的寡核苷酸。该探针可以淀积于一阵列地址。其它适于本诊断试验的探针说明如下。于一型态中(如Northern印迹法)，mRNA(或cDNA)固定于一表面且接触探针，例如于琼脂糖凝胶进行分离mRNA并由凝胶转移该mRNA至一膜上，如硝酸纤维素。于另一型态中，探针固定于一表面且mRNA(或cDNA，如标记的cDNA)接触探针，例如于下述之二维基因芯片阵列。熟于此技艺者可采用已知mRNA检测方法用于检测编码CRMP-1基因的mRNA量。
一样品中mRNA量也可以由核酸扩增评估，例如由rtPCR(Mullis(1987)美国专利第4,683,202号)，接合酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193)，自体支持序列复制(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，转录扩增系统(Kwoh et al.(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-Beta复制(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 61197)，翻滚环复制(rolling circle replication，Lizardi et al.美国专利第5,854,033号)或任何其它核酸扩增方法，接着可以采用习知技术检测扩增的分子。此处所采用的扩增引物是定义为可对一基因(分别为正链与负链；或相反)的5’到3’区域退火的一对核酸分子，并包含其间的短区域。一般而言，扩增引物是由10到30个核苷酸长度组成，并跨越约50到200个核苷酸长度。于适当条件与适当试剂下，这些引物允许核酸分子扩增包含引物跨越的核苷酸序列。
有多种方法可用于测定CRMP-1多肽的量。一般而言，这些方法包含接触一可选择性结合至CRMP-1多肽的试剂，例如样品中的抗体，以评估样品中多肽的量。抗体可连接可测得的标记。此处所谓「标记」指对于探针或抗体，准备以连接(及物理性连结)一可检测物质至抗体或探针而作为直接标记探针或抗体，以及以与一可检测物质反应间接标记探针或抗体。
可以采用检测方法以在体外或体内检测样品中的CRMP-1多肽。在体外检测CRMP-1多肽的方法包含酶联免疫吸附试验(ELISAs)，免疫沉降试验，免疫荧光法，酶免疫试验(EIA)，放射免疫试验(RIA)，以及Western印迹分析。在体内检测CRMP-1多肽的方法包含导入一标记的CRMP-1特异性抗体至一个体。例如，抗体可用放射活性标定物标记，该标定物在个体中的存在与位置可以被标准显像技术检测。在另一实施方案中，样品被标记，如生物素化并与抗体接触。样品可被检测，例如以带有一荧光标记的抗生物素蛋白。
在原位方法中，细胞或组织可制备/处理并固定于一支持物上，通常是玻片，接着与可杂交所要分析的编码CRMP-1基因mRNA的探针接触。诊断与预后试验可更包含将一对照组样品与一可检测CRMP-1 mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，以及比较对照组样品中CRMP-1 mRNA或基因组DNA存在量与试验组样品中CRMP-1 mRNA或基因组DNA存在量。基因表达的系列分析，如美国专利第5,695,937号所述，也可被用于检测CRMP-1转录物水平。
筛检试验化合物本发明提供一种鉴定试验化合物的方法，试验化合物即候选物或试剂，可调控CRMP-1核酸或CRMP-1多肽的表达水平。
试验化合物可以采用任何已知组合数据库方法的方式获得，包含生物数据库；类肽数据库(分子数据库，其分子具有肽功能性，但具有新颖非肽骨干而可抗酶降解而仍具有生物活性，请参考Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678-85)；空间定位的平行固态或液态数据库；需去回旋的合成数据库方法；「一粒子一化合物」数据库方法；以及采用亲和性层析分析选择的合成数据库方法。生物数据库与类肽数据库方法限制于肽数据库，然而其它四种方法可应用于肽，非肽寡聚物或化合物小分子数据库(Lam(1997)AnticancerDrug Des.12145)。
分子数据库的合成方法的例子为习知技术，例如可参考DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA9111422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science 2611303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell er al.(1994)Angew.Chem.Int.Engl.332061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物数据库可显示于溶液(如Houghten(1992)Biotechniques13412-421)，于粒子上(Lam(1991)Nature 35482-84)，芯片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)，细菌上，(Ladner，美国专利第5,223,409号)，孢子上(Ladner，美国专利第5,223,409号)，质粒上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌体上(Scott and Smith(1990)Science 249386-390；Devlin(1990)Science 249404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310；Ladner如上述)。