专利名称：产酸克雷伯菌菌株及其应用和三唑磷农药残留降解菌剂及其制备方法目前，化学农药已广泛应用于现代农药生产和卫生防疫，化学农药的大量使用，大大促进了现代农业生产的发展。然而，化学农药的不合理使用甚至滥用，导致大量化学农药流失到生态环境中，对生态系统造成了严重的危害；而且，化学农药的大量使用，以及生态环境中残留的化学农药，容易导致生产的农产品中农药残留的超标，影响农产品的品质，并对人们的身体健康带来严重威胁，对农产品的出口产生消极影响。有机磷杀虫剂是我国使用最广泛、用量最大的一类杀虫剂，其品种繁多。从20世纪50年代，有机磷杀虫剂在我国开始生产使用，此后被广泛用于粮食、蔬菜和果树等多种作物。有机磷杀虫剂属于神经毒物，主要抑制血液和组织中乙酰胆碱酯酶的活性，导致神经递质、乙酰胆碱的大量蓄积，从而阻断了神经传导，引起中枢神经系统中毒。大多数品种对人、畜毒性偏高，有些品种属于剧毒，如甲拌磷、甲胺磷、内吸磷等。农业部的调查统计表明，该类农药是目前我国出口蔬菜、水果中主要的三类农药残留之一。欧盟2007/12/EC农药残留标准以及日本2006年出台“肯定列表制度”，都对有机磷杀虫剂农药残留限量作出严格的规定，其中规定有机磷农药的检出限量小于0. 02mg/ Kg，这些残留量限定，严重影响了我国农产品的出口。随着人们生活水平的提高以及环境保护意识的增强，全社会对食品安全以及生态环境保护的关注度逐步提高。但是，根据我国的农业生产现状以及人口状况来看，停止或大量减少农药的使用，大量生产无农药残留的绿色农产品，在目前及今后一段时间是行不通的，农药作为控制病虫草的有效手段还将继续在农业生产中发挥不可替代的作用。因此，在农业生产上，如何解决农药使用与残留这个两难问题成为研究热点。大量研究表明，以微生物修复为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生产环境中的农药残留物提供了可行的途径。也有研究表明，许多微生物还具有促进作物生长，修复局部区域生态环境的作用。该技术不仅高效安全，而且经济实用，操作简便， 目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。然而，微生物修复的前提是筛选高效安全的微生物资源，制备出使用方便的菌剂，并进行合理化地应用，这都是本领域技术人员需要面临的技术难题。
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产成本低、农药去除效果高、无毒、环保的产酸克雷伯菌菌株及该菌株的应用，具体还提供一种低成本、操作简便、效果好的三唑磷农药残留降解菌剂及其制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案一种产酸克雷伯菌菌株，所述产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC N0:M2011350的菌株。该菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为 2011年10月12日，该菌株被命名为产酸克雷伯菌TDB-I (Klebsiella oxytoca TDB-1) 上述的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350通过以下方法筛选得到将采自农田灌溉水渠的水样2. OmL加入120mL基础液体培养基(MM培养基)中，培养24h后，取1 %接种到含三唑磷10mg/L的匪培养基中，30 士 2°C，180rpm,培养24h后，取300 μ L菌液稀释涂布到以三唑磷50mg/L为唯一碳源的基础固体培养基(MMS培养基)中，培养至菌落出现，挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含三唑磷50mg/L为唯一碳源的MM培养基中，30士2°C、180rpm， 培养24d后，取分别接种到以三唑磷100mg/L为唯一碳源的MM培养基中。24h后检测农药浓度，以含相同浓度的三唑磷，相同培养条件不接种菌的培养基为对照。选择降解率最大的菌株进行后续研究。将该菌株接种于IOOmL MM培养基中培养，30士2°C、180rpm，培养， 梯度稀释平板培养法测定菌株生物量，后续实验中菌液浓度调整至约109cfu/mL。上述的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350优选为具有以下主要特征的菌株球状，具有荚膜，Ο", V-P反应阳性，甲基红反应阳性，明胶液化阴性，吲哚反应阳性，最适生长温度为25°C 35°C，最适生长pH值为5 9，16S rDNA序列长度为1505bp，在 Genbank中的登录号为JQ068819。作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述产酸克雷伯菌CCTCC M2011350的应用，将其应用于降解三唑磷农药残留。