一种具抗肿瘤协同增效作用的药物组合物的制作方法[0002] 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。比起普通的放疗、化疗、激素治疗等方法，分子靶向治疗药物的先进性在于其可以针对性地杀死恶性肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生存。[0003]基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)是近年来备受关注的肿瘤相关抗原，它在多种肿瘤组织中大量表达，是在细胞外基质降解中发挥着重要作用的一类特异蛋白水解酶。IV型胶原酶属于基质金属蛋白酶的一种,包括MMP-2和MMP-9两种组分，其能够破坏基底膜及细胞外基质的完整性，参与肿瘤生长、侵袭和转移。大量证据表明，抑制MMPs的表达或活化，能够有效地抑制肿瘤的发生、发展、转移及复发。因此，近年来开发MMPs的靶向药物或抑制剂已成为肿瘤靶向治疗的重要途径。[0004]本实验室以往的研究，提供了一种靶向IV型胶原酶的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE(中国发明专利CN101475643A，2009年7月8日)，其特征是，由连续的2个抗IV型胶原酶单抗3G11的单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团组成。该强化融合蛋白具有肿瘤组织亲和力高、肿瘤杀伤活性强的特点。其中，未强化的融合蛋白dFv-LDP主要发挥了与肿瘤组织靶向结合的功能。考虑融合蛋白dFv-LDP能够与肿瘤中IV型胶原酶结合，并且在以往的研究中显示融合蛋白dFv-LDP也有一定的抑瘤效果，其可能成为一种用于肿瘤治疗的靶向药物。但是，并没有关于将融合蛋白dFv-LDP与其它药物联合用于抗肿瘤研究的报道。[0005]强力霉素(DoXyCyCline，D0X)是一种半合成四环素类抗生素，长期以来主要用于抗菌治疗。后来一些学者发现，强力霉素除了抗生素活性，它还具有抑制基质金属蛋白酶的活性，从而用于结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤及白血病等多种抗肿瘤研究。结果表明，强力霉素可通过抑制MMPs活性产生抗肿瘤增殖效应，还具有细胞周期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞侵袭能力和抑制肿瘤转移的作用。同样，至今还没有关于联合强力霉素与靶向基质金属蛋白酶的融合蛋白及其应用的报道。[0006]基质金属蛋白酶是肿瘤治疗的潜在靶点之一，本实验室在研究中发现，将基因工程靶向抗体与小分子抑制剂联合起来，在体内外可明显增强抗肿瘤疗效。为进一步提高抑瘤效果，该实验还选用了抗代谢化疗药物进行组合。如吉西他滨是一种二氟核苷类抗代谢物抗癌药，临床上主要用于治疗胰腺癌、非小细胞肺癌等。吉西他滨常与其它药物联用以取得更好的临床效果。但是，依然没有见到联合吉西他滨与靶向基质金属蛋白酶的融合蛋白的相关报道。[0007]本发明所述抗肿瘤协同增效药物组合，是指在靶向基质金属蛋白酶的融合蛋白和四环素类基质金属蛋白酶抑制剂联合增效的基础上，与肿瘤抗代谢化疗药物组合，这种组合，迄今尚未见有相关报道。[0008]本发明的目的是，提供一种具有协同增效作用，特别是对高表达基质金属蛋白酶肿瘤的抗肿瘤药物组合


[0009]本发明提供了一种抗肿瘤协同增效药物组合物。所说组合物是将基于抗体的靶向基质金属蛋白酶融合蛋白与四环素类抗生素组合，作为靶向基质金属蛋白酶的抑制剂，再与化疗药物联合应用，以达到肿瘤治疗的协同增效目的。
[0010]本发明利用基因工程技术获得所述靶向基质金属蛋白酶的双单链抗体融合蛋白dFv-LDP,其制备方法同中国发明专利CNlO 1475643A。