组合化学数据库的例子包含，但不限于，肽数据库(请参考美国专利第5,010,175号，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)以及Houghton et al.Nature 35484-88(1991))。其它产生化合物多变数据库的化学方法也可采用。这些化学方法包含，但不限于类肽(PCT公开第WO91/19735号)，编码肽(PCT公开第WO93/20242号)，随机生物寡聚物(PCT公开第WO92/00091号)，苯氯甲苯基苯联二氮草酮(benzodiazepines美国专利第5,288,514号)，多体苯氯甲苯基苯联二氮草酮以及二肽(Hobbs et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906906-6913)，乙烯类多肽(Hagihara et al.(1992)J.Amer.Chem.Soc.1146568)，带有葡萄糖架构的非肽、肽仿真物(Hirschmann et al.(1992)J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218)，类似有机合成的小分子数据库(Chen et al.(1994)J Amer.Chem.Soc.1162661)，寡氨基碳酸盐(Cho et al.(1993)Science 2611303)，以及/或肽磷酸盐(Campbell et al.(1994)J.Org.Chem.59658)，核酸数据库(请参考Ausubel，Berger and Sambrook如上述)，肽核酸数据库(请参考如美国专利第5,539,083号)，抗体数据库(请参考如Vaughn et al.(1996)NatureBiotechnology 14(3)309-314，与PCT/US96/10287)，碳水化合物数据库(请参考如Liang et al.(1996)Science 2741520-1522与美国专利第5,593,853号)，小有机分子数据库(请参考如苯氯甲苯基苯联二氮草酮，Baum C&EN，Jan 18，Page33(1993)；类异戊二稀，美国专利第5,569,588号；噻唑烷酮与间噻唑酮，美国专利第5,549,974号；吡咯烷酮，美国专利第5,525,735号以及第5,519,134号；吗林化合物，美国专利第5,506,337号；苯氯甲苯基苯联二氮草酮，第5,288,514号等)。
试验化合物调控CRMP-1核酸表达可被鉴定。例如，细胞或无细胞混合物与试验化合物接触，以及与相对于无试验化合物的CRMP-1 mRNA或多肽之表达水平的CRMP-1 mRNA或多肽的表达接触。当CRMP-1 mRNA或多肽的表达在存在试验化合物的情形大于不存在的情形时，确认该试验化合物为CRMP-1 mRNA或多肽的表达的刺激物。相反地，当CRMP-1 mRNA或多肽的表达在存在试验化合物的情形小于(如统计上显著小于)不存在的情形时，确认该候选化合物为CRMP-1 mRNA或多肽的表达的抑制物。CRMP-1 mRNA或多肽的表达可由前述「诊断方法」测定。
试验化合物调控CRMP-1多肽结合于受体，如CRMP-1受体，的能力可被测定。这可由例如带有放射性同位素或酶标记的受体完成，如结合受体至CRMP-1多肽可由检测复合物的标记而得知。相反地，也可以由带有放射性同位素或酶标记的CRMP-1多肽监控复合物中试验化合物调控CRMP-1多肽结合至CRMP-1多肽受体的能力进行。例如，受体可以125I、35S、14C、或3H标记，或直接或间接地，并且放射性同位素是由直接计数放射激发或闪烁计数(scintillation counting)而检测。或者是，试验化合物以酶标记，例如以辣根过氧化物，碱性磷酸酶，或虫萤光酶，并以转化适当受体成产物进行酶标记的测定。
试验化合物与CRMP-1多肽反应不与任何标记反应物反应的能力可被评估。例如，试验化合物与CRMP-1多肽的反应可采用荧光能量转换(FET)检测(请参考如Lakowicz et al.美国专利第5,631,169号；Staviranopoulos et al.美国专利第4,868,103号)。一荧光物质标记于第一「施予者」分子是择自如其激发荧光能量将被一荧光标记于第二「接受者」分子吸收，接受者分子吸收能量后可产生荧光。选择标记是以激发不同波长光，例如「接受者」分子标记可与「施予者」分子分辨。由于标记间能量转换效能是相关于分子分离的距离，分子的空间关系将被评估。FET结合结果可以便利地以习知标准荧光测量仪器测定(如采用荧光仪)。试验化合物与CRMP-1多肽的反应可采用实时生物分子反应分析(Biomolecular Interaction Analysis，BIA)进行(可参考如Sjolander，S andUrbaniczky，C(1991)Anal.Chem.632338-234以及Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)。「表面质粒基因组共振(surface plasmonresonance)」或「BIA」可实时检测生物特异性反应，而不用标记任何反应物(如BIA核)。结合表面的质量改变(结合结果的指针)改变了接近表面处的光反射指数(表面质粒基因组共振(SPR)的最适现象)，产生了可作为生物分子实时反应的指针的可检测讯息。
