专利名称：包含调节细胞容量的人激酶h－sgk的抑制剂的药物的制作方法图1)。纤维变性疾病是由基质蛋白的形成增加和分解减少引起的。二者都是TGFβ1的作用。成纤维细胞中基质蛋白表达的增加可以通过用呋塞米抑制NKCC得以抑制(图2)。迄今仍不清楚h-sgk表达的增加仅是结果还是疾病的原因。现在出人意料的发现证明h-sgk激活Na+，K+，2Cl-协同转运(图3)。由此可以得出结论h-sgk对NKCC的刺激诱导纤维变性。除了Na+，K+，2Cl-协同转运外，h-sgk还激活ENaC(图4和5)和MDEG。h-sgk对ENaC的刺激作用可以用激酶抑制剂诸如象星形孢菌素(Sigma，D-82041 Deisenhofen)或白屈菜红(Chelerythrin)(Sigma，loc.cit)加以抑制(图4)。另外，h-sgk对ENaC的作用可以用反式显性抑制激酶抑制(图5)。h-sgk的抑制剂诸如星形孢菌素、白屈菜红或其他激酶抑制剂因此可用于治疗上面所提到的疾病。一般来说，适合于此目的的是所有已知的激酶抑制剂。在许多情况下，激酶抑制剂也可从商业上获得，例如从Calbiochem-NovabiochemGmbH，Listweg 1，D-65812 Bad Soden购得(参见“1998年总商品目录”)。其他激酶抑制剂可以从技术人员已知的其他商业或非商业来源得到。在癫痫发作中h-sgk的表达增加。我们已发现的功能数据显示该作用适于减少神经元的应激性，因为NKCC的激活导致细胞外K+浓度下降，接着发生超极化并因此抑制了神经元的活性。此外，MDEG的抑制会抑制神经元的应激性。因此，穿过血脑屏障的激酶激动剂可以成功地用于癫痫发作。相反，穿过血脑屏障的药物对激酶的抑制可能增加注意力和学习能力。此外，激酶激活剂已为技术人员知悉了很长时间，其中蛋白质激酶C激活剂是特别令人感兴趣的(参见例如Calbiochem-Novabiochem 1998 General Catalog，loc.cit.)。其他激酶激活剂可以从技术人员已知的其他商业和非商业来源得到。由于Na+，K+，2Cl-协同转运和Na+通道对肾的Na+吸收是决定性的，且肾Na+吸收的增加伴随高血压，因此必须假定激酶的表达增加导致高血压，而激酶的表达减少导致低血压。本发明因此还涉及h-sgk的抑制剂在生产用于治疗糖尿病、动脉硬化、早老性痴呆、肝硬化、节段性回肠炎、纤维化胰腺炎、肺纤维变性、慢性支气管炎、放射性纤维化、硬皮病、囊纤维变性和其他纤维变性疾病的药物、以及用于治疗本质性高血压的药物中的用途。包含h-sgk的抑制剂或激活剂的药物另外还可用于调节神经元的应激性。特别有利的是使用抑制剂星形孢菌素或白屈菜红及它们的类似物。结果糖尿病性肾h-sgk在正常肾脏中的表达只是很低的。肾小球、后近端和远端小管中的一些细胞显示出清楚的h-sgk表达。与此对照，具有大量h-sgk表达的细胞积聚在糖尿病性肾中。动脉硬化大量表达h-sgk的细胞常见于动脉硬化脉管的管壁中。
早老性痴呆在正常的脑中只有零星的表达h-sgk的细胞。这些细胞大概是少突神经胶质细胞。表达h-sgk的细胞的量在早老性痴呆患者的脑中明显增加。
肝硬化在正常的肝脏中只有铜细胞表达h-sgk。但是，在肝硬化中，组织中密布表达h-sgk的细胞。
节段性回肠炎在正常的肠组织中，h-sgk只在肠细胞中表达。但是在节段性回肠炎中，结缔组织中也发现了激酶。
纤维化胰腺炎在正常的胰腺中，h-sgk见于腺泡细胞和管细胞。在胰腺管周围可见偶见表达h-sgk的单核细胞。在纤维化胰腺炎中激酶的表达有显著的增加。
肺纤维变性和慢性支气管炎在肺纤维变性和慢性支气管炎中观察到h-sgk的大量表达。
TGFβ1对h-sgk表达的刺激h-sgk的表达受到TGFβ1的刺激(图1)。既然TGFβ1在纤维化/发炎的组织中产生，这一发现就解释了在发炎的组织中h-sgk的表达增加的原因。
