专利名称：炎症性疾病的抑制剂的制作方法炎症性疾病的抑制剂本发明涉及乳香(Boswellia frereana)(通常被称作乳香(frankincense))作为药物的用途；乳香(Boswellia frereana)的提取物，其中所述提取物在有机溶剂中是可溶的并且不包含乳香酸；所述提取物的至少一种药剂；以及来源于乳香(Boswellia frereana)的组合物。本发明还涉及所述提取物，和/或所述药剂和/或所述组合物的获得方法以及治疗使用的方法以及，特别地，但不是唯一地，使用所述提取物，和/或所述药剂和/或组合物作为炎症性疾病的抑药剂的方法，所述炎症性疾病例如，关节软骨退化。乳香(Boswellia frereana)是非洲索马里的天然产物。这种产物可以来源于多Simply Incense [Resolve (WSS Ltd t/a), Unit 12, Southwell Business Centre, Crew Lane Industrial Estate, Southwell, Nottinghamshire, NG25 OTX] ；A F Suter & Co. ltd. [Unit 1, Beckingham Business Park, Beckingham Road, Tolleshunt Major,Essex,United Kingdom]；以及Joseph Flach & Sons Ltd. [Unit 8,Maxwell Road, Woodston Industrial Estate, Peterborough, Cambridgeshire, PE2 7HU, ENGLAND]。1U关节软骨退化是退行性关节炎和炎症性关节炎，例如骨关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)的典型特征。OA的特征是细胞外基质(ECM)中蛋白聚糖和胶原的丢失，并且这些分解代谢事件主要是由基质金属蛋白酶(MMP 1、3、9和13(1-6))和蛋白聚糖酶 (ADAMTS-4*-5(6-8))介导的。这些分解代谢酶的差异表达与OA关节中的炎症性介质和细胞因子的水平有关。细胞因子例如白细胞介素-I(IL-I)以及肿瘤坏死因子-a (TNF- α ) 是促使ECM破坏的关键介质。除了诱导MMP和蛋白聚糖酶的合成外，IL-I和TNF-α还通过诱生型一氧化氮合酶刺激一氧化氮的生成，并且通过刺激前列腺素& (PGE2)合酶和环氧化酶2 (C0X-2)的表达来增加PGE2的合成。OA在老龄化或肥胖人群中的发生是很普遍的；估计在欧盟中有1亿人患有OA(9)， 并且在2007年美国临床OA的负担已经上升到将近两千七百万人(10)。减轻痛苦和僵硬， 改善身体功能和推迟疾病进展是控制OA的重要的治疗目的。非阿片样镇痛药，非甾体抗炎药(NSAID)以及关节内治疗是目前采用的疗法；NSAIDs的连续使用与胃肠(G. I.)道出血相关联，并且增加了其他不良副作用的风险(11)，使得它们远离用于治疗慢性病的理想目标。因此，鉴定其他潜在的可以用于改善与OA有关的症状的药剂，同时保持有效性和无毒性是不懈的追求。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文所描述的药物用于治疗任何炎症性的疾病，所述炎症性疾病中MMP9、PGE2和NO上升或者所述炎症性疾病是白细胞介素-1介导的，例如类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、脓毒症、脓毒症综合征、骨质疏松症、缺血性损伤、移植物抗宿主疾病、再灌注损伤、哮喘、糖尿病、癌症、骨髓性白血病和其他白血病、银屑病和恶病质、阿尔茨海默病、包括多发性硬化的脱髓鞘神经性障碍、视网膜病， 神经学上的、视网膜的和肌肉的疾病。近年来，人们对使用从中草药中获得的化合物来减轻大量疾病的症状越来越感兴趣，所述疾病例如0A、乳腺癌和前列腺癌、神经元可塑性/记忆性丧失、脑脊髓炎和炎性肠病。来自乳香属(除了乳香以外)的油树脂的制剂通常被称作乳香，已被鉴定为强有效的抗炎剂、抗关节炎剂和止痛剂(最近综述于(15，16))。传统上，齿叶乳香(Boswellia serrata)物种被广泛地用于治疗由炎症性事件引起或者维持的疾病，包括胶原性结肠炎 (17)、克罗恩病(18)以及类风湿性的(19，20)和骨关节炎01-23)。研究表明齿叶乳香对于治疗这些炎症性疾病有一些疗效。在两个不同的(角叉菜胶诱导的和抗原诱导的)关节炎动物模型中，局部给予齿叶乳香到发炎部位使大鼠足肿胀减少了大约50% 00)。齿叶乳香主要的药理学活性成分是α-和β-乳香酸04)，Singh等人宣布α-或β -乳香酸能够作用于早期和晚期的炎症00)。齿叶乳香被认为是通过以选择性的、酶结合的非氧化还原作用和非竞争性的方式抑制5-脂氧合酶05)和通过抑制C0X-1活性06)来发挥其抗炎性质的。最近，人临床试验测试了 5-Loxin 用于治疗膝盖OA的功效，5-Loxin 是一种新的富含30% 3-0-乙酰基-11-氧代-β-乳香酸的齿叶乳香提取物03)。观察到了疼痛评分和功能能力的显著改善，以及滑液ΜΜΡ3的减少03)。除了齿叶乳香(原产于印度)之外，也鉴定了乳香属(Boswellia)家族的其他成员，包括萨卡拉乳香(B. sacra)(原产于阿拉伯半岛)和卡氏乳香(B. carteri) (27)和乳香 (原产于非洲)。我们的工作显示了乳香(B. frereana)不含齿叶乳香的主要药理学活性成分乳香酸(α -或β _)，因此令人惊讶地发现乳香(B. frereana)是有效的抗炎药，并且令人感兴趣地发现了这种抗炎作用是通过不同于乳香属的其他成员所使用的途径进行的。事实上，我们发现了乳香(B. frereana)的药理学活性成分至少部分地通过遏制、去活化或抑制基质金属蛋白酶9(MMP9)发挥作用的。此外，我们也发现了乳香(B. frereana)抑制乙酰胆碱酯酶活性，因此这使得它对于治疗神经性障碍是有用的，在所述神经性障碍中抑制乙酰胆碱酯酶是有利的，所述神经性障碍例如阿尔茨海默病。此外，我们也表明了乳香(B. frereana) 对于杀死癌细胞是有效的，因此这使得它对于治疗癌症，特别是乳腺癌是有用的。