鉴定试验化合物的方法适合结合上述两个或以上试验，并且以上述筛检方法鉴定新化合物。因此，此处所述鉴定的化合物(即CRMP-1调控化合物，反向CRMP-1核酸分子，CRMP-1特异性抗体，或CRMP-1结合配子)，于适当动物模式确认该化合物功效，毒性，副作用，或反应机制，或采用该化合物治疗，亦包含于本发明之范畴。此外，以上述筛检试验鉴定出的新化合物可用于此处所述的治疗。
并且亦可能鉴定可结合于CRMP-1核酸，如结合于CRMP-1非编码区或CRMP-1编码区(即基因银行NT 006051序列，其包含CRMP-1基因，也就是介于核苷酸559971..635062或核苷酸540000..640000)，的嵌合、人造锌指(zincfinger)蛋白。并且可以产生包含多种锌指蛋白部分的数据库。可参考Rebar et al.(1996)Methods Enzymol 267129；Greisman and Pabo(1997)Science 275657；Isalan et al.(2001)Nat.Biotechnol.19656；and Wu et al.(1995)Proc.Nal.Acad.Sci.USA 92344。
亦可能制备一个或以上嵌合锌指DNA结合区，例如于体外选择(如采用噬菌体表达法)或基于辨认编码的设计(如WO00/42219)。锌指蛋白可融合至转录活性部分以活化CRMP-1之转录。锌指蛋白本身亦可编码白异源核酸以携入细胞。编码锌指蛋白的序列可操作性地结合于可诱导启动子，例如确保细胞中锌指蛋白较佳控制水平。
高产量筛检方法高产量筛检方法可用于筛检化学物质的大型数据库。这样的候选化合物可被生产或例如由Chembridge Corp.，San Diego，CA购得。数据库可设计成包含多变范围的化合物。例如，一数据库可包含10,000、50,000、或100,000或更多不同化合物。此处仅叙述该方法，一数据库可由异环建构，包含吡啶、吲哚、喹啉、呋喃、嘧啶、三唑(triazines)、吡咯、异吡唑、萘、苯并咪唑、哌啶、吡唑、苯唑、吡咯烷(pyrrolidines)、噻酚、噻唑、苯并噻唑、以及吗啉。或者，之前试验与多种证据可以推测一群或一类具增强潜在性的化合物。一数据库可以设计并合成包含这样族类的化合物。
由模式细胞株(例如CL1-0与其亚株如CL1-1与CL1-5)转移的细胞，或由肿瘤病忠取得的细胞可以用于高产量药物筛检。例如，细胞可以生长于微孔板，如6孔、32孔、64孔、96孔、384孔板。高密度微孔板可由聚合物，如聚二甲基硅烷(如Dow-Corning公司的Sylgard 384)与丙烯酸铸模成形。该铸模包含生长细胞的孔洞，且化合物可分配于该孔洞。例如，一铸模含有1536个容量2μL的孔洞，或6144个容量250nL的孔洞。多个试验化合物或前述数据库可被筛检。数据库可以提供一可修正成机器人操作形式的编排，例如于微孔板。化合物可加入微孔板的细胞中。化合物加入后，细胞培养特定时间。接着，监控表达水平。
试验化合物也可以集合，并试验该集合。阳性反应集合可分开继续分析。不论哪种方法，会改变CRMP-1基因表达水平的化合物就被视为「候选」化合物或药物。候选化合物会如上述再试验于转移细胞。候选化合物在再试验仍为阳性反应者被视为「先导」化合物。
一旦鉴定出一先导化合物，可采用药物化学标准程序以生产该化合物的衍生物。衍生物可以筛检出具有增进药学特性者，例如功效、药物动力学、稳定性、溶解度、以及清除率。前述试验中一化合物活性部分可以习知的构造活性相关(structure-activity relationships，SAR)试验确认。熟于药物化学者可修饰先导化合物的活性部分并测量修饰对化合物的功效的影响以产生增强功效的衍生物。例如，请参考Nagarajan et al.(1988)J.Antibiot.411430-8。修饰可包含N-酰化作用、胺化作用、酰胺化作用、氧化作用、还原作用、烷化作用、酯化作用、以及烃化作用。此外，当确认先导化合物的生物化学靶位，靶位的构造与先导化合物可提供设计与最佳化衍生物的信息。分子模式软件是市面可取得的(如分子仿真公司)。
药学组合物本发明提供一治疗一具有肿瘤转移的危险性(或感受性)个体或治疗一具有肿瘤转移的个体的药学组合物。此处所谓「治疗」定义为施行或施予一药剂至一个体，或施行或施予一药剂至一病患的分离组织或细胞株，该病患具有一疾病、一疾病的症状或易染一疾病的体质，治疗的目的是治愈、恢复、减轻、解除、改变、补救、改善、增进或影响疾病、疾病的症状或易感疾病可能性。一药剂包含，但不限于，CRMP-1多肽、CRMP-1核酸、或可调控或影响CRMP-1核酸或CRMP-1多肽的试验化合物。
一药学组合物包含前述药剂与一药学上可接受载体。此处所谓「药学上可接受载体」包含溶剂、分散媒介、包覆剂、抗细菌剂与抗菌剂，等张与延缓吸收剂等，依药学施予方式而定。辅助活性化合物亦可并入组合物中。