TGFβ1刺激基质蛋白双糖链蛋白聚糖的表达，一种受到NKCC抑制剂呋塞米抑制的作用TGFβ1刺激双糖链蛋白聚糖的表达。在NKCC抑制剂呋塞米的存在下，TGFβ1对双糖链蛋白聚糖表达的作用完全被抑制。因此NKCC的活化是TGFβ1的纤维化作用的先决条件(图2)。
h-sgk对NKCC的刺激激酶在纤维化组织中表达增加的重要性可能是多方面的，与纤维变性没有因果联系。但是，用双电极电压夹钳进行的实验显示NKCC的活性受到h-sgk的极大刺激(图3)。鉴于双糖链蛋白聚糖合成的呋塞米敏感性，这一发现明确地证明了h-sgk在纤维变性中的因果性作用。
h-sgk对ENaC的刺激这种作用可以受到激酶抑制剂星形孢菌素和白屈菜红的抑制。如图4所示，通过与h-sgk共表达而使得通过ENaC的流量大量增加。因此激酶刺激ENaC。激酶抑制剂星形孢菌素和白屈菜红能完全抑制h-sgk对ENaC的活化。
h-sgk对上皮ENaC的刺激可以通过反式显性抑制激酶h-sgk的共表达逆转如图5所示，h-sgk共表达对ENaC介导的Na+流量的刺激作用可以通过反式显性抑制激酶的共表达得以抑制。这种反式显性抑制激酶(对照“术语的定义”)的催化单元上进行的修饰使得它能不再表现出其功能。但是，由于它能结合底物，因此能置换活性激酶并由此抑制其作用。反式显性抑制激酶不仅抑制外源h-sgk导致的ENaC活性的增加，而且明显抑制内源h-sgk引起的刺激。
MDEG通过与h-sgk的共表达而完全阻断如图6所示，MDEG在卵母细胞中的表达导致了强Na+流量，其通过降低细胞外pH而激活。该通道完全被与h-sgk的共表达阻断。由此必定得出结论h-sgk抑制神经元应激性。
实施例实施例1原位杂交将从正常的胰腺、肝、血管、脑、肺、肾和肠得到的组织、以及患有糖尿病性肾病、动脉硬化、早老性痴呆、肝硬化、节段性回肠炎、纤维化胰腺炎和肺纤维变性的组织在石蜡中在4％低聚甲醛/0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中包埋4小时。将组织切片脱蜡并如以前所述进行杂交(Kandolf，R.，D.Ameis，P.Kirschner，A.Canu，P.H.Hofschneider，《美国国家科学院院报》846272-6276，1987年；Hohenadl，C.，K.Klingel，J.Mertsching，P.H.Hofschneider，R.Kandolf.，《分子细胞探针》511-20，1991年；Klingel，K.，C.Hohenadl，A.Canu，M.Albrecht，M.Seemann，G.Mall，R.Kandolf，《美国国家科学院院报》89314-318，1992年)。
杂交混合物或者含有35S标记的编码h-sgk的有义RNA，或者含有35S标记的与最后提及的RNA互补的反义RNA(各500ng/ml)，它们都存在于10mM Tris-HCl，pH7.4；50％(vol/vol)去离子甲酰胺；600mMNaCl；1mM EDTA；0.2％聚乙烯吡咯烷酮；0.02％菲可；0.05％小牛血清白蛋白；10％葡聚糖硫酸酯；10mM二硫苏糖醇；200μg/ml变性的超声处理过的鲑精子DNA和100μg/ml兔肝tRNA。
与RNA探针的杂交在42℃下进行18小时。玻片如(Hohenadl等，1991年；Klingel等，1992年)所述洗涤，然后在2x标准柠檬酸钠中在55℃下培养1小时。未杂交的单链RNA探针用存在于10mMTris-HCl，pH8.0/0.5M NaCl中的RNA酶A(20μg/ml)在37℃下消化30分钟。然后组织样品放射自显影3周(Klingel等，1992年)并用苏木精/曙红染色。