根据第一方面，本发明涉及乳香(Boswellia frereana)作为药物的用途。优选地，所述药物用于治疗或预防炎症性疾病例如，但不限于，关节软骨退化或关节炎，例如骨关节炎或类风湿性关节炎。更优选地，所述药物用于治疗下列病症中的任意一种或多种类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、所有形式的肌营养不良特别是迪谢纳肌营养不良、脓毒症、脓毒症综合征、骨质疏松症、缺血性损伤、移植物抗宿主疾病、再灌注损伤、哮喘、糖尿病、癌症、骨髓性白血病和其他白血病、银屑病和恶病质、阿尔茨海默病、包括多发性硬化的脱髓鞘神经性障碍、乙酰胆碱酯酶紊乱、视网膜病，神经学上的、视网膜的和肌肉的疾病。理想地，患有炎症性疾病或所述病症的个体是哺乳动物，并且最优选地是灵长类或食草动物，例如牛、羊、马或猪，可选择地，所述个体是猫、犬或啮齿类动物。最优选地，所述个体是人。还提供了乳香(Boswellia frereana)在制备治疗或预防上面列出的疾病或病症的药剂中的用途。本发明还提供了用于治疗或预防上面列出的疾病或病症的方法，所述方法包括给予需要该治疗的患者有效量的乳香(Boswellia frereana)。理想地，所述患者是哺乳动物，并且最优选地是灵长类或食草动物如牛、羊、马或猪，可选地，所述个体是猫、犬或啮齿动物。最优选地，所述个体是人。根据本发明的另外一方面，提供了乳香(Boswellia frereana)的提取物，其中所述提取物在有机溶液中是可溶的，并且包含以下的一种或多种a)基质金属蛋白酶9 (MMP9)的抑制剂，b) NO合成的抑制剂，c) PGE2合成的抑制剂；以及d)所述提取物不影响5-脂氧合酶途径；以及e)所述提取物不包含α -或β -乳香酸。在本发明的上下文中，术语“乳香(Boswellia frereana)的提取物”指的是在乳香(Boswellia frereana)的油树脂中存在并且在适当的有机溶剂中可溶的组分的混合物。 所述提取物可以通过将树胶脂与溶剂混合并在避光的环境下放置适当的一段时间，例如几天获得，以便于将树胶的可溶性组分提取到溶剂中。除去任何不溶的树脂。然后除去溶剂留下提取物。为了避免疑惑，“提取物”不指代单一的组分而是指组分的混合物。所述溶剂可以是极性溶剂，代表性地是醇，例如甲醇或乙醇，或非极性溶剂例如己烷。从这个意义上讲，乳香(B. frereana)是独一无二的，因为在其它乳香属物种中己烷仅提取精油部分(挥发油)，并且同样，在其它乳香属物种中乙醇仅分离树脂部分。然而，对于乳香(B. frereana)，己烷(非极性)和乙醇(极性)二者都分离含有60%表羽扇豆醇 (epilupeol)的树脂部分。然而，也可以采用其它提取溶剂例如乙酸乙酯、乙醚、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮、戊烷或甲苯来实现提取。其它合适的溶剂对于植物成分提取领域的技术人员来说是熟知的。优选地，所述提取物包含五环三萜表-羽扇豆醇(pentacyclic triterpene epi-lupeol)或其衍生物或它们任一个的盐。表-羽扇豆醇(印i-lupeol)是五环三萜表-羽扇豆醇的非对映异构体。非对映体的定义为不是对映异构体的立体异构体(即，相互之间的镜像不能重叠)。非对映体，有时称为非对映异构体，通常与其它异构体具有不同的物理性质和不同的反应性。提取物的其它成分包括β-香树素(β-amyrin)、α-香树素(α-amyrin)、 α_7Κ序炼二聚体(a -phellandrene dimers)、 α -侧柏炼(α -thujene)禾口 α -/K序炼 (α-phellandrene)以及它们的异构体，并且适当时，包括它们的盐。更优选地，所述提取物具有图6所示的GC-MS色谱图。更优选地，主要成分为表-羽扇豆醇、β-香树素和α-水芹烯二聚体。本发明的另一方面，提供了用于药物，特别是用于治疗或预防上面所列出的炎症性疾病和病症的提取物或药剂，所述提取物或药剂选自表-羽扇豆醇、β-香树素、α-香树素、α -水芹烯二聚体、α -侧柏烯和α -水芹烯；除羽扇豆醇之外的这些药剂的异构体； 适当时，药学上或兽医上可接受的盐；以及它们的混合物。合适的药学上或兽医上可接受的盐包括碱加成盐例如钠、钾、钙、铝、锌、镁和其它金属盐以及胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、甲葡胺和其它熟知的在Paulekuhn等人， (2007) J. Med. Chem. 50 :6665-6672中概述的和/或本领域技术人员已知的碱加成盐。本发明还提供了提取物或药剂在制备治疗或预防上面列出的疾病或病症的药物中的用途，所述提取物或药剂选自表-羽扇豆醇、β -香树素、α -香树素、α -水芹烯二聚体、α -侧柏烯和α -水芹烯；除羽扇豆醇之外的这些药剂的异构体；适当时，它们的盐；以及它们的混合物。在本发明的另一方面，提供了包括本发明的提取物和载体的组合物。一般地，所述组合物为药用的或兽医用的组合物，并且所述载体为药学上或兽医上可接受的载体。在一个可选择的方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含选自下列的药剂 表-羽扇豆醇、β -香树素、α -香树素、α -水芹烯二聚体、α -侧柏烯和α -水芹烯；除羽扇豆醇之外的这些药剂的异构体；适当时，药学上或兽医上可接受的盐；和它们的混合物； 以及药学上可接受的载体。也可以存在认为对于治疗或预防的疾病或病症合适或适当的其它活性物质。例如，所述组合物也可以包含抗生素或抗细菌剂。