[0011]本发明所述四环素类抗生素选用具有基质金属蛋白酶抑制作用的强力霉素，包括在药学上可接受的衍生物或类似物。
[0012]本发明所述化疗药物选用抗代谢类抗肿瘤药如吉西他滨。
[0013]本发明所述基质金属蛋白酶抑制剂组合物选用双单链抗体融合蛋白dFv-LDP与强力霉素组成。 [0014]本发明所述一种抗肿瘤协同增效药物组合物包括融合蛋白dFv-LDP与强力霉素的组合、融合蛋白dFv-LDP与吉西他滨的组合以及融合蛋白dFv-LDP与强力霉素联合吉西他滨的组合。
[0015]本发明组合物中所述强力霉素是指强力霉素标准品或盐酸强力霉素。
[0016]本发明组合物中所述吉西他滨是指吉西他滨标准品或注射用吉西他滨。
[0017]所述药物的剂型可以是注射剂或冻干制剂。
[0018]本发明所述肿瘤，包括但不限于肝癌或结肠癌等。
[0019]本发明所述组合物，包括所述抗肿瘤药物为有效成分，与药学上可接受的一种或多种载体。
[0020]所述药学上可接受的载体，是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物聚乙烯吡咯烷酮等；润滑剂，如滑石粉等。
[0021]本发明所述的组合物，可以采用药学领域常规的方法进行制备。
[0022]发明效果:
[0023]本发明的优点与积极效果在于:两个针对同一分子靶点基质金属蛋白酶的蛋白/抗生素组合，有显著的协同抑瘤作用，靶向基质金属蛋白酶的蛋白或抗生素分别与化疗药物吉西他滨联合使用，均可进一步提高抗肿瘤效应。将三者联合可以产生更明显的抗肿瘤增效作用，其效果明显优于单独使用所述的单个药物。



[0024]图1-Western blot法检测MMP-2在肿瘤细胞中的表达情况
[0025]图2-MTT法检测融合蛋白dFv-LDP和强力霉素对结肠癌HCT-15细胞的增殖抑制作用，数据以均数土标准差表示，*代表⑶Kl
[0026]图3-Transwell法检测融合蛋白dFv-LDP和强力霉素对肿瘤细胞迁移的抑制作用，
[0027]A:人结肠癌细胞在不同药物处理下的迁移细胞图(200 X )，
[0028]B:迁移细胞经染色和溶解后测值，数据以均数土标准差表示，**代表P〈0.05
[0029]图4-Western blot法检测融合蛋白dFv-LDP和强力霉素对肿瘤细胞中MMP-2的蛋白表达抑制作用
[0030]图5-融合蛋白dFv-LDP和强力霉素联合对小鼠移植瘤肝癌H22的协同治疗作用
[0031]A:各治疗组的肿瘤体积比较图；
[0032]B:实验期间小鼠体重记录与变化图
[0033]** 代表 Ρ〈0.05
[0034]图6-ΜΤΤ法检测融合蛋白dFv-LDP、强力霉素联合吉西他滨对人结肠癌HCT-15细胞的增殖抑制作用，**代表p〈0.05
[0035]图7-融合蛋白dFv-LDP、强力霉素及吉西他滨联合对小鼠移植性肝癌H22的增强治疗作用，**代表ρ〈0.05
[0036]图8-融合蛋白dFv-LDP、强力霉素及吉西他滨联合对人结肠癌HCT-15的增强治疗作用，**代表ρ〈0.05
[0037]实施方式:
[0038]以下所列实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0039]《实施例1》ΜΜΡ-2在人结肠癌细胞和人胰腺癌细胞中的表达
[0040]收取传代培养中对数生长期的结肠癌细胞株HCT-15、HCT-116, ΗΤ-29和胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC-UMIA PaCa-2等肿瘤细胞，细胞裂解液裂解后，用BCA试剂盒进行蛋白定量，每种细胞裂解样品按相同上样量(一般为30 μ g)制备，再取适量5 X上样缓冲液混合，沸水浴中变性5分钟后加入10%的SDS-PAGE凝胶中电泳。电泳完毕后以80V恒电压转膜，将蛋白转移至PVDF膜上。经5%牛奶封闭过夜后，用TBST润洗膜5次，每次5分钟，用兔源抗MMP-2的单克隆抗体(用IXPBS按照1:1000稀释使用)在4°C孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记的羊抗兔IgG的二抗在室温下孵育I小时(用IXPBS按照1:5000的比例进行稀释)，再次洗膜。 最后在膜上滴加化学发光增强剂(美国Millipore公司)显影并用成像系统捕获图像。