一药剂可以调制为适于所欲施予途径的形式。施予途径的例子包含非口服给药，如静脉、皮内、皮下注射，口服(如吸入)、经皮(如局部)、经黏膜、以及直肠给药。调制成这些施予途径的剂量形式可采用传统方法。例如，一药剂可调制成胶囊、胶封、或锭剂以便口服给药。胶囊可包含任何标准药学上可接受物质，例如明胶或纤维素。锭剂可以依传统方法调制，包括压缩一药剂的混合物与一固态载体及润滑剂。固态载体的例子包含淀粉与糖皂土。一药剂也可以硬壳锭剂或胶囊形式给予，其包含一黏结剂，如乳糖或甘露糖，一传统填充剂，以及一成形剂。
药学组合物可以非经口途径、包含口服、局部、皮下、腹腔、肌肉、以及静脉给药。非经口剂量形式的例子包含水溶液、等渗生理盐水或活性药剂的5％葡萄糖、或其它习知药学上可接受赋形剂。可溶药剂如环葡聚糖、或其它熟于此技艺者熟知的可溶药剂，可以用于药学赋形剂以传送治疗药剂。
一药剂的毒性与治疗功效可以于细胞培养或实验动物由标准药理学方法测定，例如测定LD50(对族群中50％致死剂量)以及ED50(对族群中50％治疗有效剂量)。毒性与治疗功效剂量比为治疗指针，且可以表示为LD50/ED50。化合物显示高治疗指针是较佳的药剂。药剂显示毒性副作用者仍然可以采用，但需要注意设计投与系统使该药物可定位至受感组织，而减少对未感细胞的潜在损伤，因而减低副作用。
由细胞培养试验与动物试验得到的数据可用于调制用于人体的剂量范围。药剂的剂量较佳地是基于循环浓度落于一范围，包含ED50带有微量或无毒性。剂量于此范围内可基于所采用的剂量形式与给药途径改变。对于用于本发明的任何药剂，治疗有效剂量可以细胞培养试验开始估测。一剂量可调至于动物模式而达到循环血浆浓度范围包含如细胞培养中的IC50(即试验化合物浓度达到症状抑制的一半量)。这样的信息可以用于更精确的决定人体有效剂量。可测量血浆中含量，例如以高效能液相层析测量。
如此处所定义，多肽的治疗有效剂量(即有效剂量)范围介于约0.001至30mg/kg体重，约0.01至25mg/kg体重，约0.1至20mg/kg体重，或约1至10mg/kg，2至9mg/kg，3至8mg/kg，4至7mg/kg，或5至6mg/kg体重。熟于此技艺者将了解某些因子可能影响有效治疗个体所需的剂量与时间，包含但不限于疾病或不适严重程度，之前的治疗，个体的健康程度与/或年龄，以及其它疾病的存在。
对于抗体而言，较佳剂量为0.1mg.kg体重(一般为10mg/kg至20mg/kg)。若抗体是作用于脑部，通常采用50mg/kg至100mg/kg的剂量。一般而言，部份人体抗体与完全人体抗体于人体内具有较其它抗体长的半衰期。因此，可能常需降低剂量与减少施予频率。如脂化作用的修饰可用于稳定抗体并增强吸收与组织侵入性(如进入脑部)。抗体脂化作用的方法如Cruikshank等人所述(Cruikshank et al.(1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 14193)。
本发明包括可调控CRMP-1核酸或CRMP-1多肽的表达或活性的化合物。一药剂可以为如一小分子。剂量的例子包含每公斤个体或样品重量施予毫克(milligram)或微克(microgram)剂量的小分子(也就是约每公斤1微克到500毫克，约每公斤100微克到5毫克，或约每公斤1微克到50微克)。此外，可了解的是适当剂量小分子是基于小分子的强度与要调控的表达与活性水平。当一个或以上这些小分子施予于一动物(如人类)以调控本发明多肽或核酸的表达或活性时，一临床医师、兽医或研究者开始时会处方一相当低剂量，继续增加剂量直到达到适当反应。此外，要了解的是特定剂量对任何特定动物个体会基于多种因子，包含所采用特定化合物的活性，个体的年龄、体重、一般健康状态、性别、与饮食，以及施予时间，施予途径，排泄速率、任何组合使用的药物，以及要调控的表达或活性水平。
药学组合物给药的指示可以一起包含一容器、包装、或分散剂。
下述特定实施例仅作为说明之用，并没有限定本发明的公开。不需多加详述，应可了解到熟于此技艺人士当可基于本发明的公开，延伸发展本发明。此处所公开的发表，包括专利，是包含在参考资料的整体中。
实施例方法细胞株与培养条件人类肺腺癌细胞株CL1-0、CL1-1、CL1-5、与CL1-5-F4是培养于RPMI-1640培养基(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)与10％胎牛血清(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)以及2mM L-谷胺酸酰胺(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)，并于37℃，20％O2与5％CO2中。
CL1-0为母株；CL1-1与CL1-5为以聚碳酸盐膜包覆Matrigel(CollaborativeBiomedical，Becton Dickinson，Bedford，MA)的体外选择，于穿透孔洞侵入性室(Transwell invasion chamber，Chu et al.(1997)Am J Respir Cell Mol Biol 17353-60)，由CL1-0择出的亚株。CL1-5细胞注入严重综合免疫不全小鼠的尾静脉，接着由该小鼠肺形成的肿瘤分离并克隆一细胞株。于四次重复体内选择后，细胞株命名为CL1-5-F4。附着的细胞以胰蛋白酶/EDTA(Sigma，Deisenhofen，Germany)由培养皿分离。在功能性试验前，先用0.02％EDTA处理以防止细胞表面抗原被破坏。
