一种鸡胚同时增殖h9亚型禽流感病毒及禽巴氏杆菌的方法

刘宇卓, 吴继红, 张敬峰, 李银, 梁国民, 赵冬敏, 魏雪涛, 黄欣梅

2011年9月7日

2011年2月28日

2011年2月28日

江苏省农业科学院

C12N7/00GK102174444SQ201110047388

h 禽流感 亚型 增殖 同时

1.一种鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒及禽巴氏杆菌的方法，其特征在于利用鸡胚同时繁殖H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌两种病原2.按照权利要求1所述的一种鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒及禽巴氏杆菌的方法， 其特征在于先将H9亚型禽流感病毒接种鸡胚后孵化一定时间后，再接种禽巴氏杆菌后继续孵化直至鸡胚死亡，获取鸡胚尿囊液3.按照权利要求1或2所述的一种鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒及禽巴氏杆菌的方法，其特征在于先将H9亚型禽流感病毒尿囊液稀释1000 10000倍后，尿囊腔接种9 11日龄鸡胚，0. Iml/枚，37 °C继续孵化40 60小时；再将禽巴氏杆菌稀释至含菌量5 100个/毫升，再次尿囊腔接种已接种过H9亚型禽流感病毒并已孵化40 60小时的鸡胚中，0. Iml/枚，置37°C继续孵化至鸡胚死亡，收获尿囊液分别测定病毒含量及细菌含量4.权利要求1-3所述方法在生产H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌联苗中的应用

本发明涉及一种鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒及禽巴氏杆菌的方法，属于生物学领域，特别属于兽用生物制品领域背景技术目前，为了避免和减少在畜禽养殖生产中因反复接种疫苗而造成的畜禽应激反应和劳动力增加等问题，兽用生物制品研究者们纷纷着力于开发研制联苗来应用于实际生产中现在一般采取选择不同材料增殖细菌、病毒，测定细菌、病毒液含量后分别经相应的浓缩后再按一定配比混合来制备各类联苗本领域的传统观念认为，鸡胚不适于作为细菌培养基，只用作病毒传代、增殖的材料，在病毒学的研究和疫苗生产中起重要作用而在一些家禽细菌和病毒联苗生产过程中，通常利用配制的各类培养基和鸡胚分别做为增殖细菌和病毒的材料这样，不但生产成本较高，而且要经过繁琐的浓缩过程来实现联苗对细菌、 病毒抗原的含量要求，增加了人力成本和对设备的要求为了解决上述疫苗研发、生产的实际问题，本发明提出了一种采用鸡胚同时增殖 H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌的方法，大大节约了此类联苗的生产成本，减少了劳动强度，也减少了对浓缩设备的需要，同时也拓展了鸡胚的用途此外，本发明为其他相应病毒和细菌联苗的研发提供了思路三、发明内容技术问题本发明的目是提供一种采用鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌的方法技术方案本发明的技术方案是采用鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌的方法， 该方法是将H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌分别于不同时间经尿囊腔接种同一鸡胚，经 37 °C继续孵化至鸡胚死亡，收获死亡鸡胚尿囊液上述技术方案是按照以下步骤实施的取H9亚型禽流感病毒尿囊液稀释5000 10000倍后，0. Iml/枚尿囊腔接种9 10日龄SPF鸡胚，37°C孵化48 60小时将禽巴氏杆菌稀释至含菌量5 100个/毫升，尿囊腔接种上述鸡胚37°C继续孵化12 M小时，将致死鸡胚尿囊液回收，取样纯检，计数活菌数和测定病毒含量上述方法可以在生产同时繁殖同类的病毒和细菌相应联苗中得到应用有益效果利用鸡胚同时增殖H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌，节约了生产成本，拓展了鸡胚的用途所增殖的禽巴氏杆菌量较常规培养的含菌量大为提高，且增殖的H9亚型禽流感病毒量与正常单独接种病毒所得的病毒含量、HA效价相当该方法可用于同时增殖H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌以用于相应联苗的生产具体实施例方式31.菌毒种H9亚型禽流感病毒NJOl株[A / Duck / Nanjing / 01 / 1999 (H9N2)]由江苏省农科院兽医研究所分离、鉴定、保存并经中国农科院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定(刘宇卓，李银，张敬峰，魏雪涛，梁国民，吴继红.一株鸭源H9亚型禽流病毒的分离及鉴定.江苏农业学报，2007，3153-154,165)禽巴氏杆菌来源购自国家兽医微生物菌种保藏中心菌种保藏号CVCC458.2.H9亚型禽流感病毒的接种取H9亚型禽流感病毒NJOl株尿囊液(病毒含量EID5tl为 IO-8 3VO. 1ml)，用灭菌生理盐水稀释10000倍后，尿囊腔接种9日龄鸡胚20枚，0. Iml/枚， 置37°C孵化52小时3.禽巴氏杆菌的接种取保存的禽巴氏杆菌培养液，稀释至含5 100个巴氏杆菌每毫升，再次尿囊腔接种上述鸡胚中，0. Iml/枚，置37°C继续孵化至鸡胚死亡4.收获上述死亡鸡胚尿囊液，分别测定HA和进行纯检和活菌计数，并将尿囊液过滤除菌后测定其病毒含量(EID5CI)通过纯检和活菌计数，尿囊液内所含细菌为单一巴氏杆菌，每毫升含菌量达到 4X IOltlCFU,比传统培养基增殖的每毫升含菌量(IX IO8 IXlO9 CFU)大为提高测定尿囊液HA为29，病毒含量(EID5tl)为I(T8 63A). Iml,与正常单独接种病毒所得的病毒含量、HA效价相当所述方法可以在生产H9亚型禽流感病毒和禽巴氏杆菌联苗中得到应用，这是本领域技术人员可以想到的