所述载体，或者，如果存在多于一种载体的话，所述的每种载体，在与制剂中的其它成分相容的意义上必须是可接受的，并且对于接受者是无毒的。所述制剂包括那些适合用于鼻腔、支气管(吸入)、局部(包括滴眼剂、含服和舌下)、肠胃外(包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内、关节内和真皮内)给药，并且可以通过药学领域已知的任何方法制备。优选地，组合物制备成用于关节内、静脉内、肠胃外、口服、鼻腔、支气管或局部给药。所述组合物可以通过将本发明的提取物与载体结合来制备。一般而言，通过将活性剂与液体载体或细粉化的固体载体或者与液体载体和细粉化的固体载体二者一起均勻地和紧密地结合在一起，然后需要时将产品成型来制备制剂。本发明延伸到用于制备药物组合物的方法，所述方法包括将本发明的提取物与药学上或兽医上可接受的载体 (carrier)或溶媒(vehicle)连接或结合。本发明的口服给药的制剂可以呈现为分离的单位例如胶囊、小包(sachet)或片剂，其中每一个包含预定量的活性剂；散剂或颗粒剂；活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂；或大丸药等。对于口服给药的组合物(例如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括溶媒例如常规的赋形剂例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和海藻酸；以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他硬脂酸金属盐、硬脂酸甘油酯、硅树脂流体、滑石粉、石蜡、油类和硅胶。也可以使用矫味剂如薄荷、冬青油、樱桃调味料等等。可能希望加入着色剂使得剂型容易辨认。也可以通过本领域熟知的方法给片剂包衣。可以通过压制或成型来制备片剂，任选地加入一种或多种助剂。压制片剂可以通过将自由流动形式的活性剂例如粉末或颗粒在合适的机器中压制来制备，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。成型可以通过将粉末状化合物的混合物用惰性液体稀释剂弄湿并在合适的机器中成型来制备。片剂可以任选地被包衣或压痕，并且可以按处方制造以提供缓慢或控制释放活性剂。其它适合口服给药的制剂包括锭剂(lozenges)，所述锭剂含有在调味基中的活性剂，该调味基通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；软锭剂(pastilles)，所述软锭剂含有在惰性基中的活性剂，该惰性基例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口药，所述漱口药包括在适当的液体载体中的活性剂。对于局部应用到皮肤，化合物可以制成乳膏、软膏、冻胶、溶液或悬浮液等。可以用于药物的乳膏或软膏制剂是本领域中熟知的常规制剂，例如，像药剂学的标准教科书(例如英国药典)中所描述的。本发明的提取物可以通过鼻腔、支气管或颊部给予例如气雾剂或喷雾剂用于治疗呼吸道，所述气雾剂或喷雾剂可以以粉末的形式或以溶液或悬浮液的滴剂的形式分散药理学活性成分。具有粉末分散性质的药用组合物除了活性成分之外通常包含具有沸点低于室温的液体推进剂和，如果需要的话，附加物，例如液体或固体非离子或阴离子表面活性剂和/或稀释剂。药理学活性成分在溶液中的药物组合物，除了药理学活性成分之外还包含 合适的推进剂，和此外，如果需要的话，附加的溶剂和/或稳定剂。也可以用压缩空气来代替推进剂，这可能需要通过合适的压缩和膨胀装置的方式来制造。肠胃外的制剂通常是无菌的。治疗有效的本发明提取物的准确量和最佳基于该化合物的途径，由本领域普通技术人员通过比较药剂的血液浓度和具有疗效所需的浓度来容易地确定。本发明的另外一方面提供了治疗或预防上面列出的疾病或病症的方法，所述方法包括给予需要该治疗的患者有效量的a.本发明的提取物；或b.选自下列的药剂表-羽扇豆醇、β-香树素、α-香树素、α-水芹烯二聚体、 α-侧柏烯和α-水芹烯；除羽扇豆醇之外的这些药剂的异构体；当合适时，它们的盐；以及它们的混合物；或c.根据本发明的组合物。根据本发明的另一个方面，提供了获得乳香(Boswellia frereana)提取物的方法，所述方法包括a)从乳香(Boswellia frereana)中获得油树月旨；b)使所述树脂在不透光的环境下暴露于有机液体中；c)除去任何不溶的树脂；和d)除去溶剂以得到乳香(Boswellia frereana)提取物。步骤d)中溶剂的去除可以通过蒸发来实现。选择性地，可以通过向有机提取混合物中加入水得到固体三萜部分的沉淀，理想地，在除去不溶性树脂后进行这个步骤。在本发明优选的方法中，所述树脂暴露于醇溶剂，例如甲醇或乙醇，优选乙醇，并且理想地100%乙醇。然而，也可以使用其它有机溶剂，例如乙酸乙酯、乙醚、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮、戊烷或甲苯。提取物的组分使用气相色谱-质谱法(GC-MQ鉴定，所述气相色谱-质谱法 (GC-MS)鉴定使用装备有Agilent 5973 Network质量选择检测器和Agilent 7683系列自动进样器的Agilent Technologies 6890N气相色谱仪进行。所述提取物包含五环三萜表-羽扇豆醇。提取物的其它组分是β -香树素、α -香树素、α -水芹烯二聚体、α -侧柏烯和α -水芹烯。提取物的GC-MS色谱图如图6所示，从图6中可以看出主要的组分是表-羽扇豆醇、β-香树脂和α-水芹烯的二聚体。任选地，一经获得提取物后将它以浓度为约10mg/ml溶于有机溶剂中，代表性地醇溶剂例如甲醇或乙醇，更常用地，乙醇以及，理想地，100%乙醇。根据本发明的另一个方面，提供了通过本发明前述的方法可得到的提取物。