专利名称：中药冬凌草有效部位抗肿瘤药物提取物及其制备方法 冬凌草，又名冰凌草，学名Tabdosia rubescens(hemsl.)，系唇形科香茶菜属多年生草本或亚灌木植物，在我国河南、河北、山西、四川等地有广范分布，收录于《中国药典》1977年版第一部和《卫生部中药材标准》1992年版。冬凌草味甘苦，性微寒，具有清热解毒，消炎止痛，健胃活血等功效，文献记载可以用于治疗急慢性扁桃体炎、咽喉炎、口腔炎等疾病。现已有市售冬凌草片、冬凌草糖浆等药品，主要治疗口腔炎症。此外，冬凌草还具有对金黄葡萄球菌、肺炎双球菌、乙型链球菌等有小剂量抑制，大剂量杀伤的作用等其它功效。近年来发现冬凌草还具有抗肿瘤活性。冬凌草的醇提物对Hela细胞有明显抑制作用；对艾氏腹水癌在10g/Kg浓度下注射，肿瘤抑制率可达到60％。临床实验表明，冬凌草对食管癌，贲门癌，肝癌等的治疗也有一定疗效，表现为食欲增加，疼痛减轻，瘤体缩小。经检索，发现科技文献公开了一些研究冬凌草提取工艺及冬凌草的药理并将冬凌草应用于临床治疗的文章，现摘录如下1、冬凌草叶提取工艺研究《时珍国医国药》.2001，12(4).文摘目的探讨以95％乙醇对冬凌草叶进行提取的最佳条件。方法正交试验，以HPLC法测定提取中冬凌草中甲素的含量为指标进行，提取时间4h(提取两次)，加95％乙醇比10∶1，提取温度70℃。结论该方法提取冬凌草叶效果较好。2、中压柱层析法提取分离冬凌草甲素的新工艺《黑龙江医药》.2001，14(1).文摘采用中压柱层析法提取分离冬凌草甲素，具有洗脱速度快，分离效率高，溶剂无毒无污染，安全、价廉、易得等优点。经重结晶后用薄层扫描法测定含量达99.28％，是一种简便易行的方法。3、冬凌草甲素抗突变性研究《癌变.畸变.突变》文摘目的探讨冬凌草甲素的抗突变作用。方法采用Ames试验及小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。结果冬凌草甲素在未加S9条件下，对TA98及TA100回复突变具有明显的抑制作用，其最高抑制率分别达89.1及80.2％，对由环磷酰胺(CP)诱导的小鼠骨髓PCE微核发生率也有显著的拮抗作用(P＜0.01)。结论冬凌草，甲素在本实验条件下具有抗突变活性。4、冬凌草素的抗癌分子病理与临床应用策略《广东药学》.2000，10(4).文摘冬凌草素是我国首先从民间草药冬凌草(Raddosia rubescens)发现的新结构化合物，是一个具有特效低毒的抗癌新药，尤其对食管癌和贲门癌有效。本文综述了近年来关于冬凌草素是研究的最新成果，从分子药理学与肿瘤生物学角度探讨了该药物抗癌作用的分子机制，抗癌活性与化合物结构的关系，以及冬凌草素与化疗药物如博来霉素的协同增效作用。5、冬凌草甲素对活性氧自由基的清除作用《河南医学研究》.1999，8(2).文摘研究冬凌草甲素对不同模型系统产生的活性氧自由基的清除作用。方法自由基检测用电子处旋共振自由基旋捕集技术和化学光法。结果二种方法检测均发现Orid明显清除黄嘌呤/黄嘌呤氧酶系统产生的超氧自由基以及Fenton反应中的羟自由基(-OH)，Orid170mol/l对O-2和-OH的清除率分别为49.4％和75.2％。Orid对多形核白细胞(PMN)呼吸爆发明产生活性氧自由基同样显示明显清除作用。
6、冬凌草甲素及其乙酰衍生物的电子结构与抗癌活性《郑州大学学报》自科版1998，30(1)文摘本文用MNDO方法在VAX8350计算机上对冬凌草甲素及其乙酰衍生物进行了量子化学计算研究，给出了轨道及其能级，电荷密度，并对其电子结构与抗癌活性的关系进行了讨论。