微阵列分析微阵列试验是以9600个特征阵列于一尼龙膜上进行，如Chen等人所采用的色度检测方法。请参考Chen et al.(1998)Genomics 51313-24；以及Hong etal.(2000)Am J Respir Cell Mol Biol 23355-63。简单的说，每一细胞株生长至80％满并于培养细胞换新鲜培养基的24小时后提取mRNA。这样可以减低将细胞移出培养箱与溶胞的时间。以修饰过胍硫氰酸-酚-氯仿提取方法，采用RNAzol B(Biotecx Laboraories，Houston，Texas)，由细胞提取总细胞RNA。mRNA采用oligotex-dT树脂(Qiagen，Hilden，Germany)提取。将由每一肺癌细胞株得到5μg的mRNA反转录并以生物素标记。携带有双链互补DNA(cDNA)靶的膜以7mL杂交缓冲液(5X SSC，0.1％N-lauroylsacosine，0.1％SDS，1％罗氏分子化学所制封闭试剂混合液，以及50μg/mL鲑鱼精子DNA)，于68℃杂交前一小时进行前杂交。含有人类COT-1 DNA代替鲑鱼精子DNA的80μL杂交溶液以及cDNA探针以一微阵列封于一杂交袋。杂交反应后，该膜孵育于1mL含有700X稀释STREP-GAL(1.38U/mL酶活性)(GIBCO-BRL)、4％聚乙二醇8000(Sigma)、与0.3％BSA溶于1X TBS缓冲液的混合物2小时。呈色反应接着以含20mM EDTA的1X PBS中止。定量以MuCDA程序进行，该程序可自写或由中央研究院(台北，台湾)取得。该程序以测量每一点积分密度而分离不同表达基因，进行积分密度数据的回归分析，并且定位统计上分离者为不同表达基因。
分子克隆以及质粒构建采用Superscript II RTase(Gibco-BRL，Rockville，Maryland)与随机六聚引物进行RNA的反转录。编码整段人类CRMP-1(基因银行登录第D78012号)编码区的cDNA由CL1-0的cDNA经PCR扩增。引物序列如下5’引物5’-CTCCGTCCGTGTCTCTATCC-3’(SEQ ID NO3，D78012的第24-43个核苷酸)；以及3’引物5’-CCTCCATCAGCACCAACTAAA-3’(SEQ ID NO4，D78012的第1955-1975个核苷酸)。反应混合物于94℃变性30秒，于55℃退火30秒，以及于72℃延长3分钟。这些反应重复30个循环。一1952-bp CRMP-1cDNA片段依制造商指示步骤克隆入TA载体(pGEM-T-Easy cloning kit；Promega，Madison，Wisconsin)。CRMP-1 cDNA序列分析显示与发表的序列(Hamajima et al.(1996)Gene 180157-63)有100％相同性。
于pCI-neo哺乳类表达载体(Promega，Madison，Wisconsin)的EcoR I与Not I间插入CRMP-1 cDNA(D78012的第24-1975个核苷酸)以构建pCIneo-CRMP-1。将部份CRMP-1 cDNA(第376-1975个核苷酸)插入pREST C原核表达载体(Invitrogen，Carlsbad，California)以构建pRSET-CRMP-1作为生产融合蛋白之用。CRMP-1 cDNA(第151-1869个核苷酸)编码区以PCR由pCIneo-CRMP-1质 粒 扩 增。正向引物5’-ATTGACTCGAGATGTCGTACCAGGGCAAGAA-3’(SEQ ID NO5)包含CRMP-1序列的第151-170个核苷酸并导入Xho I位(下标处)。反向引物5’-ATATCGAATTCTCAACCGAGGCTGGTGAT-3’(SEQ ID NO6)互补于第1852-1869个核苷酸并导入EcoR I位点(下标处)。为进行蛋白质定位试验，扩增的CRMP-1片段由Xho I与EcoR I位点间插入到一CMV启动子来源的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体-pEGFP-C3(Clontech，Palo Alto，California)以得到pEGFP-CRMP-1。这些构建体由质粒克隆分离出并采用自动测序仪(型号ABI377，PE Applied Biosystems，Forster City，California)测序双链DNA。
单克隆抗体的生产pRSET-CRMP-l转染至大肠杆菌株BL21(DE3)pLysS。融合蛋白(命名为His-CRMP-1(第76-572个氨基酸))以融合体的形式取得。融合体溶解并以12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。使BALA/c小鼠(6周龄)接受皮下注射于0.1mL弗氏完全佐剂(Life Technologies，Grand Island，New York)中并辅以0.1mL灭菌磷酸缓冲生理盐水(PBS)乳化的SDS-PAGE纯化过的融合蛋白。小鼠接着每三周又接受皮下注射于0.1mL弗氏不完全佐剂(Life Technologies，Grand Island，New York)中并辅以0.1mL灭菌磷酸缓冲生理盐水(PBS)乳化的融合蛋白。以Western印迹法测抗体效价，并采用预先免疫血清作为阴性对照。由一小鼠取得的脾细胞于聚乙二醇1500(Roche GmbH，Mannhein，Germany)存在下与小鼠骨髓瘤融合。杂交瘤分配于含有DMEM与RPMI-1640(1∶1)培养液加入15％NuSerum(Collaborative Research，Bedford，Massachusetts)、以及亚黄碱-胺基蝶呤-胸腺嘧啶HAT(Sigma，St.Louis，Missouri)的96孔板。上清液以Western印迹法抗His-CRMP-1(第76-572个氨基酸)融合蛋白筛检。