根据本发明的另一个方面，提供了五环三萜例如表-羽扇豆醇的新的来源，其中所述来源是乳香(Boswellia frereana)。此外，前述来源也是β -香树素、α-香树素、 α-水芹烯二聚体、α-侧柏烯和α-水芹烯的来源。进一步，前述的方法提供了其中所述五环三萜和β -香树素、α -香树素、α -水芹烯二聚体、α -侧柏烯和α -水芹烯可以从所述来源提取出来的途径。现参考下列附图仅通过实例的方式来说明本发明，其中图1显示了乳香(Boswellia frereana)不抑制IL_1 α /OSM-诱导的sGAG从软骨外植块(cartilage explant)中的释放。乳香(B. frereana) (100μ g/ml)不影响在 Α.组织，和B.用5ng/ml IL-Ia和10ng/ml OSM处理，在观天的时间里(DMMB分析)从软骨外植块累积释放到介质中的sGAG水平。数据表达为每干重组织的平均sGAG(y g/mg) 士SEM(η =4)(用IL-I a /OSM处理的或不处理的外植块之间的对比，< 0. 01，".ρ < 0. 001)；图2显示了乳香(Boswellia frereana)阻止IL-1 α /OSM-诱导的胶原蛋白从软骨外植块中的释放。乳香(B. frereana) (100 μ g/ml)对在Α.用5ng/ml IL-1 α和IOng/ ml OSM处理的软骨外植块中的胶原蛋白水平没有影响，然而B.乳香(B. frereana)抑制胶原蛋白释放到介质中，即用细胞因子处理观天后胶原蛋白降解(羟脯氨酸分析)。数据表达为每干重组织的平均胶原蛋白(μ g/mg) 士SEM(η = 4)(用IL-I α /OSM处理的或不处理的外植块之间的对比，^^.P < 0. 001，用 IL-I α /OSM+/-100 μ g/ml 乳香(B. frereana)处理的外植块之间的对比，***P = 0. 001)；图3显示了通过减少MMP9转录证明乳香(Boswellia frereana)抑制IL-1 α / OSM-诱导的 MMP9 表达 / 活化。乳香(B. frereana) (100 μ g/ml)抑制 MMP9 酶原(pro_MMP9) 和活性 MMP9(active-MMP9)的表达，并且减少 MMP2 从 5ng/ml IL-I α 和 10ng/ml OSM 处理的软骨外植块的活化。为了保持简洁，在该图中仅分析了 A.第7天和B.第观天代表性的明胶酶谱，但是在第3、14和21天观察到的那些趋势具有代表性。数据表达为每干重组织释放的平均MMP酶原或活性MMP (密度计的单位)，(密度计的单位/mg干重组织)士 SEM (η =4)(未处理的与IL-I α /OSM外植块释放的ΜΜΡ9酶原的对比广〃ρ < 0. 001 ；用IL-1 α / OSM+/" 100 μ g/ml乳香(B. frereana)处理的外植块释放的活性MMP2和MMP9酶原的分别对比，*p < 0. 05，***p < 0. 001)。C.在处理 3 天(qPCR)的外植块中，乳香(B. frereana)部分地抑制细胞因子诱导的MMP9mRNA。数据表示为平均MMP9表达(任意单位)士SEM(n = 4) (ρ = 0. 079)；图4显示了 IL-I α /OSM-诱导的亚硝酸盐生成和乳香(Boswellia frereana)抑制 iNOS mRNA 表达。A.乳香(B. frereana) (ΙΟΟμ g/ml)显著地抑制用 5ng/ml IL-I α 和 10ng/ml OSM处理观天时间的软骨外植块释放亚硝酸盐(Griess分析)。数据表达为每干重组织释放的平均亚硝酸(μ M/mg干重组织)士SEM(n = 4)。B.乳香(B. frereana)在处理3天(qPCR)的细胞因子-刺激的外植块中抑制iNOS mRNA水平。数据表示为平均iNOS 表达(任意单位)士SEM(n = 4)(用IL-I α /OSM处理的或未处理的外植块之间的对比，"^p < 0. ρ < 0. 001，以及用 IL-I α /0SM+/-100 μ g/ml 乳香(B. frereana)处理的外植块之间的对比，*p < 0. 05，**p < 0. 01，***p < 0. 001)；图 5 显示了乳香(Boswellia frereana)抑制 IL-1 α /OSM-诱导的 PGE2 生成、PGE2 合酶和C0X-2mRNA表达。A.在100 μ g/ml乳香(B. frereana存在下，在28天时间内显著地抑制了从5ng/ml IL-Ia和10ng/ml OSM处理的软骨外植块释放的PGE2 (PGE2ELISA)。数据表示为每干重组织的平均PGE2释放(pg/mg干重组织)士 SEM (n = 4)。B.在处理3天(qPCR) 的外植块中细胞因子诱导的PG&合酶和C0X-2mRNA水平同样也被乳香(B. frereana)抑制。 数据表示为平均基因表达(任意单位)士 SEM (n = 4)(用IL-I α /OSM处理的或未处理的外植块之间的对比， P < 0. 05，"ρ < 0. 01，".ρ < 0. 001，以及用 IL-1 α /0SM+/-100 μ g/ ml 乳香(B. frereana 处理的外植块之间的对比，*p < 0. 05，**p < 0. 01，***p < 0. 001)；图6显示了表-羽扇豆醇是乳香(Boswellia frereana)的主要成分。使用气相色谱法和质谱法鉴定乳香(B. frereana)乙醇提取物的主要化学成分。A.总离子流产生气相色谱图，其中数量对应于所鉴定的成分。上方的色谱图的y_轴被扩大以显示在初始的 50分钟内所获得的挥发性成分；B.下方的色谱图代表在整个90分钟的分析中鉴定的化合物。最大峰(第18号)代表主要成分，鉴定为占乳香(B. frereana)提取物的几乎60%的表-羽扇豆醇。同样也鉴定了痕量的其它化合物，包括羽扇豆醇衍生物；图7显示了总离子流(TIC)产生的的色谱图，该色谱图使用气相色谱-质谱法 (GC-MS)用于鉴定A)乳香(B. frereana)的精油提取物。