作为一个总的发明构思，本发明还提供一种三唑磷农药残留降解菌剂，所述菌剂主要是由上述的产酸克雷伯菌CCTCC M2011350与基础液体培养基配制而成的菌悬液。所述菌剂中产酸克雷伯菌CCTCC M2011350的浓度优选为彡2X109cfu/mL。作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的三唑磷农药残留降解菌剂的制备方法，包括以下步骤(1)活化将所述产酸克雷伯菌CCTCC M2011350的保存种按平板培养法进行培养，培养至单菌落出现；(2)种子培养将所述单菌落接入至种子培养瓶(例如三角瓶)中，用产酸克雷伯菌菌株种子培养基培养至对数生长期；(3)生产培养将步骤( 培养得到的培养液接入至生产瓶中，用产酸克雷伯菌菌株生产培养基培养至对数生长期，所述培养液的接入量不少于所述产酸克雷伯菌菌株生产培养基总体积的(优选为 3% )；(4)出瓶分装将步骤C3)培养得到的培养液出瓶分装得到三唑磷农药残留降解菌剂。上述的制备方法中，优选地，所述步骤(1)中，平板培养法是指用基础固体培养基 (MMS培养基)对产酸克雷伯菌菌株的保存种进行培养。所述匪S培养基的优选配方含 (NH4)2S04lg/L、K2HP047g/L、KH2P043g/L、柠檬酸钠 0. 5g/L、MgS04 · 7H20 0. lg/L、葡萄糖 5g/ L 和琼脂 1.5g/L，pH7. 0。上述的制备方法中，优选地，所述步骤O)中的产酸克雷伯菌菌株种子培养基和所述步骤(3)中的产酸克雷伯菌菌株生产培养基均为基础液体培养基(MM培养基)。所述 MM 培养基的优选配方含(NH4)2SO4 lg/L、K2HPO4 7g/L、KH2PO4 3g/L、柠檬酸钠 0. 5g/L、 MgSO4 · 7H20 0. lg/L 和葡萄糖 5g/L，ρΗ7· 0。上述的制备方法中，优选地，所述步骤(1)、步骤( 和步骤C3)的每一次培养过程中，pH值均控制为7.0 7.2，培养温度均控制为301 351；所述步骤O)、步骤(3)的每一次培养均为振荡培养，振荡速度为150 200rpm。与现有技术相比，本发明的优点为1、本发明的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350，生产成本低、农药去除效果好、高效、 无毒、环保，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到三唑磷农药残留降解菌剂，使用本发明菌株制备得到的降解菌剂具有生产成本低、使用方便，去除效果好等优点，能够有效用于农业生产中无农药残留粮食、水果、蔬菜等的生产。2、本发明的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350不仅可耐受高浓度的三唑磷，可用于实验室条件下培养基中高浓度三唑磷农药的降解，还可在耐受较宽的PH范围0 10)和温度范围(25°C 35°C )降解三唑磷。3、本发明的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350的应用可以在对农作物正常施用化学农药、消灭虫害进而保证作物产量的前提下，又能使粮食、水果、蔬菜等农作物中的农药残留降至很低或没有；而且，菌株本身具有多种营养成分及活性物质，能够有效促进作物生长，兼具防治作物病害的作用，具有安全、无毒、环保的特点；此外，由于本发明的菌株可以应用于降解高浓度三唑磷农药，因此亦可用于农药生产废水的处理。一种产酸克雷伯菌菌株(Klebsiella oxytoca TDB_1)，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏号为CCTCC M 2011；350，保藏日期为2011年10月12日。
图1是实施例1中的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350的扫描电镜图。图2是实施例1中的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350耐受温度试验的测试结果图。图3是实施例1中的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350耐受pH试验的测试结果图。
图4是实施例1中的三唑磷浓度测定标准曲线图。



本发明公开了一种产酸克雷伯菌菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为CCTCC M2011350。该菌株可应用于降解三唑磷农药残留，例如做成一种三唑磷农药残留降解菌剂，该菌剂主要是由本发明的菌株与基础液体培养基配制而成的菌悬液，其制备方法包括先将菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至单菌落出现；再将单菌落接入至种子培养瓶中，用种子培养基培养至对数生长期；再接入至生产瓶中用生产培养基培养至对数生长期，培养液的接入量不少于菌株生产培养基总体积的1％；最后出瓶分装即可。本发明具有生产成本低、农药去除效果高、无毒、环保等优点。