[0041]本发明主要检测了结肠癌细胞HCT-15、HCT-116, HT-29和胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2中的MMP-2蛋白表达情况(图1),各种细胞中MMP-2均有一定量的表达，但结肠癌细胞HCT-15、HCT-116、HT-29和胰腺癌细胞MIA PaCa-2中的表达相对较高。在三种结肠癌细胞中，HCT-15的MMP-2表达量最高。
[0042]《实施例2》融合蛋白dFv-LDP和强力霉素对结肠癌HCT-15细胞的增殖抑制作用
[0043]将处于对数生长期的HCT-15肿瘤细胞消化，细胞计数后铺于96孔板，24小时后加入不同浓度的药物，继续培养。48小时后，加入MTT (四氮唑蓝)37°C孵育4小时，加入DMSO(二甲基亚砜)溶解蓝紫色颗粒，在酶标仪上测570nm处吸光值。将各测试孔的OD值减去本底OD值(无细胞孔)，共设三个平行孔，取其OD均值。细胞的存活率以T/C (%)表示，T为给药组的OD值，C为对照组的OD值。细胞存活率T/C (%)=(给药组OD-本底OD)/ (对照组OD-本底0D) X 100%。计算两药相互作用系数⑶I=AB/(AXB)。AB为两药联合作用的T/C比值，A、B分别是药物单独作用组的T/C比值。协同作用指数⑶Kl时，两药有协同作用。
[0044]结果表明，人结肠癌HCT-15细胞对融合蛋白dFv-LDP和强力霉素(DOX)联合给药的敏感性更高，且在dFv-LDP浓度为100 μ g/ml, DOX浓度分别为2.5 μ g/ml及5 μ g/ml时联合，其CDI值均小于1，说明融合蛋白dFv-LDP与强力霉素(DOX)联合对肿瘤细胞的增殖有协同抑制作用(图2)。
[0045]《实施例3》融合蛋白dFv-LDP和强力霉素对肿瘤细胞的迁移抑制作用
[0046]Transwell实验技术是一种在体外模拟细胞迁移或者侵袭的装置。将Transwell小室转移至新的24孔板中，在小室和外室中分别加入100 μ L和600 μ L的无血清细胞培养基，静置于37°C培养箱预先平衡1-2小时。将传代培养的肿瘤细胞消化后得到细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞后计数，调整细胞密度为I X IO6个/mL。弃去小室和外室的平衡液，将调整好密度的细胞悬液分别取100 μ L至小室内，外室中加入含20%血清的细胞培养基。分别将融合蛋白dFv-LDP (100 μ g/ml)和强力霉素(I μ g/ml)分别加入各组中，并轻摇混匀，静置于细胞培养箱中培养。48小时后取出小室，把嵌套膜浸在IXPBS中洗一次后，放入预冷的甲醇中固定10分钟。IXPBS洗三次后放入0.1%结晶紫染色液在室温下染色30分钟。IXPBS洗三次后，用棉签拭去嵌套膜小室内侧的液体和未迁移的细胞，保留外室侧表面的细胞(为发生迁移的细胞)擦干后于镜下观察并拍照。为更客观评价转移情况，用刀片沿着嵌套膜边缘环切下膜，放入96孔板的小孔内，加入配制好的33%醋酸溶液(每孔150 μ L)溶解结晶紫，溶液变蓝色，在室温摇床上轻摇10分钟充分溶解后小心取出膜。将溶解液置于酶标仪上在0D570处测值。[0047]实验结果表明，与对照组相比，靶向融合蛋白dF_LDP(100y g/ml)能够抑制肿瘤细胞HCT-15的迁移能力，其抑制率为67.7%。基质金属蛋白酶抑制剂强力霉素DOX对肿瘤细胞的迁移抑制更明显，在DOX (I μ g/ml)时，其抑制率为58.5%。而将两者联合，其抑制细胞迁移效果增加(图3A)，抑制率为39.8% (图3B)。这说明，联合靶向MMPs的融合蛋白dFv-LDP和小分子抑制剂DOX比单独使用更能有效抑制高表达MMP-2的肿瘤细胞的迁移。