精油的主要峰值经鉴定为α -水芹烯二聚体(11%) ；B)乳香(B. frereana)的己烷提取物。主要的峰经鉴定为表-羽扇豆醇(60% )；图8显示了在保留时间为79. 99分钟时获得的表-羽扇豆醇的质谱图(El+ve)；图9显示了乳香(B. frereana)中存在的通常出现的萜类的化学结构；图10显示了示出不同的树胶含量的三种乳香属物种的乙醇提取物。烧杯1) 衣索比亚乳香，烧杯2-5)乳香(B. frereana)，烧杯6-7)卡氏乳香(B. carteri) 0乳香 (B. frereana)是唯一几乎没有多糖树胶存在的物种；图11显示了乳香(B. frereana)提取物的抗乙酰胆碱酯酶活性A)没有使用任何样品研究假阳性的对照TLC板。B)TLC板用20yL各种浓度的乳香(B. frereana)提取物和20 μ L氢溴酸加兰他敏点样。使用下列样品:1)101.6, 2) 50. 8，3) 25. 4，4) 12. 7,5)6. 35, 6)3. 17mg/ml,7)氢溴酸加兰他敏(ImM)。两块板用流动相甲苯乙酸乙酯(90 10)展开，并且用2. 5mM DTNB/2. 5mM ATCL的50mMTris_HCl缓冲液(pH8. 0)喷雾，随后用乙酰胆碱酯酶溶液(4U/ml)喷雾。观察在黄色背景上的亮白色的点作为乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性。C)检测乳香(B. frereana)乙醇提取物中存在的化合物。TLC板用20 μ L各种浓度 1) 101. 6,2)50. 8,3)25. 4,4) 12. 7,5)6. 35,6)3. 17mg/ml 的乳香(B. frereana)提取物点样。板用流动相甲苯乙酸乙酯(90 10)展开，并用茴香醛检测试剂喷雾。图12显示了乳香(B. frereana)提取物对人癌细胞，特别是MCF-7乳腺癌细胞系的乳腺癌细胞的抗肿瘤性质，两幅图显示了乳香(B. frereana)乙醇提取物在0-2000 μ g/ ml的范围内对MCF-7细胞的影响。在M、48和72小时后使用MTS分析通过甲臜产品的吸收测定响应。数值表示为8个孔的平均校正吸光度。细胞以每孔中有0. Iml生长培养基的切104细胞/cm2接种。在接种后M小时加入乳香(B. frereana)提取物。在所有的孔中调节乙醇的浓度为0.77%。在另外的M、48和72小时后进行MTS分析。使用FLUOstar OPTIMA读出吸收值。表1显示了使用STORGreen 检测的定量PCR分析中使用的引物。使用I^rimer 3 引物设计软件将引物设计为 GenBank 序列(http //www, frodo. wi. mit. edu/cgi-bin/ primer3/primer3 www, cri)；表2用己烷(非极性溶剂)和乙醇(极性溶剂)提取后乳香(B. frereana油树脂的树脂含量；表3显示了乳香(BoswelIia frereana)与相关物种的树胶含量的对比；表4显示了乳香(B. frereana)油树脂的组分的总结；表5显示了水蒸馏提取的乳香(B. frereana油树脂的精油含量；和表6显示了在各种乳香(B. frereana)油树脂(精油，己烷和乙醇)提取物中鉴定的化学组分；和表7显示了 MCF-7细胞培养M、48和72小时后的LD50值。材料和方法除非另外指出，所有的试剂都购自Sigma(Poole，U. K.)。培养基由Dulbecco改良的 Eagle 培养基(DMEM glutamax I /HAMS F12 media (1 1)，Invitrogen, UK)添加 100 单位/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、50 μ g/ml L-抗坏血酸盐_2_磷酸盐和IX胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)组成。索马里乳香油树脂，乳香(Boswellia frereana)(索马里名为Maidi)和卡氏乳香(B. carteri)(索马里名为Beyo)是从索马里兰的哈尔格萨(索马里北部)获得的。衣索比亚乳香(Boswellia papyrifera)是由 Abdi Farah 先生(Somalil and Frankincense Company,Cardiff)友情提供的。溶剂无水乙醇和己烷(高纯度化学试剂级别)购自Fischer Scientific(Loughborough)。乳香(Boswellia frereana)的提取(用于生物测定)收集来自乳香(Boswellia frereana)的胶树脂，并通过在不透光的容器中连续用乙醇(100% )提取胶树脂OOg) 7天来制备活性组分。通过过滤除去不溶的胶树脂，并在 60°C蒸干溶剂。更具体地，精确称量已知量的乳香(B. frereana)胶树脂QOg)，置于500ml 玻璃烧杯中，加入IOOml乙醇。用刮铲搅拌混合物，盖上铝箔和封口膜(para-film)，然后放置7天。使用150ml Express Millipore过滤器过滤乙醇提取物。在缓慢的氮气流下在 60°C的温度下蒸干溶剂。所得的乳香(B. frereana)提取物以10mg/ml的浓度溶解在乙醇中得到工作储备液并储存在_20°C。乳香(B. frereana)提取物的化学组分通过使用装备有Agilent 5973Network质量选择检测器和Agilent 7683系列自动进样器的Agilent Technologies 6890N气相色谱仪的气相色谱-质谱法(GC-MS)分析(见图6)。使用35到450质量单位的扫描范围来获取质谱数据，取样时间为2，其相当于每秒3. 5次扫描。使用MSD Chemstation 计算机软件进行数据采集。