实施例2双糖链蛋白聚糖和h-sgk的转录调节细胞在添加了10％(vol/vol)胎牛血清(FCS)的RPMI/5％CO2/10mM葡萄糖中在37℃、pH7.4下培养。细胞生长至90％融合，然后在TRIZOL(GIBCO/BRL)中匀化(每份样品约0.4×106)。按照制造商的指示制备总RNA。Northern印迹的分级分离利用在2.4mol/l甲醛的存在下通过带有15或20μg总RNA和独立的对照的10g/l琼脂糖凝胶电泳进行。RNA通过真空(Appligene Oncor Trans DNA Express VacuumBlotter，Appligene，Heidelberg，Germany)转移到带正电荷的尼龙膜(Boehringer Mannheim，Germany)上，在紫外线(UVStratalinker 2400，Stratagene，Heidelberg，Germany)下交联。杂交用DIG-Easy-Hyb(Boehringer Mannheim)以25μl/l的探针浓度在50℃下进行过夜。用地高辛配基(DIG)标记的探针如早先的详细描述(Waldegger等(1997)PNAS 944440-4445)通过PCR生产。至于放射自显影法，让滤器暴露于X射线膜(Kodak)平均5分钟。
实施例3双电极电压夹钳和示踪流实验有爪蟾蜍的解剖以及卵母细胞的获得和处理已在早先作了详细描述(Busch等，1992年)。卵母细胞各自注射1ng NKCC、ENaC或MDEG的cRNA，同时注射或不注射h-sgk。注射后2-8天就可进行双电极电压和流量夹钳实验。被呋塞米抑制的通过NKCC的Na+流入利用摄取到卵母细胞中的22Na+摄取测量，其用闪烁计数器确定。Na+流量(ENaC)在10Hz过滤并用笔记录器记录。实验通常在cRNA注射后的第二天进行。浴溶液含有96mM NaCl，2mM Kcl，1.8mM CaCl2，1mM MgCl2和5mM HEPES，pH7.5，支持电位为-50mVY。所有实验中pH通过用HCl或NaOH滴定来调节。浴液的流动速率设定为20ml/分钟，它能确保在测量室中在10-15秒内完全改变溶液。所有数据以算术平均值±SEM的形式给出。
附例说明图1TGFβ1对h-sgk表达的刺激h-sgk的表达受TGFβ1的刺激。显示了0.5到6小时后TGFβ1的作用(上图)。佛波酯PDD(4-α-佛波醇12，13-二癸酸酯；刺激蛋白激酶C)和Ca++离子载体离子霉素(Sigma，lot.cit；增加细胞内Ca++浓度)同样刺激h-sgk表达(下图)。
图2TGFβ1对双糖链蛋白聚糖表达的刺激双糖链蛋白聚糖(B)的表达受细胞渗透膨胀(hypo＝h，左上图)和TGFβ1(右上图)的刺激。TGFβ1对双糖链蛋白聚糖表达的作用在NKCC抑制剂布美他尼(b)(对照＝c)的存在下几乎完全被抑制。
图3h-sgk对NKCC的刺激22Na+在表达NKCC的卵母细胞中的能被呋塞米抑制的摄取〔摄取(nmol/20分钟/卵母细胞)＝u〕受到h-sgk的极大刺激。注射了NKCC的卵母细胞没有显示出比未经注射的卵母细胞(n.i.)更高的Na+流入。这种Na+流入没有被NKCC抑制剂呋塞米(＝F)抑制(上图)。单独的h-sgk的表达没有导致对Na+流入的刺激。h-sgk与NKCC的共表达导致Na+流入大量增加，这种增加完全被呋塞米抑制(下图)。
图4h-sgk对ENaC的刺激通过ENaC的流量(I)通过与h-sgk的共表达而大大增加了。卵母细胞用激酶抑制剂星形孢菌素(S)或白屈菜红(C)处理抑制了h-sgk对Na+通道的活化。
图5h-sgk对ENaC的刺激可以通过反式显性抑制激酶的共表达逆转同时表达ENaC和h-sgk的卵母细胞显示出比只表达ENaC的卵母细胞大得多的流量(I)。反式显性抑制激酶的共表达抑制了h-sgk对ENaC的刺激。
图6h-sgk对MDEG的抑制通过MDEG的流量(I)在培养持续过程中增加〔天(T)1-4〕。该流量完全被与h-sgk的共表达抑制(峰值＝p；稳定水平＝pl)。


本发明涉及包含调节细胞容量的人激酶h－sgk的抑制剂或激活剂的药物。这类药物适用于治疗其中h－sgk的表达增加或减少的病理状态。