[0048]《实施例4》融合蛋白dFv-LDP和强力霉素对肿瘤细胞中MMP-2的蛋白表达抑制作用
[0049]将传代培养的人结肠癌HCT-15细胞铺于6孔板中，铺板的细胞数控制在48小时长满为佳。培养24小时待贴壁后加入蛋白及药物处理细胞，培养24小时后收集细胞。用细胞裂解液将其裂解后，制备样品，用Western blot检测每个样品中MMP-2的表达情况，具体步骤同实施例1。
[0050]实验结果表明，与对照组相比，用融合蛋白dF-LDP(100y g/ml)处理过的细胞中MMP-2降低，用DOX (20 μ g/ml)处理后的细胞中MMP-2表达量明显减少，而两者联合处理细胞24小时后，MMP-2水平降低更加明显(图4)。这说明，联合靶向融合蛋白dFv-LDP和DOX比单独使用更能抑制人结肠癌HCT-15细胞中MMP-2的表达，从而达到抑制细胞迁移和生长的作用。
[0051]《实施例5》融合蛋白dFv-LDP和强力霉素联合对肝移植瘤的协同治疗作用
[0052]小鼠肝癌H22细胞在小鼠腹腔培养扩增，取生长期的细胞计数，用生理盐水稀释成7.5 X 107ml细胞悬液，取200微升直接接种于昆明小鼠右侧腋窝皮下，次日开始给药。融合蛋白dFv-LDP经尾部静脉注射给药，于第I天和第6天给药，共两次。强力霉素DOX经小鼠腹腔注射给药，隔天一次，共5次。实验共设8组，每组10只雌性昆明小鼠，即对照组(生理盐水)、dFv-LDP 组(dFv-LDP20mg/kg)、DOX 组 I (D0X20mg/kg)、DOX 组 2 (D0X40mg/kg)、DOX 组 3 (D0X60mg/kg)、联合组 I (dFv_LDP20mg/kg+D0X20mg/kg)、联合组 2 (dFv_LDP20mg/kg+D0X40mg/kg)和联合组3 (dFv-LDP20mg/kg+D0X60mg/kg)o实验期间记录小鼠体重，于接种肿瘤后第10天结束实验。按下列公式计算肿瘤存活率(T/C%)并对各组瘤体积进行统计学处理。T/C(%)=Vt/VcX100%，其中Vt为治疗组的瘤体积，Vc为对照组的瘤体积。抑瘤率计算公式为(1-T/C)X 100%。各联合组剂量间的协同作用指数⑶I=AB/ (AXB), A=Vdpwiip/V对照，B=VD0X/V对照，AB=V联合/V对照，CDI指数>1为拮抗，=1为相加，〈I为协同，CDI≤0.7时，协同作用非常显著。
[0053]实验结果表明，将动物实验第10天的瘤体积进行统计学分析，显示融合蛋白dFv-LDP (20mg/kg)对小鼠肝癌的抑瘤率为23.1%，三种剂量(20、40、60mg/kg)的强力霉素DOX的抑瘤率分别为4.8%,32.8%和34.9%。融合蛋白dFv-LDP与三种剂量(20、40、60mg/kg)的强力霉素联合给药时，抑瘤率分别为71.2%,67.9%及80.4%，其⑶I值分别为0.39,0.62和0.39 (图5A)，这说明融合蛋白dFv-LDP与强力霉素联合给药时，对小鼠肝癌的抑瘤率明显增高，且具有协同抑瘤效应。在整个实验治疗期间，监测小鼠体重(图5B)显示，各给药组的小鼠体重无明显下降，表明小鼠能耐受所用的剂量。
[0054]《实施例6》融合蛋白dFv-LDP、强力霉素联合吉西他滨对结肠癌HCT-15细胞的增殖抑制作用
[0055]按照实施例2的操作步骤，用MTT法检测融合蛋白dFv-LDP、强力霉素及吉西他滨单独或联合对人结肠癌HCT-15细胞的增殖抑制作用。
[0056]实验结果再一次验证,融合蛋白dFv-LDP联合强力霉素能协同抑制结肠癌HCT-15细胞的增殖，其CDI值为0.9 (图6)。在此基础上，联合化疗药物吉西他滨能进一步提高抑制细胞增殖效果(P〈0.05)。