单个峰的鉴定是通过将样品的质谱图与那些储存在美国国家标准及技术研究所(NIST)图书馆数据库中的质谱图进行对比，所述OTST图书馆数据库中包含超过 54，000谱图，以及通过将样品的质谱图与公开的文献值对比来进行鉴定。美国国家标准及技术研究所是自然科学研究实验室和美国商各部(网址-www. nist. gov)的机构。可选择的质谱库是从Wiley商业上可获得的(网址-www, sisweb. com/ software/ms/wiley. htm#wiley8)。化学表征油树脂乳香(B. frereana)、卡氏乳香(B. carteri)和衣索比亚乳香的树脂和树胶含量对比用研钵和研杵把来自卡氏乳香(B. carteri)、乳香(B. frereana)和衣索比亚乳香的乳香属油树脂颗粒分别研磨成粉末。将每种油树脂粉末40g分别置于单个的500ml玻璃烧杯中，并在每个烧杯中分别加入IOOml无水乙醇。用刮铲搅拌混合物，盖上铝箔和封口膜 (para-film)，然后放置3天。这段时间过后，搅拌该乙醇提取物，然后在真空条件下使用 150ml Express Millipore过滤器过滤乙醇提取物。记录留在每个过滤器上的不溶于乙醇的树胶(多糖)的重量，经过滤的乙醇提取物储存在-20°C。化学表征乳香(B. frereana)的己烷提取物来自乳香(Boswellia frereana) (20g)的胶树脂使用己烷作为溶剂在不透光的容器中提取3天。通过在2000rpm下离心30分钟除去不溶的胶树脂，移出澄清的上清液层。 在缓慢的氮气流下在40°C温度下蒸干己烷溶剂，并储存在-20°C。化学表征来自乳香(B. frereana)油树脂的精油提取物将去离子水(IL)经过底部的玻璃容器置于水蒸气蒸馏装置，并将50. 6g的乳香 (B. frereana)油树脂置于顶部玻璃容器。这两个玻璃容器仅由多孔的金属网自然分开。将加热套设置为最大功率将水加热至沸腾。将馏出物(300ml)收集在500ml玻璃容器中，加入100ml己烷并振摇混合物。将己烷层(上层)移出，转移到干净的容器中，将溶剂在缓慢的氮气流下蒸干得到芳香的黄色油状物(0. 44g)。软骨退化的体外模型使用活检穿孔器从7日龄牛犊掌骨-指骨的关节获取全厚关节软骨(6mm直径外植块)。在处理之前将软骨移植块在培养基中稳定3天。通过用5ng/ml人重组 IL-I α (Peprotech, U. K.)和 10ng/ml 人重组致癌蛋白 M(0SM ；Peprotech, U. K.)处理软骨移植块，在100μ g/ml乳香(B. frereana)提取物存在或不存在下建立体外软骨退化模型， 表现为蛋白聚糖丢失和II型胶原蛋白分解的特征O9，30)；未处理的外植块作为对照。维持培养物观天的时间，每3天补充培养基和/或处理物。培养3、7、14、21和观天后采集组织和培养基。冷冻干燥软骨外植块48小时的时间，所有的生物化学数据标准化为组织干重(mg)。为了 mRNA分析，外植块用上面指出的处理物培养3天以研究早期基因变化。在 RNA提取之前，外植块在液氮中快速冷冻。细胞毒性分析Cytotox 96 使用CytoTox 96 非放射性细胞毒性分析O^romega)评价细胞生存力(31)。 酶分析定量地测定了由于细胞溶解即通过细胞死亡产生的，培养基中的乳酸脱氢酶水平。将培养基(50 μ 1)吸入到96孔平板，并与50 μ 1重建的底物混合物(reconstitutedsubstrate mix)(试剂盒组分)混合。在室温避光条件下培养30分钟后，使用酶标板读数仪(plate reader)在492nm测定吸光度。硫酸盐粘多糖分析二甲基亚甲蓝(DMMB)分析使用DMMB分析测定在组织外植块中和释放到培养基中的硫酸盐粘多糖(sGAG)水平(32)。将组织外植块(50mg组织1ml缓冲液)置于含有300 μ g木瓜蛋白酶(非特异性的基质蛋白酶)的消化缓冲液中OOmM磷酸钠(pH 6. 8)，ImM EDTA, 2mM DTT)。样品在60°C 培养1小时，或直到组织完全溶解。向样品中加入IOmM碘乙酰胺以使反应性巯基基团烷基化(通过DTT处理产生)并将样品制成最终体积为5ml(50mM Tris (pH 8.0))。使用鲸鱼 4-硫酸软骨素(硫酸酯C)配制系列稀释物，采用标准品范围0-50yg/ml。在与待分析样品相同的缓冲液中配制标准品，所述缓冲液即对于培养基-DMEM-glutamax I ,对于组织提取物-提取物缓冲液(50mM Tris (pH 8. 0)) 0吸取40 μ 1标准品和样品三份到96孔平板， 随后加入200μ1 DMMB试剂(1.6% (w/v) 1，9-二甲基亚甲蓝，3% (ν/ν)氢氧化钠，(ν/ ν)乙醇，0.35% (ν/ν)甲酸)。立即在525nm波长下对板读数，从读数测定的sGAG浓度直接离开标准曲线。读数在标准曲线的限度之外的任何样品用它们各自的缓冲液稀释，吸取标准品到新的孔中重新分析样品。胶原蛋白分析羟脯氨酸分析使用由Woessner改编的方法，用羟脯氨酸分析测定在软骨中和从软骨释放的胶原蛋白的量(31)。简要地说，在110°C下，在12N或6N HCl中分别水解组织外植块和培养基样品M小时，并将样品冷冻干燥。将4-羟脯氨酸溶解在DMEM-glutamax I 中制得范围为1-10μ g/ml的标准曲线。水解物(30μ 1)和标准品分三份加入到96孔平板中，接着加入70 μ 1稀释剂(66% (ν/ν)异丙醇)和50 μ 1氧化剂(18mM氯胺T，50% (ν/ν)储备缓冲液)，然后室温培养5分钟。加入显色试剂(125 μ 1) (3. 7mM 二甲氨基苯甲醛，15% (ν/ν)高氯酸，85% (ν/ν)异丙醇)，在70°C下培养40分钟。检测吸光度(540nm)并从标准曲线计算羟脯氨酸含量。读数在标准曲线的限度之外的任何样品用它们各自的缓冲液稀释，吸取标准品到新的孔中重新分析样品。将羟脯氨酸的值乘以因子7. 14计算总胶原蛋白(33)。