7、冬凌草的研究进展《中国药学杂志》.1998，33(10).文摘目的对冬凌草近30年来在化学、药理等方面的研究进展进行综述。方法查阅1997年以前医药中文资料和美国CA资料的研究成果，综述了冬凌草的主要化学成分、提取工艺、含量测定法、药理学和临床应用。结果主要成分为贝壳杉烯类二萜，不同产地的冬凌草含有有不同的二萜成分，冬凌草甲素具有多方面的生理活性。结论冬凌草一定的抗癌作用，且毒、副作用小，可望开发成新的抗癌药，造福于人类。
8、冬凌草乙素的电子结构与抗癌活性《河南医科大学学报》.1998，33(3).文摘采用MNDO方法，在VAX8350计算机上，对冬凌草乙素进行量子化学计算。给出了分子轨道及其能级，电荷密度，键级。结果表明抗癌活性区α-亚甲基环戊酮结构中的部分原子组成了易接受电子的πLUMO轨道，易在该区域发生亲核加成反应。
9、冬凌草不同提取工艺的研究《中草药》.1997，28(7)文摘对冬凌草不同提取工艺进行了研究，并以冬凌草甲素为指标分别对其进行了含量测定。结果表明，破碎提取法较其它提取法提取的冬凌草甲素含量为最高。
10、冬凌草治疗食管癌，贲门癌54例临床疗效观察《河南肿瘤学杂志》.1993，6(3).文摘用冬凌草治疗食管肿瘤、贲门肿瘤，并观察其疗效。
11、冬凌草甲素的晶体结构《结构化学》.1992，11(6).文摘对冬凌草甲素的晶体结构进行分析，及介绍其作为抗癌药的应用。
12、冬凌草的新药源探讨《河南科学》.1989，7(3).文摘从冬凌草提取得到的四环二萜，可以作为抑菌、抗肿瘤的药源。
13、抗癌药物冬凌草甲素的分子构型研究《化学学报》.1992，50(5).文摘分析了冬凌草甲素的分子构型，对其抗癌性能进行研究。
14、冬凌草甲素衍生物及其制备方法，中国专利，申请号，99101179，申请人，郑州大学文摘本发明在不破坏冬凌草甲素活性中心的前提下，通过改变α-环外亚甲基环戊酮的张力和溶解度，提供了在通式1中R↑[1]为H或C1～C12的烷基或酰基，或为葡萄糖基、或半乳糖基、或木糖基，R↑[2]为H或葡萄糖基、或半乳糖基、或木糖基，或甘露糖基；在通式2中R↑[1]为H或C1～C12的烷基或酰基；R↑[2]，R↑[3]分别为C2～C18的烷基，或为异丙叉基、苯甲叉基。所示的冬凌草甲素衍生物这种冬凌草甲素衍生物具有更高的抗肿瘤细胞活性。同时，本发明还提供了上述化合物的制备方法。
从上述检索结果了解到，医疗单位和中药科研部门对冬凌草进行的研究是冬凌草甲素、冬凌草乙素、冬凌草甲素衍生物、贝壳杉烯类二萜的化学结构及抗癌作用，文献中给出冬凌草部分萜类化合物的结构为冬凌草甲素和冬凌草乙素。
冬凌草甲素 冬凌草乙素但文献中并未全部公开冬凌草其它有效成分，也未给出冬凌草其它有效成分在治疗恶性肿瘤上的应用。
技术内容本发明人经过研究和试验，对冬凌草用各种不同的方法进行提取，分析提取物的成分，特别是冬凌草提取物中的萜类化合物，除了得到冬凌草甲素、冬凌草乙素、冬凌草甲素衍生物以外，还得到了一些区别于公开文献的化学物质，将这些化学物质用于治疗恶性肿瘤，收到了更好的效果。
本发明的技术方案如下具有抗肿瘤的冬凌草有效部位提取物包括冬凌草总萜，它包括冬凌草甲素(rubescensinA)及衍生物、冬凌草乙素(rubescensin B)、冬凌草丙素(rubescensin C)、冬凌草丁素(rubescensin D)、冬凌草戊素(rubescensin E)和冬凌草辛素(rubescensin F)等二萜类化合物和齐墩果酸和熊果酸等三萜类化合物。该提取物中冬凌草总萜含量在50％以上，最好不低于55％。具体含量可以通过化学方法或仪器分析确定。
本发明人通过结构分析还发现，冬凌草素均系贝壳杉烯骨架四环二萜类化合物，其结构中与环外亚甲基共轭的环戊酮结构是其生理活性中心，裂环或亚甲基饱和则会使其作用失效。其他一些基团起着增强活性的作用，如冬凌草甲素由于具有6-位羟基和15-位羰基形成的氢键而具有更高的活性，这些特性公开文献未见报道。
