专利名称：Hla-a0201限制性抗cea抗原特异性ctl的制备方法一、肿瘤治疗的困境与机会恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要 原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注(3X lO.11)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2(IL-2) (10万IU/kg,q8h),因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素Y (IFN- y )、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体(Mouse anti-HumanCD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群,命名为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHC I类和MHC II类分子)，免疫共刺激分子(⑶80、⑶83、⑶86、⑶40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8 (IL-8)、干扰素a (IFN-a)、白细胞介素-12 (IL-12)、肿瘤坏死因子a (TNF-a )等，增强机体非特异性免疫应答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon, CA),该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。三、癌胚抗原(CEA)在肿瘤免疫治疗中的作用癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)是1965年首次在肠道肿瘤及胚胎消化道中被发现的，由686个氨基酸组成，分子量为18 20kD。近来研究证实CEA是免疫球蛋白超基因家族的成员之一，可能参与细胞识别与细胞间反应，且CEA还是一种粘附因子，可促进肿瘤细胞与正常细胞的结合，并对肿瘤的转移起重要作用。因此CEA不仅是一种单纯的肿瘤标志物，而且是与肿瘤恶性化有关的分子，在多种肿瘤中表达。超过90%的原发性结直肠癌表达CEA，尤其是在肝转移患者中，血清CEA浓度在80%肝转移患者中升高。胃癌患者血清CEA的阳性率在40%左右，且与分期有关，随病程进展逐渐升高。40%-80%的肺癌患者出现CEA升高，血清CEA水平与治疗的反应性及预后有较好的相关性。CEA亦可产生自乳腺组织。因此CEA可以作为肿瘤免疫治疗的有效靶抗原。CEA抗原高表达的肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌的发病率和死亡率均是排名前三位的肿瘤，而目前还未有针对CEA抗原的药物上市，因此开发新型针对CEA靶点的药物势在必行。抗CEA特异性CTL的开发是一种发展方向。 四、CTL作用机理I、机体T细胞免疫反应过程机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分四个阶段(I)抗原识别APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞)；(2)抗原加工与递呈抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC- I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；(3) T细胞激活(双信号学说)=APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中⑶8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，⑶4+T细胞识别MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用即CTL ；(4)靶细胞杀灭活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。2、CTL表型与功能差异根据CTL表面分子的表达种类可分为两型中央记忆型CTL (CTLcm)和效应记忆型 CTL (CTLem)0Klebanoff等研究发现表型分析为CD3+CD45R0+CD62L+CCR7+的CTLcm具有更强的抗肿瘤能力Johnson等比较了 MART-I TCR基因修饰的CTL_cm和CTL_EM，结果发现前者消退恶性黑色素瘤细胞的能力是后者的10倍。Berger等研究结果还显示CTL.输注后较表型为CD3+CD45RO+CD62L-CCR7-的CTL_EM在体内能存活更长的时间。3、CTL技术开发现状综合国内、国外CTL体外制备技术可归类为三种方法与来源(I)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外扩增法从肿瘤患者肿瘤组织中分离TIL，加入白细胞介素-2(IL_2)培养，克隆稀释法筛选肿瘤抗原阳性的T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2进行扩增培养获得。Li等选择HLA-A201阳性的IV期恶性黑色素瘤患者，将其肿瘤组织制备成单细胞悬液后，加入IL-2培养，5周后筛选扩增细胞中⑶8+T+MART-1+的阳性T细胞克隆，再加入 鼠抗人CD3单克隆抗体和辐照后的PBMC饲养细胞扩增培养，次日加入IL-2，再培养12天可获得CTLs，能对负载MART-I多肽的T2细胞株特异性识别和杀伤。(2) TCR基因修饰法TCR是T细胞识别抗原、介导免疫应答的关键分子，包括a、@、Y、S四条链，由二硫键连接成a/0和Y/S两种异二聚体，其中a/0+T细胞占外周血T细胞的90-95%，是主要的免疫效应细胞。TCR基因修饰即通过外源质粒转染自体T淋巴细胞，导入能识别特异性抗原多肽的TCR基因，挑选阳性克隆，在体外扩增培养获得CTL。较为常用的质粒有逆转录病毒质粒或慢病毒质粒。Morgan等采用抗⑶3+⑶28+磁珠激活⑶8+T细胞，应用慢病毒质粒转染修饰MART-I或gplOO特异性的TCR基因，采用鼠抗人⑶3单克隆抗体和IL-2培养体系制备CTLs，在12天能扩增培养至IO9个细胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治疗，结果显示有2例患者出现了明显的临床疗效，I例52岁男性患者的腋窝转移病灶消失，肝转移病灶缩小了 89%，无病生存期为21个月；1例30岁男性患者，肺部转移病灶消失，无病生存期为20个月。Perro等采用白细胞介素-15 (IL-15)和白细胞介素_21 (IL-21)细胞因子组合促进TCR基因转染非增殖的T细胞，可以维持T细胞高表达⑶62L和⑶28。(3)体外抗原致敏法用人工APC (Artificial APC)，或抗原(蛋白质，多肽，或全细胞)体外反复刺激T细胞，获得抗原特异性CTL。