Northern杂交法与Western印迹分析于0.8％琼脂糖甲醛凝胶的每一行注入20μg的总RNA，并于1XMOSP电泳缓冲液中电泳后，将凝胶印迹以毛细管法转印到Hybond-N+尼龙膜(Amershan，Buckinghamshire，United Kingdom)。于紫外线交联该膜后以5XSSC，5X Denhard氏溶液，50mM NaPO4(pH6.2)，100μg/mL鲑鱼精子DNA，以及50％去离子甲醛，于42℃进行前杂交处理4小时。该膜再以由RediprimeDNA标记系统(Amersham，Buckinghamshire，United Kingdom)合成32p-标记的DNA探针杂交。杂交于5X SSC，5X Denhard氏溶液，10％葡聚糖硫酸盐，20mMNaPO4(pH6.2)，100μg/mL鲑鱼精子DNA，以及50％去离子甲醛中、42℃下进行18小时。该膜以2X SSC与0.5％ SDS置于室温15分钟清洗两次，再以0.1XSSC与0.1％ SDS置于52℃30分钟清洗两次。该膜并于70℃暴露于X射线底片隔夜。每一行的RNA量是比较似Gβ-探针(一常存基因作为RNA量的内对照组)的讯号强度而测得。请参考Shan et al.(1992)Mol Cell Biol 125620-31。
总细胞溶胞产物(5μg蛋白质)以12.5％SDS-PAGE分离，并以电转印法转印到聚偏二氯乙烯膜(Immobilon-P膜，Millipore，Bedford，Massachusetts)。以5％脱脂奶粉于0.1％ Tween-20的PBS溶液中封闭后，膜结合蛋白以单克隆抗体探测。清洗该膜并以辣根过氧化物酶结合抗小鼠二次抗体(Amersham，Buckinghamshire，United Kingdom)处理。蛋白带以强化化学冷光试验试剂盒(Amersham，Buckinghamshire，United Kingdom)与X射线底片测量。
转染与克隆如前述以20ULipofectAMINE试剂(Gibco-BRL，Rockville，Maryland)转染5μg pCIneo-CRMP-1质粒至70％满的CL1-5细胞。CL1-5细胞再以不含插入物的pCI-neo载体转染作为对照组(伪转染株)。加入正泰霉素-G418(Gentamicin-G418，Gibco-BRL，Rockwille，Maryland)至500μg/mL的浓度以进行稳定转染株克隆。每三天换一次选择培养液共3周。分离可抗性细胞株并扩增以鉴定特征。转染克隆DNA插入染色体DNA的情形以Northern杂交法确认。至于暂时转染者，以LipofectAMINE试剂于70％满培养CL1-0与CL1-5细胞转染pEGFP-CRMP-1质粒。48小时后，直接检查活细胞并以配备有MRC-1000扫描同位显像系统的Zeiss Axiphot表荧光显微镜(Bio-Rad，Rockville Center，New York)照相。请参考Hong et al.(2000)Am J Respir CellMol Biol 23355-63。
体外侵入性试验与细胞生长试验转染克隆侵入性是采用膜侵入培养系统(membrane invasion culturesystem，MICS，Chu et al.(1997)Am J Respir Cell Mol Biol 17353-60)测试。于MICS系统中，含有10μm孔洞的聚碳酸盐膜(Nucleopore Corp.，Pleasanton，California)以5mg/mL Matrigel的混合物包覆。将上述膜置于一MICS室的上、下孔盘之间。再悬浮细胞于一含10％NuSerum的RPMI-1640中，并分别接种于室中的上孔盘(2.5×104细胞/孔)。于37℃培养48小时后，经由该包覆膜侵入的细胞以1mM EDTA之PBS由下孔盘移除，并以3μm孔洞印迹到聚碳酸盐膜上。印迹细胞以propidium iodine(Sigma，St.Louis，Missori)染色，并采用个人计算机软件(分析影像站；Imaging Research Inc.，Ontario，Canada)于显微镜(50X放大率)计数每一印迹的细胞数。每一试验经过同样品进行三次重复试验。
细胞生长采用修饰3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二酚四唑溴化物(MTT)试验测量。请参考如Denizot et al.(1986)J Immunol Methods 89271-7。细胞分种于96孔板使每孔培养液(100μL)含4000个细胞。培养板培养长达4天。于MTT试验中，每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，并于37℃再培养细胞4小时。于每孔加入100μL的含0.04N HCl的异丙醇，并强力混合以溶解细胞中产生的有色结晶。以多孔扫描光谱仪(Titertek Multiskan，Flow Laboratories，McClean，Virginia)测量570nm至630nm的吸收光谱作为参考波。细胞存活率以台盼蓝染色剔除试验测得。每一数据点代表由至少3次重复同一试验的平均6个决定点。
