专利名称：一种肌内脂肪沉积fitm2基因的制作方法近年来，由于猪的选育工作中过度追求高瘦肉率，导致猪肉品质的严重下降。随着生活水平的不断提高，人们对猪肉颜色、嫩度、风味等肉品质特性的要求也越来越高。肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)是影响肉品质的重要因素之一，目前已得到越来越多的认识和重视。肌内脂肪的沉积是一个复杂的生理生化过程，主要依赖于肌内脂肪细胞的增殖、 分化和聚酯成熟。在脂肪细胞分化与增殖的过程中，细胞内脂肪的合成、分解与转运等过程决定甘油三酯的含量。细胞内的甘油三酯主要存在于脂滴当中，脂滴是维持细胞能量稳衡的重要的细胞器。脂滴的核心是由甘油三酯和胆固醇酯形成的脂核，脂滴表面包被单层磷脂膜，且覆有多种蛋白。细胞内脂滴储存脂肪的过程是最基本的生物学过程，但是细胞内脂肪如何被“打包”形成脂滴，即细胞是如何调控磷脂蛋白层包装脂肪成为脂滴一直未得到满意的解释。诱导脂肪储存跨膜蛋白(Fatstorage-inducing transmembrance protein, FITM) I 和 2 基因，又称 FITl 和 FIT2 (Fat-inducing transcript I and 2)，是两个将脂肪包被成脂滴的关键基因。FITM基因与脂肪的合成无关，但是在脂滴储存方面却发挥了重要的作用。研究发现，在人类细胞中，过度表达FITM基因会导致脂肪储存明显增加，在小鼠体内敲除FITM基因会明显减少脂滴内的脂肪储存。在人体细胞中过表达FITMl和FITM2， 发现过表达细胞与正常细胞在脂肪合成速率方面没有任何差别，但在脂滴储存方面，过表达细胞中的脂滴数量是正常细胞的4一 6倍，这些研究进一步证明了该基因在脂肪储存过程中的重要性。FITM2基因在人、猪、鼠等动物中已被定位和标记。由于FITM基因编码的蛋白较小，所以关于其功能的研究并不多。研究揭示FITM2编码的蛋白质结构包含多个跨膜区域， 这样的特殊结构与脂滴的包被形成密切相关。随着FITM基因在脂肪滴打包形成过程中的重要作用被发现，针对FITM基因的研究引起了学界的重视。最新的研究显示FITM2基因在骨骼肌能量代谢的调节中发挥重要作用，且参与了骨骼肌内的脂滴形成。因此，FITM2基因的研究对调控畜禽肌肉能量代谢及肌内脂肪蓄积，改善肌肉品质具有重要的意义。目前 FITM2基因的表达对猪肌内脂肪沉积和脂类代谢的影响及调节机理，国内外尚未见报道。
本发明的目的是提供一种肌内脂肪沉积FITM2基因，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现FITM2基因参与肌内脂肪含量相关，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 FITM2基因。具体为一种肌内脂肪沉积FITM2基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的诱导脂肪储存跨膜蛋白2 (Fat storage-inducing Transmembrane protein 2，FITM2)基因。基因的CDS序列全长为789bp,其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且， CDS核苷酸序列编码262个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积FITM2基因设计引物，进行PCR扩增，检测FITM2基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FITM2基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明FITM2基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。猪是脂肪沉积型动物，其脂肪沉积能力在不同品种之间变化很大。我国一些肉质优良的地方猪种是最宝贵和稀缺的基因资源，这在优质猪肉的培育中有独特的利用价值。 版纳微型猪是云南省优良的地方猪种，具有耐粗饲、适应性强、肉质优良、肌内脂肪丰富，肌纤维细密，肉质鲜嫩等优良特性。然而，目前对版纳微型猪的生长发育及肌内脂肪沉积的分子机制知之甚少。本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现FITM2基因在一定程度上决定着肌内脂肪含量，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 FITM2基因。因此，研究版纳微型猪FITM2基因的序列与表达模式，分析其核苷酸和氨基酸序列结构，从分子水平了解版纳微型猪肌内脂肪沉积较多的规律，为进一步研究该基因的功能及为改善猪胴体脂肪性状的育种工作提供理论基础。本发明克隆得到版纳微型猪FITM2基因CDS全序列，全长为789bp，提交到 Genbank，登录号为JN630475。与Genbank提供的猪FITM2基因相比较，发现有两个核苷酸突变位点，其中一个为有义突变，导致第245位氨基酸由胱氨酸突变为丝氨酸。