浙江大学的发明专利(专利号CN102168066A)体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法即采用该方法。将MHC- I -Ig和抗⑶28mAb包被磁珠构建人工APC，抗原表位肽负载APC后，体外致敏3-4周，再以磁珠吸附分离抗原特异性CTL，Tetramer染色鉴定。上述三种方法的缺陷(I) TIL体外扩增法①需要获得患者的新鲜肿瘤组织作为CTL来源，仅限于可手术的患者，且肿瘤组织来源有限；②TIL分离，CTL克隆的获取与鉴定方法复杂，肿瘤组织中各种细胞成分较多，较复杂，分离细胞的时间长，一般都需要I个月以上；③TIL中混有⑶4+⑶25+Treg亚群，其会抑制CTL扩增效率；④由于体外分离扩增时间长，增加了污染的机会。(2) TCR基因修饰法①外源性质粒(逆转录病毒或慢病毒等)的引入，给临床应用带来一定的风险；②内源性TCR干扰，导入的TCR基因可能并不能导入预期的位点，而与内源性的TCR发生错排，其能识别抗原不是预期设计的，且是未知的，存在很大的风险。( 3)体外人工APC负载抗原致敏法 ①引入外源物质人工APC，制备的CTL是否有人工APC残留仍是疑问；②人工APC体外致敏CTL的周期较长，需要3_4周，获得CTL还需要扩增培养后才能满足临床治疗的需要，因此体外培养的周期长，污染的几率较大。目前还没有文献报导过制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A201限制性抗原特异性CTL的制备方法。
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A201限制性抗CEA抗原特异性CTL的制备方法。本发明的目的是通过下列技术方案实现的HLA-A0201限制性抗原特异性CTL的制备方法，该方法包括下列步骤a.第一步CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化方法用自动单个核细胞采集仪(单采仪)采集外周单个核细胞(PBMC)作为细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从PBMC中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞。b.目标CTL诱导与第一轮扩增用负载HLA-A0201限制性CEA抗原多肽的自体成熟树突状细胞(mDC)刺激⑶8+T淋巴细胞，不仅提供给T细胞活化的第一信号(抗原)，同时DC提供给T细胞活化必须的第二信号(免疫共刺激分子⑶40、⑶80、⑶83等)；同时加入rhIL-2和rhIL_7两种细胞因子联合促进T细胞生长，抑制活化诱导的细胞凋亡反应(AICD)，延长活化细胞的生存周期。c.目标CTL纯化方法在第一轮用负载抗原的mDC刺激并扩增目标CTL数量后,米用Tetramer标记方法和流式细胞分选术再一次纯化目标CTL(目标CTL是指表达识别CEA抗原多肽TCR的⑶8+T，即Tetramer+Q)8+T淋巴细胞)，即选择Tetramer+Q)8+T,剔除非特异性扩增的T细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响。d.目标CTL的第二轮扩增采用固相包被的anti-human-⑶3mAb和IL_2刺激目标CTL的生长与增殖；再加入经Y射线辐照的自体PBMC增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15 —方面可以促进记忆性T细胞的增殖，另一方面可抑制细胞的凋亡。e.第二轮扩增后目标CTL表型鉴定采用流式细胞术对已制备的目标CTL进行表型分析，根据其表达的分子谱不同将其分为中心记忆性 CTL ( CTL_cm :CD8+CD45R0+CD62L+CCR7+)和效应性 CTL (CTL_EM CD8+CD45R0+CD62L-CCR7-)。所述的制备方法，步骤b中的目标抗原为CEA抗原多肽长度优选9-15个氨基酸，进一步优选序列如SEQ ID NO. I所示的HLA-A0201限制性CEA抗原多肽。所述的制备方法，步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到的PBMC贴壁后加入rhGM-CSF、rhIFN a、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获的DC再加入目标抗原孵育即得。所述的制备方法，步骤c中用于目标CTL扩增的Y射线辐照的自体PBMC是通过下列方法制备得到的留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY的、射线辐照后保存；保存液含20% (V/V) DMSO和20% (V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度_80°C超低温保存。所述的制备方法，步骤d中用于目标CTL扩增的CD3单抗克隆抗体 (anti-human-⑶3mAb,简称⑶3单抗)是如下操作的将⑶3单抗固相包被于用于扩增细胞的容器表面，CD3单抗可与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。 所述的制备方法，各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为a.目标CTL第一轮扩增每次加入量rhIL_2终浓度为500_750IU/ml，rhIL-7终浓度为50-75ng/ml，DC与起始T细胞数量比为1:5。b.目标CTL第二轮扩增rhIL-2终浓度为200_500IU/ml，rhIL-15终浓度为100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为I. 0-2. 5 u g/ml, y射线辐照的PBMC与起始CTL数量比为2:1。所述的制备方法，各步骤操作后细胞数量与表型特征见表I。表I

本发明公开了HLA-A0201限制性抗CEA抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集、纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性CEA抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，并用rhIL-2和rhIL-7联合促进T细胞生长；采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL；采用固相包被的抗人CD3单抗和IL-2刺激目标CTL的生长；加入γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加入rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL-CM，可用于肿瘤等免疫治疗。