本发明提供了上述冬凌草总萜的制备方法，这些制备方法比起现有的提取方法更能有效地得到全面的化合物。
本发明还提供了冬凌草总萜制成医药上习用的制剂，并作为治疗恶性肿瘤的有效化合物的应用，这些恶性肿瘤包括肝癌、食管癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等。
以上所述的医药上习用的制剂，包括针剂和口服剂，其中口服制剂包括胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂、缓释剂、口服液等；针剂包括各种水针剂和粉针剂。
以上所述的具有抗肿瘤的冬凌草有效部位提取物(冬凌草总萜)提取的方法包括以下步骤1、用乙醇溶液或复合溶剂回流提取粉碎后冬凌草3-4次，溶剂用量为原料的5-8倍，获得冬凌草粗提物；2、合并粗提物，减压浓缩回收溶剂，浓缩至相对密度1.05-1.10；3、将上述浓缩后的提取物用石油醚萃取，脱去脂和色素，残留物用乙醚萃取3-4次；4、合并乙醚萃取物，回收乙醚，得冬凌草总萜粗提物；5、将冬凌草总萜粗提物用低碳醇溶解，过大孔吸附树脂柱，以梯度10-80％乙醇溶液为流动相进行洗脱。用TLC方法监测流出产物，收集含冬凌草总萜的流出产物；6、合并洗脱液，减压浓缩去除溶剂，冷冻或喷雾干燥至粉，得冬凌草总萜。如此时再加入热丙酮溶液重结晶，可以得到较纯的单体化合物。
上述提取步骤1中，冬凌草总萜的提取可以采取冷浸提取法、渗漉提取法、超声破碎提取法、回流提取法等。所用提取溶剂有不同浓度的乙醇、乙醚、丙酮或它们的混合物等。本发明优选回流提取法，采用溶剂为70-95％乙醇溶液。
上述提取步骤3中，冬凌草粗提物的脱色可以采用有机溶剂提取和活性炭吸附等方法，本发明小批量提取时优选石油醚萃取法，大批量生产时，采取活性炭吸附脱色法。
上述提取步骤5中，柱层析分离纯化，可以采取以中性和极性大孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、离子交换树脂为填充料进行吸附，本发明优选大孔吸附树脂。所用洗脱液可以是乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、石油醚或它们的混合液及水溶液。本发明优选乙醇水溶液。当乙醇浓度增加到50％后可以得到以冬凌草甲素为主的产品，且色素及其它杂质很大程度上被吸附去除。
上述提取步骤6中，减压浓缩优选温度为50-60℃，真空度为400-600Mpa。对于干燥条件，可以采用真空干燥、常压蒸汽干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。本发明优选冷冻干燥和喷雾干燥。
根据本发明的技术方案，其中药剂型可以是注射针剂和口服剂，其中口服制剂包括胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂、缓释剂、口服液等；针剂包括各种水针剂和粉针剂。在制备口服制剂时，选用的辅料可以是淀粉、羧甲基纤维素、环糊精、蔗糖、硬脂酸镁、聚乙二醇、等常规填充剂，可采用药剂学常规制备工艺；在制备注射制剂时，可以采用加入脂质体、聚乙二醇、药用酒精、去氧胆酸、胆固醇等常规填充剂，可采用药剂学常规制备工艺，故在此不祥述。
本发明优选的是注射针剂，特别是脂质体水针剂和冻干粉针剂。
为保证药物的质量，在生产过程中需要对冬凌草主要有效成分进行监控。本发明提出一套可行的质量控制方法。
薄层层析(孔C)方法通过TLC，可以对提取液和柱层析洗脱液中主要活性成分进行控制。TLC条件展开剂为氯仿∶丙酮＝8∶1-2，用50％硫酸乙醇显色。