明胶酶谱法MMP2和MMP 9的表达/活化的分析通过明胶酶谱法用试验培养基样品评价MMP2和MMP9的表达和活化(34)。在60°C 下在两倍稀释样品缓冲液(60mM Tris (pH 6. 8),2% (w/v) SDS,10% (w/v)甘油，0.01% (w/ ν)溴酚蓝)中使培养基样品变性30分钟。简要地说，将样品装载在含有0.5mg/ml猪明胶 (BDH,Poole,UK)的7. 5% (w/v) SDS聚丙烯酰胺凝胶上，在150V下在IX Laemmli缓冲液中 (25mM Tris, 0. 192M甘氨酸，0. 1%SDS)电泳大约60分钟或直到染色前沿接近凝胶的末端。 以等量干重值装载样品，并把在观天的培养中累积的培养基体积差异考虑在内。凝胶用 2. 5% Triton X-100洗涤3次以除去SDS并让酶复性。凝胶在MMP蛋白分解缓冲液(50mM Tris (pH 7. 8),50mM CaCl2,0. 5M NaCl)中在37°C下培养过夜以活化潜在酶。随后将凝胶染色(0.25% (w/v)考马斯亮蓝R-250，10% (ν/ν)冰醋酸，45% (ν/ν)甲醇)1小时。通过脱色(7.5% (ν/ν)冰醋酸，10% (ν/ν)甲醇)至少一小时或直到明胶分解区变得明显后观察明胶分解活性清晰带。通过扫描光密度测定法(UMAX magic scan)和NIH成像软件(NIH， Bethesda, MD)分析它们相对的量。Griess分析亚硝酸盐水平的测量亚硝酸盐是一种稳定的NO的最终产物，它的绝对浓度是通过使用Griess分析 (Promega)在培养基中测定的。通过使用0. IM亚硝酸钠储备溶液(试剂盒组分)产生亚硝酸盐标准曲线。将溶液稀释到浓度为100 μ M (使用dH20)，并进行两倍量地连续稀释(标准品从1. 56 μ M到100 μ Μ)。将培养基样品(50 μ 1)分三份吸取到96孔平板中，加入50 μ 1 对氨基苯磺胺溶液，将平板在室温下培养10分钟。向每个孔中加入NED溶液(50μ1)，在 MOnm波长处检测吸光度。通过与亚硝酸盐标准曲线对比测定亚硝酸盐(μΜ)。读数在标准曲线的限度之外的任何样品用它们各自的缓冲液稀释，吸取标准品到新的孔中重新分析样品。PGE2ELISA 前列腺素Ε2水平的测量使用高灵敏度的ELISA(PGE2HS-EIA !Cambridge Biosciences)在培养基中测量 PGE2产物。从50ng/ml的储备溶液(试剂盒组分)配制PGE2标准品得到范围20pg/ml到 640pg/ml的标准曲线。一式三份吸取标准品、阴性对照和培养基样品(ΙΟΟμΙ)到96孔平板，随后加入50 μ 1的PGE2HS-EIA过氧化偶联物。向每个孔中加入PGE2HS-EIA抗体 (50 μ 1)，在4°C下将平板培养过夜。除去平板的内容物并将孔用400μ 1水缓冲液(试剂盒组分)洗涤三次。除去水缓冲液后，向每个孔中加入200 μ 1的ρΝρρ底物，使用酶标板读数仪在450nm波长下测量吸光度。通过减去阴性对照的吸光度使吸光度标准化。PG&标准品的对数图与吸光度进行比较，计算样品中PGE2的浓度。读数在标准曲线的限度之外的任何样品用它们各自的缓冲液稀释，吸取标准品到新的孔中重新分析样品。RNA提取、cDNA合成和定量PCR分析软骨外植块在Iml的Trizol 试剂(Invitrogen)的液氮(2000rpm, 1. 5分钟)中使用去细胞膜机(B. Braun Biotech Int.，Germany)均勻加工处理，按照先前描述的方法 (35，36)提取总RNA并产生cDNA。简要地说，向含有经均勻加工处理的软骨的Trizol 中加入175 μ 1氯仿，翻转混合几次并在室温下培养5分钟。离心样品(14，OOOrpm, 15分钟， 40C )收集含有RNA的相，将上层水组分移至无菌的印pendorf。向含有RNA的水相中加入等体积的异丙醇，将管翻转几次混合，在-20°C过夜析出RNA沉淀。通过离心样品使RNA形成球状(14，000rpm，15*#，4°C)；移去上清液并用Iml 75%的乙醇洗涤小球。通过离心使RNA形成球状(14，OOOrpm, 5分钟，4°C )，弃去上清液，将含有RNA的小球在室温下空气干燥大约30分钟或直到乙醇完全挥发。样品在37°C下用DNA酶处理(1U DNA酶，10% (ν/ ν)DNA酶缓冲液)30分钟。加入10% (v/v)DNA-Iater (Ambion)除去残留的DNA酶组分，随后离心分离(10，000rpm，2分钟)使污染物成球；RNA留在上清液中。使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA第一链(20 μ 1反应容积)。简要地说，将1 μ g随机引物和500 μ M dNTPs加入到10 μ 1 RNA中，在65°C培养5分钟。加入切第一链缓冲液、 200mM DTT和10U重组RNA酶抑制剂(ftOmega)之后，样品在42°C培养2分钟。向样品中加 A 200U Superscript III逆转录酶(Invitrogen)并在42°C下培养样品50分钟；加热样品至70°C持续15分钟终止反应。使用Mx3000 QPCR系统(Stratagene)进行实时PCR。 基于STOR Green 检测的实时qPCR分析，设计成在标准化到管家基因18S后(38)用于在 cDNA样品中的iNOS、PGE2合酶、C0X-2 (37)和MMP9的转录图谱。引物使用I^rimerf弓丨物设计软件(http //frodo. wi. mit. edu/cgi-bin/primer3/primer3 www, cgi)设计成 iNOS、PGE2 合酶和MMP9的开放阅读框(表1)。简要地说，将12. 5 μ 1的Sybr Green Jumpstart TaqReadyMix缓冲液加入到IOOnM的每种引物和1 μ IcDNA中，用dH20制成最终体积为25 μ 1 的反应。