[0057]《实施例7》融合蛋白dFv-LDP、强力霉素及吉西他滨联合对小鼠移植性肝癌H22的增强治疗作用
[0058]本实验中，小鼠肝癌H22细胞的传代与接种以及统计学分析方法与实施例5相同。于小鼠皮下接种肝癌H22细胞，接种次日(第I天)开始给药，融合蛋白dFv-LDP经尾部静脉注射给药，于第I天和第6天给药，共两次。吉西他滨(GEM)经小鼠腹腔注射给药，于第I天和第6天给药，共两次。强力霉素(DOX)经小鼠腹腔注射给药，隔天一次，共5次。实验共设6组，每组10只雌性昆明小鼠，即对照组(生理盐水)、dFv-LDP组(dFv-LDP20mg/kg)、DOX 组(D0X20mg/kg)、GEM 组(GEM40mg/kg)、联合组 I (dFv-LDP20mg/kg+D0X20mg/kg)和联合组2 (dFv-LDP20mg/kg+D0X20mg/kg+GEM40mg/kg)o实验期间记录小鼠体重和瘤体积，于接种肿瘤后第10天结束实验。
[0059]实验结果显示，将动物实验第10天的瘤体积进行统计学分析，融合蛋白dFv-LDP、D0X、GEM对小鼠肝癌H22的抑瘤率分别为59.1%、26.7%,85.1%。联合组I (即dFv-LDP+DOX联合)的抑瘤率为78.7%，其协同指数⑶I值为0.71，再次验证dFv-LDP与DOX联合有协同抑瘤效果。联合组2 (即联合组1+GEM联合)抑瘤率可达到91.1%，与联合组I及单独使用GEM组相比，其抑瘤率都有显著提高(P〈0.05)(图7A)。在整个实验治疗期间，监测小鼠体重(图7B)，显示各给药组致使小鼠体重下降不明显，小鼠能够耐受所给的剂量。[0060]《实施例8》融合蛋白dFv-LDP、强力霉素及吉西他滨联合对人结肠癌裸鼠移植瘤的增强治疗作用
[0061]人结肠癌HCT-15细胞在体外培养扩增，取对数生长期细胞计数，稀释成2X107/ml的细胞悬液，每只200微升接种于BALB/c雌性裸鼠右侧腋窝皮下，待瘤块在BALB/c裸鼠皮下长至黄豆大小时，在无菌操作台内，解剖分离出瘤块，浸于无菌生理盐水中，选择半透明无坏死的肿瘤组织剪成直径为2mm的小块接种于裸鼠右侧腋窝皮下。待肿瘤生长至.50-100mm3时对动物进行分组并开始给药。融合蛋白dFv-LDP经尾静脉注射给药,分别于肿瘤移植后第10天和第17天给药，共两次。吉西他滨(GEM)经小鼠腹腔注射给药，分别于第.10天和第17天给药，共两次。强力霉素(DOX)经小鼠腹腔注射给药，隔天一次，共8次。实验共设6组，每组6只雌性裸鼠，即对照组(生理盐水)、dFv-LDP组(dFv-LDP20mg/kg)、DOX组(D0X20mg/kg)、GEM 组(GEM40mg/kg)、联合组 I (dFv_LDP20mg/kg+GEM40mg/kg)和联合组.2 (dFv-LDP20mg/kg+GEM40mg/k+D0X20mg/kg g)。实验期间记录小鼠体重和肿瘤体积，于接种肿瘤后第25天结束实验。统计学分析方法与实施例5相同。
[0062]实验结果显示，将记录的动物瘤体积进行统计学分析，融合蛋白dFv-LDP、DOX、GEM对人结肠癌裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为47.8%,27.2%,25.3%。联合组I (即dFv_LDP+GEM联合)抑瘤率为66.3%，联合组2 (即dFv-LDP+GEM+DOX联合)抑瘤率可达到85.5%，与联合组I或与单独使用GEM组相比，其抑瘤率均有显著提高(P〈0.05)，并且其协同指数⑶I值为
.0.55，说明dFv-LDP、DOX与GEM联合，对人结肠癌HCT-15移植瘤有明显协同抑瘤效果(图.8A)。在整个实验治疗期间，监测小鼠体重显示，各给药组小鼠的体重下降不明显(图SB)，表明所使用的剂量为可耐受剂量。