F-肌动蛋白染色生长于盖玻片之细胞以PBS清洗三次，以含3.7％三聚甲醛的PBS固定10分钟，并以含0.1％ Triton-X 100的PBS穿透10分钟。非特异性结合位点以含5％无脂牛奶的PBS处理15分钟而封闭。以PBS清洗5分钟后，细胞孵育于若丹明(rhodamine)-结合鬼笔毒环肽(phalloidin)5U/mL(Molecular Probe，Eugene，Oregon)30分钟。以PBS清洗后，细胞采用含有2％ n-丙基没食子酸盐，60％甘油的PBS，pH 8.0盖覆液盖于载玻片上。细胞采用Zeiss Axiphot表荧光显微镜检视并采用柯达T-max 400底片照相。
病患与样品本研究包含国立台湾大学附设医院于1994年九月至1996年十二月间80个切除非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)的连续病患。本研究系经过国立台湾大学附设医院研究所复审委员会允许后才进行的。并由所有病忠得到书面通知同意。由于没有病患在手术前曾接受新佐剂化疗或放射治疗，因此所有肿瘤组织样品皆是自然处理。于手术时取得的肺癌组织与肺脏非肿瘤部位的样品立刻以液态氮急速冷冻并保存于-80℃直到使用时才解冻。依据世界卫生组织的标准(World Health Organization(1982)Am J Clin Pathol 77123-36)进行组织学分类。以病理学检查确认肿瘤大小、部位侵入性、以及淋巴结转移情形。结合手术与病理学发现确认最后疾病阶段，此是根据现行肺癌阶段分类的肿瘤-结节-转移系统(Mountain(1997)Chest 1111710-7)。病患包含51位男性与29位女性(平均年龄62.9±10.5岁)。这些病患的38位具有鳞状细胞癌且42位具有腺癌。疾病的手术-病理学阶段为第1期31位，第II期19位，第III期24位，以及第IV期6位。肿瘤状态系T1期15位，T2期42位，T3期9位，以及T4期14位。42位病患不具有淋巴结转移(N0期)，以及38位具有局部或横膈淋巴结转移(N1期有19位，N2期有18位，以及N3期有1位)。追踪数据由病患医疗纪录与本研究肿瘤登记服务取得。追踪期间由6.5至70个月，持续至2000年六月。复发时间的计算是由手术日至检测到局部再发或系统转移。存活时间的计算是由手术日至死亡日。复发时间范围由2至42个月(中数11.0个月)，且存活时间范围由6.5个月至53个月(中数20.5个月)。病患于手术后30天内死于手术后并发症者排除于存活分析外。
实时定量反转录聚合酶链反应总mRNA由切除癌细胞以RNA提取试剂盒(RNase Mini Kit；Qiagen，Valencia，California)提取。RNA样品的品质系经过琼脂糖凝胶电泳与溴化乙锭(ethidium bromide)染色及于紫外光下观察到18S与28S RNA确认。用于实时定量RT-PCR的标准曲线样品由系列稀释特定RNA样品所包含的250ng、50ng、10ng、与2ng范围。系列稀释的样品分装并保存于-80℃直到使用时才解冻。基于CRMP-1的cDNA序列，用以作为CRMP-1 mRNA定量RT-PCR的引物如下(1)正向引物，5’-CCACGATGATCATTGACCATGT-3’(SEQ IDNO7 ， 外 显 子 3) ， 以 及 (2) 反 向 引 物 ，5’-AGGGAGTAATCACAGCAGGATTTG-3’(SEQ ID NO8，外显子4)(Torres(1998)DNA Res 5393-5)。用于检测并定性RT-PCR产物的探针序列为FAM(羧基荧光素(carboxyfluorescein))5’-AGCCTACTGACCTCTTTCGAGAAGTGGCA-3’TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明)(SEQ ID NO9)。此特异于CRMP-1 cDNA序列是选自外显子4-外显子4连结以防止定量PCR产物时可能发生的CRMP-1染色体DNA污染。用于定量TBP mRNA(内对照组，基因银行登录第X54993号)的RT-PCR引物与探针来自Bieche et al.(1999)Clin Chem 451148-56。PCR产物的一致性以DNA测序确认。每一试验包含一标准曲线，一无模板对照，以及总RNA样品的三次重复结果。反应条件如前人所述(Yuan et al.(2000)Am JRespir Crit Care Med 1621957-63)。由报导染色激发的荧光系采用ABI prism7700序列检测系统(PE Applied Biosystems，Foster City，California)线上实时检测。
统计分析适当地，数据以平均值±标准差(SD)的形式显示。所有统计分析皆是以SPSS第8.0版处理。不同实验组数据比较是以Student’s t test进行。采用PairedKendall’s W test比较肿瘤样品与成对正常组织的CRMP-1 mRNA表现差-ΔCT。采用Fisher’s exact test与Student’s t test比较高与低CRMP-1 mRNA表现的肿瘤(与病患)的临床病理特征。存活曲线与存活差异性由Kaplan-Meier法获得且低与高CRMP-1 mRNA复发时间差异以log-rank test分析。所有统计分析皆为双向。P值小于0.05者视为统计上显著差异。