FITM2蛋白在物种间的同源性较高，猪与牛的亲缘性较近，其次是人、小鼠、大鼠。 猪FITM2蛋白氨基酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的同源性分别为93%、91%、87%和87%。FITM2 蛋白在不同物种间的高度保守性提示它们功能的重要性，这些基因的保守性也是FITM2在各个物种中相应的生理特点保持不变的分子基础。另外，FITM2在脂肪组织中的最高量表达，也证明了它在肌内脂肪沉积等方面的重要作用。图I是本发明的PCR扩增FITM2基因图示。图2是本发明的FITM2基因在不同组织中的表达水平柱图。图3是本发明的FITM2基因酶切鉴定图示。图4是本发明的进化树分析图。图5是本发明的FITM2蛋白二级结构预测图。图6是本发明的FITM2蛋白磷酸化位点预测图。图7是本发明的FITM2蛋白糖基化位点预测图。图8是本发明的FITM2蛋白疏水性分析图。图9是本发明的FITM2蛋白的信号肽预测图。图10是本发明的FITM2蛋白质的跨膜螺旋分析图。图11是本发明的FITM2蛋白质的跨膜区分析图。

I、肌肉组织中总RNA的提取
采取50kg成年版纳微型猪肌肉组织立即放入液氮中保存备用。利用RNA提取试剂提取版纳微型猪肌肉组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行。将提取的RNA反转录成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物设计及PCR反应条件
根据 GenBank 中猪 FITM2 序列信息(GenBank 登录号 NM_001128460. I),利用 Primer Premier 5.0设计引物，并合成。用于克隆的FITM2基因的引物序列为
F :5，- GGCATGGAGCACCTGGAG -3，
R:5’ - CCCTTGTGCACCTCTTTTATC -3’
用于荧光定量的FITM2基因的引物序列为
F :5，- AGGTGAAGACGGACCGAAGC -3，
R :5，- AGCCCAGTAGCCCGAACA -3，
内参18S rRNA的引物序列为
F :5’ -CTGCCTTCCTTGGATGTG -3’
R :5’ -GCGGCTTTGGTGACTCTA -3’
FITM2基因克隆的PCR反应条件为94°C预变性4min ;94°C变性30s、54. 2°C退火 30s,72°C延伸30s 35个循环；72°C后延伸IOmin进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定其亮度和特异性。通过PCR扩增，得到了长度为808bp的片段。PCR扩增产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增的产物的长度大小同于目的片段大小。荧光定量PCR的反应条件为95°C预变性30s ;95 °C变性5 s，65°C退火30s、 72°C延伸30 s，40个循环。数据处理的方法为，检测心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪七个组织中FITM2基因的相对表达量，实验数据以18S rRNA作为内参，采用双标准曲线法处理。结果显示，FITM2在被检测的7个组织中都有表达，在脂肪组织中高量表达，在肾、肌肉、肺和脾中大量表达，在心和肝中少量表达。3、FITM2基因的克隆及序列分析
按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒书说明书回收特异性条带，产物连接于pMD-18T载体，转化至ToplO感受态细胞，氨苄筛选挑取阳性克隆，分别接种于IOmL LB液体培养基中， 37°C振荡过夜，提取质粒经Ecor I和Hind III双酶切鉴定为阳性，进行测序。4、测序结果
5所得到的版纳微型猪FITM2编码区(CDS)全长789bp，核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，并提交到Genbank数据库，登录号为JN630475。⑶S序列编码262个氨基酸，其氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。5、测序结果与Genbank中提供的序列比对
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪的核苷酸序列同 GeneBank中猪FITM2基因(登录号为NM_001128460. I)的⑶S序列进行序列比对。结果发现有两个突变位点，即第324位核苷酸由G变成A，第733位由G变为A。第二个为有义突变，导致氨基酸序列发生相应变化，即第245位的氨基酸由G (胱氨酸)突变为S (丝氨酸)。核苷酸序列和氨基酸序列比对详见说明书核苷酸和氨基酸序列表。6、FITM2基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析
