专利名称：一种将穿梭质粒导入嗜醋酸棒杆菌的电转化方法嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum),属于棒杆菌属，常用于发酵生产各种氨基酸。国内嗜醋酸棒杆菌的选育工作仍以传统诱变为主，如化学诱变、物理诱变等筛选营养缺陷型和结构类似物抗性突变株。通过传统诱变方法尽管也获得了不少优良的氨基酸生产菌株，但盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性。由于嗜醋酸棒杆菌在工业生产中的重要性，随着分子克隆技术的成熟，对嗜醋酸棒杆菌进行基因工程改造是必然趋势，而通过基因工程改造的一个关键步骤，是建立有效的外源基因转化方法。国内外目前利用基因工程手段改造嗜醋酸棒杆菌还比较少见，一个重要原因是:棒状杆菌属中，谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌的工业化应用较早。早在2003年，谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组测序工作已经完成。同时，异源质粒整合到谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌的效率远高于嗜醋酸棒杆菌。所以人们往往把目光集中在转化效率更高的谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌。但是 嗜醋酸棒杆菌在氨基酸生产工业中有着不可代替的作用，同时嗜醋酸棒杆菌无法通过制备感受态导入外源DNA，必须通过电转化等方法将外源DNA导入到嗜醋酸棒杆菌中，以构建重组菌。因此，提高嗜醋酸棒杆菌电转化效率尤其重要。目前，国内外尚未有文献和专利报告过将穿梭质粒电转化导入嗜醋酸棒杆菌的方法
:针对目前在大肠杆菌和嗜醋酸棒杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入到嗜醋酸棒杆菌的过程中，细胞壁肽聚糖层紧密且厚实，而且还受到嗜醋酸棒杆菌自身的限制性内切酶识别并破坏重组质粒，很难获得重组菌。本发明的目的是将一种能在大肠杆菌和嗜醋酸棒杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入到嗜醋酸棒杆菌的快速有效的方法。即本发明提供一种特殊的大肠杆菌大量扩增重组质粒。本发明提供一种专门的培养基进行前培养。本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌用氨苄青霉素进行前处理的方法。本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌电击时加入电击缓冲液的方法。本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌进行电击后热激处理的方法。本发明提供一种特殊的大肠杆菌大量扩增重组质粒，即利用大肠杆菌SCSllO大量扩增重组质粒，由于SCSllO为甲基化酶缺陷型菌株，因此在SCSllO大肠杆菌内大量扩增的穿梭质粒不被甲基化修饰。由于棒状杆菌的限制性内切酶系统可识别并降解经大肠杆菌甲基化后的穿梭质粒，因此利用甲基化酶缺陷型大肠杆菌SCSllO来源的穿梭质粒做电转化，可提高转化率。本发明提供一种专门的培养基进行前培养，培养基配方: 胰蛋白胨1% 酵母抽提物 0.5% NaCl1%甘氨酸1%-5%吐温 800.1%-0.2%通过将嗜醋酸棒杆菌在上述培养基培养过程中，吐温80可改变肽聚糖层外的棒状霉菌酸的碳链长度和不饱和度，甘氨酸代替D-丙氨酸结合到嗜醋酸棒杆菌细胞壁上，削弱肽聚糖链间交联，使得嗜醋酸棒杆菌细胞壁内外层结构均遭到破坏，不完整的细胞壁使得穿梭质粒能够顺利地穿越细胞障碍进入细胞。本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌用氨苄青霉素进行前处理的方法，即用终浓度0.5-2 μ g/ml的氨苄青霉素处理30-150min，破坏嗜醋酸棒杆菌细胞壁结构，使菌体细胞壁形成小孔，抑制嗜醋酸棒杆菌细胞壁对穿梭载体的阻碍作用，使该穿梭质粒能够通过电转化方法有效地导入嗜醋酸棒杆菌中。本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌电击时加入电击缓冲液的方法，即在电击时加入电击缓冲液，电击缓冲液配方:0.5M KCl,0.15M CaCl2,0.25M MgCl20 K+、Ca2+、Mg2+这几种带正电荷配体，均可与带负电荷的细胞膜结合，从而促进细胞膜的击穿，使得外源质粒更容易进入细胞内。本发明提供一种将嗜醋酸棒杆菌进行电击后热激处理的方法，即将感受态细胞电市后于46°C水浴6min，然后于30°C水浴lh，结束后离心浓缩菌体并涂布至含25 μ g/ml卡那霉素LB固体培养基中。热激处理步骤可以使嗜醋酸棒杆菌的限制性系统失活。通过以上技术发明，可到达如下效果:1、通过采用本发明提供的特殊培养基对嗜醋酸棒杆菌进行前培养，并将经前培养后的菌体经氨苄青霉素处理，可明显减少细胞壁对穿梭质粒的阻碍作用；利用甲基化酶缺陷型大肠杆菌SCSllO来源的穿梭质粒做电转化，可防止嗜醋酸棒杆菌识别甲基的限制性内切酶将穿梭质粒切断；将嗜醋酸棒杆菌电击时加入电击缓冲液，可进一步提高转化效率；电击后热激处理使嗜醋酸棒杆菌内部的限制性酶切系统失活，使得穿梭质粒能顺利地进入细胞内部。2、使该穿梭质粒能通过电转化方法高效地导入到嗜醋酸棒杆菌中，并稳定传递。电转化效率达到6.4X 1O4Cfu/yg DNA。而采用一般方法很难获得含有重组质粒的菌株。