高效液相色谱(HPLC)法通过HPLC，采用外标法测定最终产品中单个有效成分含量。HPLC条件设备Waters 600，Waters 996泵，Photodiode Array Detector检测器；色谱柱Dikma，Diamonsil C18，4.6mm*25cm；流动相甲醇∶水＝60∶40(V∶V)；检测温度室温；检测波长240nm；流速0.8ml/min。
本发明与现有技术相比，其突出的实质性特点和显著的进步是1、用新的提取方法，能够全部将冬凌草的总萜提取出来，得到了一些区别于公开文献的化学物质。
2、凌革总萜的化合物功能全面，可以发挥其抗各种癌细胞的作用，使药物的治疗有效性得以提高。
3、抗癌谱广，高效低毒；药材来源丰富，价格便宜；有效成分明确；产品质量可控。
4、药物的质量更能保证。
5、生产工艺简便，采用柱层析分离纯化技术，更易于工业化生产。


图1为冬凌草甲素对照品HPLC图。
图2是冬凌草甲素标准曲线图。
从图1可知，通过HPLC，采用外标法可以测定最终产品中单个有效成分含量，如图中冬凌草甲素对照品纯度大于99％，无其他杂质(Rt＝3.2为溶剂峰)。
图2可知，测定冬凌草总萜含量可以采用紫外分光光度(UV)法通过UV法，测定最终产物中总萜含量。采用冬凌草甲素为标准品，配制不同浓度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制标准曲线。得回归方程Y＝20.156X+0.0119。然后精密称定供试品，溶解，紫外分光光度计测吸光度值，代入回归方程，计算得含量。

制备实施例一取冬凌草(含茎和叶)药材，粉碎，过筛，加入6倍体积的95％乙醇，回流提取3小时。重复提取两次，合并提取液。减压浓缩回收溶剂，浓缩至相对密度1.05-1.10。将上述浓缩后的提取物用3倍体积的石油醚萃取两次，脱去脂和色素。残留物用乙醚萃取3-4次，合并乙醚萃取物，回收乙醚，残留物用90％乙醇醇溶解，上清液过大孔吸附树脂柱，以梯度10-80％乙醇溶液为流动相进行洗脱。用TLC方法监测收集含冬凌草总萜的流出产物。合并洗脱液，减压浓缩，干燥得冬凌草总萜。
制备实施例二取冬凌草(含茎和叶)药材，粉碎，过筛，加入5倍体积的乙醚，回流提取3小时。重复提取两次，合并提取液。减压浓缩回收溶剂，浓缩至相对密度1.05-1.10。将上述浓缩后的提取物用活性炭吸附，脱去脂和色素。残留物用乙醚萃取3-4次，合并乙醚萃取物，回收乙醚，残留物用90％乙醇醇溶解，上清液过大孔吸附树脂柱，以梯度10-80％乙醇溶液为流动相进行洗脱。用TLC方法监测收集含冬凌草总萜的流出产物。合并洗脱液，减压浓缩，干燥得冬凌草总萜。
应用实施例一冬凌草总萜对人乳腺癌细胞MCF7的抑制作用人乳腺癌细胞MCF7，置于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃，5％CO2饱和湿度培养，第2天传代一次。实验时用培养基稀释药液，最终用药浓度为50μg/ml。将生长到对数期的不同肿瘤细胞用消化液消化成细胞悬液，并以每孔103-104个细胞，200μl的量接种到96孔培养板。24小时后，移去培养板孔中的培养基，换之以新鲜的活性肽药液，每孔200μl。加药处理后分别培养3天，然后每孔加入20μl的MTT溶液，37℃继续培育4小时。小心去除孔内培养物的上清，然后每孔加入200μl的DMSO，水平摇床上震荡20分钟，保证结晶充分溶解。在490nm处检测各孔的光吸收值，计算抑制率。结果表明，在药物浓度大于40μg/ml时，冬凌草总萜对人乳腺癌细胞MCF7的抑制率均大于50％。当药物浓度为50μg/ml时，抑制率为92％。
