液固两相培养桑黄生产黄酮工艺的制作方法【技术领域】[0001 ] 本发明属于生物发酵工程【技术领域】。[0002]桑黄(Phellinusigniarius)属于担子菌亚门(Basidiomycotina),层菌纲(Hymenomycetes),多孔菌目(Polyporales),多层孔菌科(Hymenochaetacae),针层孔菌属(Phellinus)，是一种药用价值极高的高等真菌。据《药性论》记载:桑黄性甘平、无毒、治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经。据分析，桑黄的成分极其复杂，多糖和黄酮是其主要的药用成分，具有抗衰老、降低胆固醇、护肝、抑制肿瘤、促进有害物质及胆固醇排泄等作用，在我国的传统中医药中也用于痢疾、盗汗等病症的治疗。另外桑黄提取物具有抗癌药效，在抑制癌细胞的转移，防止癌症手术后复发等方面发挥了显著作用。桑黄黄酮可以从桑黄子实体分离获得，也可以通过菌丝体深层发酵法生产。由于发酵成本低、黄酮纯度高，深层发酵法正逐步取代组织提取法。目前对菌丝体发酵法生产桑黄黄酮的研究主要集中于培养基优化，反应器设计优化以及发酵参数优化等。对于桑黄发酵而言，培养方式对黄酮产量的提高至关重要。本实验室早前已对培养方式对黄酮产量的影响进行了深入研究。本发明在此基础上进行液固两相培养，在桑黄液体发酵培养过程中，利用大孔树脂选择性吸附黄酮，及时解除代谢产物积累的阻遏作用，促进黄酮的生成。这种利用液固两相培养提高桑黄黄酮产量的方法，尚未见文献报道，因此具有很好的发展前景。
[0003]本发明的目的是提供一种液固两相培养桑黄生产黄酮的工艺，包括发酵培养基、发酵条件及培养方法，利用本发明能显著提高桑黄黄酮的产量。[0004]本发明的技术方案:[0005](I)菌种:桑黄Phellinus igniarius ACCC5236菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
[0006](2)本发明的液体发酵培养基:以g/L计
[0007]葡萄糖20.00,麦芽糖20.00,甘露醇20.00,玉米浆粉9.70,酵母粉8.74，氯化钠
5.00，硫酸亚铁0.50，硫酸铜0.05，维生素Bll.50，ρΗ6.0。
[0008](3)本发明的液体发酵条件为:培养温度30 0C，种龄8-9天，接种量10 %，转速150rpm,发酵时间7天。
[0009](4)本发明提供一种采用以上培养基和发酵条件进行两相培养发酵生产黄酮的工艺。
[0010]本发明包括以下步骤:
[0011]1)将DM130大孔吸附树脂进行灭菌处理，灭菌条件为121°C，20min ；
[0012]2)利用上述培养基和发酵条件培养桑黄，在第4天时加入DM130树脂，添加剂量为500g/L，然后继续培养3天；[0013]3)发酵结束后过滤得到树脂，用60%的乙醇解吸12小时，测定并回收黄酮。
[0014]本发明选用了一种对黄酮类化合物选择性吸附较好且回收率较高的DM130型大孔吸附树脂，在桑黄液体发酵培养过程中，添加树脂，建立液固两相培养体系，利用选择性吸附及时解除代谢产物积累的阻遏作用，提高黄酮产量，最高可达2174.35μ g/ml，而对照实施例的产量为1610.63 μ g/ml 0
[0015]本发明的有益效果:利用本发明能显著提高桑黄黄酮产量。本发明所提供的液固两相培养工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对其它真菌活性代谢产物的发酵法生产具有一定的指导和启迪意义。

[0016]对照实施例:本发明所用的菌种为Phellinus igniarius ACCC5236,购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，先转PDA斜面28°C培养7天，然后转接新鲜发酵培养基，摇床上培养7天，培养结束后，收获菌丝体和发酵液，黄酮产量为1610.63 μ g/ml。
[0017]实施例1:
[0018](1)将DM130大孔吸附树脂进行灭菌处理，灭菌条件为121°C，20min ；
[0019](2)在液体发酵培养基中接入桑黄菌株，进行摇床培养(28°C，150rpm)，分别在培养时间为3，4，5或6天时，加入50g/100ml的DM130型大孔吸附树脂，然后继续培养，并设空白对照；
[0020](3)发酵7天结束后过滤得到树脂，用60%的乙醇解吸12小时，测定并回收黄酮；
[0021]实验结果如图1所示，吸附树脂的加入时间对黄酮产量有影响，树脂过早的加入会大量吸附培养基中的营养成分，这将影响菌体的生长及代谢；树脂加入的过晚，吸附效率又不够高，达不到吸附黄酮，解除产物阻遏，提高黄酮产量的作用。在发酵第4天加入吸附树脂，黄酮产量提高较大，可达2120.76 μ g/ml,比对照提高48.82%。
[0022]实施例2:
[0023](1)将DM130大孔吸附树脂进行灭菌处理，灭菌条件为121 °C，20min ；
[0024](2)在液体发酵培养基中接入桑黄菌株，进行摇床培养(28°C，150rpm)，在培养时间为4天时，分别加入25，50，100或200g/100ml的DM130型大孔吸附树脂，然后继续培养3天，并设空白对照；
[0025](3)发酵结束后过滤得到树脂，用60%的乙醇解吸12小时，测定并回收黄酮；
[0026]实验结果如图2所示，吸附树脂的加入量对黄酮产量有影响，过多吸附树脂的加入会影响培养基中的溶氧状况，供氧不足，影响菌体的生长和代谢；加入的吸附树脂较少，对黄酮类化合物的吸附效果不好，不能非常有效地提高黄酮产量。在100ml培养基中加入50g的DM130型大孔吸附树脂，可以获得最高的黄酮产量2214.27 μ g/ml,比对照提高59.49%。
[0027]实施例3:
[0028](1)将DM130大孔吸附树脂进行灭菌处理，灭菌条件为121 °C，20min ；
[0029](2)在液体发酵培养基中接入桑黄菌株，进行摇床培养(28°C，150rpm)，在培养时间为4天时，加入50g/100ml的DM130型大孔吸附树脂，然后继续培养3天，并设空白对照；
[0030](3)发酵结束后过滤得到树脂，用60%的乙醇解吸12小时，测定并回收黄酮；[0031]实验结果如图3所示，在两相培养实验中，添加DM130型大孔吸附树脂，能有效地吸附黄酮，解除代谢产物积累的阻遏作用，促进桑黄分泌黄酮，黄酮产量可达2174.35 μ g/ml,比对照提高了约35%。



图1是树脂添加时间对黄酮产量的影响 图2是树脂加入量对黄酮产量的影响 图3是液固两相培养法对黄酮产量的影响。