略

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。为实现上述技术效果，本发明的
:1、本发明选用的质粒载体 pK19mobsacB (Schafer A, Tauch A, Jager ff, etal.Small mobilizable mult1-purpose cloning vectors derived from the Escherichiacoli plasmids pK18 and pK19 !selection of defined deletions in the chromosomeof Corynebacterium glutamicum.Gene, 1994,145 (I):69-73)含有外源基因，可在大肠杆菌中复制，并且能整合到嗜醋酸棒杆菌基因组中。由于嗜醋酸棒杆菌细胞壁肽聚糖层紧密且厚实，而且细胞表面结构复杂，无法通过制备感受态导入外源DNA，同时还受到嗜醋酸棒杆菌自身的识别甲基的限制性内切酶以及其他限制性内切酶识别并破坏重组质粒，因此很难获得重组菌。本发明通过利用大肠杆菌大量扩增重组质粒SCSllO (SCS110为商业基因工程菌，可通过市场购买)，由于SCSllO为甲基化酶缺陷型菌株，在SCSllO大肠杆菌内大量扩增的穿梭质粒不被甲基化修饰。而棒状杆菌的限制性内切酶系统可识别并降解经大肠杆菌甲基化后的穿梭质粒，因此利用甲基化酶缺陷型大肠杆菌SCSllO来源的穿梭质粒做电转化，可提高转化率。质粒提取方法参见分子克隆中碱裂解方法(Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress.New York, 1989.)。2、采用下述培养基进行前培养，吐温80影响棒状霉菌酸的碳链长度和不饱和度，甘氨酸可削弱肽聚糖链间交联，最终破坏细胞壁，不完整的细胞壁使得穿梭质粒能够顺利地穿越细胞障碍进入细胞。培养基配方:
胰蛋白胨1%
酵母抽提物 0.5%
NaCl1%
甘氨酸2%
吐温 800.15%将上述培养基用NaOH调PH至7.0 7.2，每瓶分装50ml后121°C灭菌15min。3、将嗜醋酸棒杆菌ATCC13870，接种到5ml LB培养基中培养12h后，以1%的接种量接种至上述培养基中。于30°C，220rpm培养至细胞0D600达到0.6，补加氨苄青霉素至终浓度I μ g/ml,继续培养90min。4、将上述装有待回收菌体的三角瓶在冰上放置15min后，倒入预冷的50ml离心管中，4000g，4°C下离心lOmin，倒掉上清液后，用15%甘油洗涤菌体2次，最后用2ml的15%甘油重悬细胞，并分装至1.5ml的离心管中，每管80 μ I。并于_80°C冰箱保存待用或直接用于电转化。5、采用Bio-Rad Gene pulser电击仪,0.1cm电击杯,转化时将感受态细胞从冰箱中取出并于冰上融化，添加5 μ I质粒DNA和10 μ I电击缓冲液后混匀，转移至预冷的0.1cm电击杯中，于1.8KV, 5ms的条件下电击细胞，电击后立即加人液体SOC培养基0.5ml，混匀后转入1.5ml离心管后于46°C水浴6min，然后于30°C水浴Ih结束后离心浓缩菌体并涂布在含25 μ g/ml卡那霉素LB固体培养基上。30°C培养48h后，可见转化克隆子。实施例1:将斜面保藏的新鲜的嗜醋酸棒杆菌ATCC13870，接种到5ml LBG培养基中，以1%的接种量接种至含3%甘氨酸和0.1 %吐温80、I %的胰蛋白胨、0.5%的酵母抽提物、I %的NaCl培养基中。于30°C，220rpm培养至细胞0D600达到0.4，补加氨苄青霉素至终浓度
Iμ g/ml，继续培养60min后。4000g，IOmin离心回收菌体，制备感受态后，将感受态细胞置于冰上融化，添加5 μ I未甲基化的含有外源基因的重组质粒pK19mobsacB、10y I电击缓冲液并混勻，电击后46°C热击6min,全部涂布至25 μ g/ml卡那霉素的LB固体培养基中，于30°C烘箱中培养36-48h后单菌落即可长出。转化率达到5.ZXlO4CfVyg DNA，外源质粒可高效地导入到嗜醋酸棒杆菌中。实施例2:将斜面保藏的新鲜的嗜醋酸棒杆菌ATCC13870，接种到5ml LBG培养基中，以1%的接种量接种至含2 %甘氨酸和0.15%吐温80、I %的胰蛋白胨、0.5%的酵母抽提物、I %的NaCl培养基中。于30°C，220rpm培养至细胞0D600达到0.6后，补加氨苄青霉素至终浓度lyg/ml，继续培养90min后。4000g，IOmin离心回收菌体，制备感受态后，将感受态细胞置于冰上融化,添加5 μ I未甲基化的含有外源基因的重组质粒pK19mobsacB、10y I电击缓冲液并混勻，电击后46°C热击6min,全部涂布至25 μ g/ml卡那霉素的LB固体培养基中，于30°C烘箱中培养36-48 h后单菌落即可长出。转化率高达6.4X IO4Cfu/μ g DNA。


一种将穿梭质粒导入嗜醋酸棒杆菌的电转化方法，主要用于将大肠杆菌和嗜醋酸棒杆菌中穿梭表达的重组质粒快速有效地电转化导入嗜醋酸棒杆菌中。通过控制培养基的组成、细胞培养时间、氨苄青霉素处理时间和加入量、质粒的甲基化、热击时间和热击温度、电击条件来制备高效电转化感受态细胞，减弱嗜醋酸棒杆菌细胞壁对穿梭质粒的阻碍作用，并减少嗜醋酸棒杆菌对穿梭质粒的限制性酶切作用，使得穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入到嗜醋酸棒杆菌中，电转化效率可达到6.4×104cfu/μg DNA。