登录 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪 FITM2 基因测序结果与牛(登录号为NM_001103095. I)、人(登录号为NM_001080472. I)、小鼠(登录号为 NM_173397. 4)和大鼠(登录号为NM_001107799. 1)FITM2基因的核苷酸和氨基酸序列比对分析，结果显示版纳微型猪与牛、人、小鼠和大鼠的FITM2基因的CDS序列同源性分别为 92%,88%,85%和86% ;CDS序列所编码氨基酸的同源性分别为93%、91%、87%和87%。CDS序列的同源性和CDS序列编码氨基酸的同源性比较详见说明书核苷酸和氨基酸序列表。7、FITM2基因的进化树分析
利用Meg4软件的邻近(Neighbor-joining)方法构建版纳微型猪(Genbank登录号 JN630475)、牛(登录号为NM_001103095. I)、人(登录号为NM_001080472. I)、小鼠(登录号为NM_173397. 4)和大鼠(登录号为NM_001107799. 1)FITM2蛋白的系统进化树，结果显示版纳微型猪与人的亲缘性较近，其次是牛、小鼠、大鼠。8、FITM2蛋白分子量、等电点预测分析
使用ExPASy的在线软件Compute pi/MW分析版纳微型猪FITM2蛋白的等电点(pi)为 9. 05、理论分子量(pW)为 29662. 73 Da。9、FITM2蛋白质二级结构预测分析
登陆http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,对版纳微型猪FITM2蛋白质二级结构进行预测，共有153个螺旋、2个伸展链和107个卷曲结构。10、FITM2蛋白质磷酸化位点预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,对猪 FITM2 蛋白质憐酸化位点进行预测，结果显示，共有11个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有5个、苏氨酸磷酸化位点有3个、酪氨酸磷酸化位点有3个。11、FITM2蛋白质糖基化位点预测
登录 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,对版纳微型猪 FITM2 蛋白糖基化位点预测，结果显示FITM2蛋白在第215位有I个糖基化位点。12、FITM2蛋白质疏水性分析
登陆http://web. expasy. org/protscale/,对FITM2蛋白质疏水性进行分析,结果显不为未水性蛋白。13、FITM2蛋白质信号肽的预测分析
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/,对 FITM2 蛋白的信号肽进行预测。采用signalP-ΝΝ方法预测，FITM2蛋白序列存在一个可能的信号肽结构，且分割位点在第 29至30个氨基酸之间，即第I至29位氨基酸为信号肽。用signalP-HMM方法预测则显示信号肽可能存在的分割位点在第38至39个氨基酸之间。14、FITM2蛋白质的跨膜螺旋分析
登陆 http://www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html,对 FITM2 蛋白的跨膜螺旋进行预测。结果显示在FITM2蛋白质氮末端有6个跨膜螺旋在31- 49 (19)位氨基酸、104-120(17)位氨基酸有跨膜螺旋，方向从外到内；在67- 87 (21)位氨基酸、 160-181(22)位氨基酸、194-214 (21)位氨基酸、228-247 (20)位氨基酸有跨膜螺旋，方向从内到外。15、FITM2蛋白质的跨膜区分析
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/,对 FITM2 蛋白质跨膜区进行分析，结果显示FITM2蛋白质有4个跨膜区，分别为第55至77位氨基酸区域、第92至114位氨基酸区域、第183至205位氨基酸区域和第220至239位氨基酸区域。


本发明公开一种肌内脂肪沉积FITM2基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的诱导脂肪储存跨膜蛋白2(Fatstorage-InducingTransmembraneprotein2,FITM2)基因，基因的CDS序列全长为789bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列编码262个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。检测FITM2基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FITM2基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明FITM2基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。