结果以cDNA微阵列鉴定不同表达CRMP-1 mRNA
采用cDNA微阵列与色度检测法鉴定具有多种程度的侵入性特征的肺癌细胞株(CL1-0、CL1-1、CL1-5、与CL1-5-F4)之间的不同表达基因。这四个细胞株具有不同的侵入性程度。侵入性程度，由小至大四细胞株依序为CL1-0＜CL1-1＜CL1-5≤CL1-5-F4。所有cDNA微阵列的试验皆重复三次。细胞株生长于三个独立培养条件，且整个由RNA提取至显像分析的过程皆系独立进行。实验的标准差为7.3％。cDNA微阵列数据分群分析显示约500个基因与癌细胞侵入性有正或负相关。大部分这些基因与血管新生作用、细胞活动力、附着力、以及增生作用有关。其中，CRMP-1 mRNA表县与细胞侵入性为负相关。
Northern杂交法确认CRMP-1表达水平于CL1-5与CL1-5-F4相对于CL1-0与CL1-1剧烈下降。为确认CRMP-1于mRNA层次的不同表现亦反应了蛋白质层次，采用抗CRMP-1的特异性单克隆抗体Y21进行蛋白印迹法。单克隆抗体Y21识别CRMP-1但不识别其它CRMPs。观察到同样地于CL1-5与CL1-5-F4的CRMP-1表达下降。
CRMP-1过量表达可以于体外抑制癌细胞侵入性为研究是否侵入性表达型与CRMP-1表达非偶然关系，构建一具有CRMP-1 cDNA殖入pCI-neo载体之质粒并转染至CL1-5，且分离出五个克隆株可稳定表现CRMP-1。进行Northern杂交法以分析于伪转染者与CRMP-1cDNA转染克隆(B5，C6，C8，C10与C22)的CRMP-1表达。采用整段CRMP-1cDNA编码区1.95kb作为探针。所有五个CRMP-1转染克隆皆表达CRMP-1mRNA转录物。相反地，伪转染者并无任何可测得的CRMP-1转录物。采用似Gβ探针作为RNA品质之内对照。亦采用蛋白印迹法分析伪转染者与五株CRMP-1转染克隆的CRMP-1表达。采用CRMP-1单克隆抗体Y21作为一次抗体。CRMP-1蛋白表达于CRMP-1转染克隆，但不表达于伪转染者。采用体外重建基底膜侵入性试验确认是否CRMP-1表达影响癌细胞侵入性。CRMP-1的表达于CL1-5细胞抑制了体外侵入性能力。为使伪转染者与CRMP-1转染克隆(B5，C6，C8，C10，与C22)相对侵入性比较更清楚，所有数值以相对于伪转染者(100％)之侵入性百分比标准化。每一株皆经过三次重复试验。于48小时培养后，显示CRMP-1表达克隆显著减少(40％至60％)侵入潜在性(P＜0.01)。然而，有一CRMP-1之阈值，超过时就没办法更抑制侵入性的发生了。
肿瘤细胞必须完成一复杂系列步骤才得以侵入与转移；所有基础步骤之一为细胞生长。采用修饰过MTT试验测量CRMP-1转染株与伪转染者的体外细胞生长率。结果显示改变CRMP-1表达并没有显著改变体外增生，这代表CRMP-1可能经过非细胞增生控制的机制调节细胞侵入性。
在CRMP-1过量表达细胞中会改变F-肌动蛋白聚合反应F-肌动蛋白在活动性细胞会持续地聚合与分解(Symons & Mitchison(1991)J Cell Biol 114503-13)。肌动蛋白聚合反应与活动性细胞中暂时性及空间性板状突出(lamellar protrusion)相关并在细胞活动时扮演关键性角色(Cooper(1991)Ann Rev Physol 53585-605)，因此影响细胞侵入性。鬼笔毒环肽(phalloidin)紧密结合于纤毛的肌动蛋白亚单位，但不结合于单体。以若丹明结合之鬼比毒环肽染色CL1-0、CL1-1、CL1-5、与CL1-5-F4并于荧光显微镜下观察细胞。纤毛足(filopodia)数量于CL1-0与CL1-1少于CL1-5与CL1-5-F4。转染克隆的F-肌动蛋白也染色。观察CRMP-1转染克隆显示在较低侵入性细胞中具有较高表达水平且变为圆形。在伪转染者检测到许多纤毛足，同在母株CL1-0的情形。有趣的是，CRMP-1转染CL1-5显示其纤毛足突出明品地减少，类似于在CL1-0的情形。
CRMP-1在细胞内的动态分布以及CRMP-1与分裂纺锤体的相关性为测定在细胞生命史不同阶段时CRMP-1在细胞内的定位，整段CRMP-1cDNA编码区克隆到一哺乳类转染载体以于CL1-0与CL1-5表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的CRMP-1。以激光扫描同位显微镜获得的荧光影像显示EGFP-标记的CRMP-1于CL1-0与CL1-5的分布相同。在间期(interphase)，某些CRMP-1蛋白聚集在中心体。在后期(metaphase)中，CRMP-1大部分与分裂纺锤体强烈相关，且亦聚集于中心体。在末期(anaphase)中，CRMP-1维持其与分裂纺锤体的相关联。在非常后期的尾期(telephase)中，其聚集于中间体(midbody)。
在肺癌组织的CRMP-1 mRNA表达与肺癌病患的术后复发及存活率相关采用实时定量RT-PCR以定量CRMP-1转录物复制数目。阈值循环(CT)定义为由探针切割超出基础值上之一固定阈值而产生荧光的部分循环数目。于一选择的阈值，一较小开始复制数目会造成一较高CT值。于此研究中，采用TATA-盒