应用实施例二冬凌草总萜对对人肺癌细胞A549的抑制作用把冬凌草总萜用DMSO溶解，配成20mg/ml母液，-20℃保存备用。实验时用培养基稀释，最终用药浓度为100μg/ml。将生长到对数期的不同肿瘤细胞用消化液消化成细胞悬液，并以每孔103-104个细胞，200μl的量接种到96孔培养板。24小时后，移去培养板孔中的培养基，换之以新鲜的活性肽药液，每孔200μl。加药处理后分别培养3天，然后每孔加入20μl的MTT溶液，37℃继续培育4小时。小心去除孔内培养物的上清，然后每孔加入200μl的DMSO，水平摇床上震荡20分钟，保证结晶充分溶解。在490nm处检测各孔的光吸收值，计算抑制率。结果表明，在药物浓度为40μg/ml时对人肺癌细胞的抑制率为74％，并呈一定的量效关系。
应用实施例三冬凌草总萜对其他肿瘤细胞的抑制作用采用同实施例二、三类似方法，进行冬凌草总萜对人食管癌细胞EC9706、人肝癌细胞HepG2和小鼠黑色素瘤细胞K1735M2的抑制作用实验。结果表明，在药物浓度为40μg/ml时对食管癌细胞EC9706、肝癌细胞HepG2和小鼠黑色素瘤细胞K1735M2的抑制率分别为61％、67和78％，并呈一定的量效关系。
应用实施例四冬凌草总萜对艾氏腹水瘤小鼠的影响在无菌条件下从小鼠腹腔腹水中取瘤，稀释，混匀后消毒接种小鼠腹腔，每支0.2ml，约含瘤细胞1×106个。24h后随机分为对照组(生理盐水)，环磷酰胺组和冬凌草总萜小剂量(10mg/kg)组、中剂量(20mg/kg)组、大剂量(40mg/kg)组。静脉给药，每天1次，共7天，观察每组小鼠的平均生存时间，计算生命延长率。实验结果表明，冬凌草总萜小剂量(10mg/kg)组、中剂量(20mg/kg)组、大剂量(40mg/kg)组均能明显延长艾氏腹水瘤小鼠生存时间，生命延长率均大于50％。
应用实施例五冬凌草总萜对小鼠实体瘤的抑制作用按照实施例五类似方法，采用小鼠右后肢皮下接种S180实体瘤细胞悬液，用上述冬凌草总萜按10mg/kg体重静脉给药，结果表明对S180实体瘤的抑制率为68.3％。
应用实施例七片剂制备按照处方，将冬凌草总萜粉碎，过筛，称取40g，加入淀粉、乳糖混合均匀，加入60％酒精制软材，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压制成1000片，包糖衣，干燥即得。每片含药物组合物40mg。
应用实施例八胶囊制备称取40g粉碎，过筛处理的冬凌草总萜，加入淀粉和硬脂酸镁，混合均匀，填充胶囊，每粒含组合物40mg。
应用实施例九颗粒剂制备称取粉碎，过筛处理的药物组合物、蔗糖粉、糊精及适量乙醇，搅拌混匀，制粒，干燥，整粒，分装，成品。每包重5g。
应用实施例十软胶囊制备称取粉碎，过筛处理的药物组合物、植物油，充分混合，胶体磨磨匀，置于全自动软胶囊机充填，干燥，即得。每粒含药物组合物40mg。
应用实施例十一脂质体注射液制备按照处方，称取药物组合物、大豆卵磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠，混合均匀，加入无水乙醚，薄膜蒸发仪旋转蒸发，直至形成均匀薄膜。然后加入缓冲溶液，继续水化2h，超声，超滤。加注射用水，灌装。


本发明属于一种中药制剂，特别是中药冬凌草有效部位组合物及其制备方法，它是将冬凌草原料粉碎后经醇提，浓缩、萃取，得冬凌草总萜粗提物，再溶解、洗脱，冷冻或喷雾干燥成粉，得冬凌草总萜，然后按药物生产制得针剂和口服剂。本发明药物可用于治疗包括肝癌、食管癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等恶性实体瘤，疗效显著，无毒，无副作用，产品质量可控。