样品和阴性对照(省略cDNA模板)装载到96-孔微量培养板(Stratagene)中， 并由Mrfro qPCR软件控制PCR反应。全部的反应在复性温度60°C下进行。按照先前描述的(39，40)使用法计算相对定量，使用未处理的对照作为参照组来定量目标基因表达中的相对变化。相对于未处理的对照cDNA样品，在标准化到内源性参考基因18S中的基因表达中数据呈现为倍数变化。当在未处理的软骨cDNA样品中没有基因产物扩增时， 基因表达中的倍数变化是相对于IL-I α /OSM处理的cDNA样品。统计分析将数据标准化到软骨外植块的干重，并呈现为平均值士平均值的标准误差(n = 4外植块/处理)。每个试验重复三次，显示代表性数据。在参数分析(Minitab)前测试常态(Anderson-Darling)和方差齐性(equal variances)数据。使用2_因子归纳线性模型 ANOVA和Tukey’ s post hoc检验，或如在文中指明时使用2_样品t_检验(qPCR分析)进行统计分析。认为P值小于0.05时差异是显著的。乳香(BoswelIia Frereana)提取物乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制分析该用于筛选AChE活性的TLC方法是基于I^hee等人(56)的报道，并且是Ellman 的最初的测定AChE活性的UV方法(Ellman等人，57)修改的版本。化学品和试剂来自电鳗的乙酰胆碱酯酶(AChE，1000U)，Trizma碱、碘化乙酰硫代胆碱(ATCI)、 5，5’ - 二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman试剂)以及氢溴酸加兰他敏都购自 Sigma-Aldrich (Poole, Dorset)。甲苯禾口乙酸乙酉旨购自 Fisher Scientific (Loughborough, Leicestershire)。缓冲溶液的制备(50mMTris-HCl, pH 8)精确称取6. 057g的Tris碱(分子量121. 14g)到1升容量瓶中。加入800ml去离子水，用浓盐酸调节PH值至8，然后用去离子水稀释至容量。缓冲液储存在4°C。制备碘化乙酰硫代胆碱O. 5mM)/5，5’ - 二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB) (2. 5mM)喷雾剂混合物精确称取72. 2mg的ATCl和100. 8mg的DTNB至同一个100ml容量瓶中，用缓冲液稀释至容量，储存在4°C。乙酰胆碱酯酶溶液(4U/ml)的制备将AChE小瓶(1000U)中的内容物转移的250ml容量瓶中，用缓冲液稀释至容量。 溶液储存在_20°C直到需要。样品制备乳香(Boswellia frereana)乙醇提取物的储备溶液(101. 6mg/ml)用乙醇稀释， 得到最终的乳香(Boswellia frereana)浓度为 101. 6,50. 8,25. 4,12. 7,6. 35 和 3. 17mg/ ml ο参比标准制备(ImM)氢溴酸加兰他敏(IOmg)用27ml甲醇精确稀释。TLC 板规格200mmx200mm，厚度 0. 2mm 的硅胶 60F254 购自 VWRInternational (WestSussex)οTLC 展开剂(Development solvent)90ml甲苯和IOml乙酸乙酯加在一起混合。检测试剂0. 5ml茴香醛转移到IOOml容量瓶中，加入IOml冰醋酸。向其中加入85ml甲醇， 随后加入5ml浓硫酸，然后摇勻混合。步骤100 μ 1乳香属提取物施加到TLC板，同时100 μ 1氢溴酸加兰他敏(ImM)作为参比溶液。使用甲苯和乙酸乙酯(90 10)作为展开剂展开TLC板。干燥30分钟后，用20ml的底物/染料混合物(ATCI/DTNB)向板喷雾直到饱和。将板干燥5分钟后用20ml的酶溶液喷雾，然后再干燥。在10-20分钟内对板照相，虽然白色斑点能保持1小时。如果在黄色的背景下观察到白色的点，得到阳性的点。将对照TLC板(没有样品)展开，以研究假阳性， 按照处理TLC板的描述进行处理。通过向展开的TLC板用茴香醛溶液喷雾也检测到了 TLC 组分。乳香(BoswelIia frereana)提取物对人乳腺癌细胞系(MCF-7)的抗肿瘤性质使用人乳腺癌细胞系MCF_7(由加的夫大学的Richard Clarkson博士捐赠，最初来自ECACC)进行研究。人乳腺癌细胞系MCF-7是在1970年从来自一位69岁的患有乳腺癌的白种女人的胸腔积液建立的(58)。该细胞系被广泛地用于作为实验肿瘤模型。MCF-7细胞培养物的维持MCF-7细胞在伊格尔氏基本成分培养基(Minimum Essential Medium Eagle, EMEM)中生长，所述EMEM含有Earle平衡饱和溶液而不含L-谷氨酰胺(Lonza)，其中添加谷氨酰胺anvitrogen)，0· 胰岛素(Sigma)，1 %青霉素和链霉素Gnvitrogen), 10%胎牛血清(Sigma)，1%非必需氨基酸(Lonza)和丙酮酸钠(Ambrex)。在37°C下 5% CO2的空气气氛中使用75cm2烧瓶(Costar)贴壁培养生长。每7天传代培养细胞并以每平方厘米hlO4细胞接种。为了收获细胞，首先除去培养基。然后用大约7ml的0. 25%胰蛋白酶和EDTA(Gibco)轻轻地漂洗细胞层以除去任何剩余的生长培养基。然后加入另外的5ml胰蛋白酶/EDTA，烧瓶培养3分钟以分离细胞并脱离烧瓶表面。使用倒置显微镜(Nikon Diaphot)检查细胞已经脱离。然后向烧瓶中加入 IOml培养基，并温和地上下吸取以分离细胞块。使用Bright Line血球计数器细胞计数板计数细胞数，并接种到每个含有总计20ml培养基的烧瓶中。然后将烧瓶置于培养箱中以使细胞粘住。每周更换一次培养基。使用MTS分析测量细胞响应使用 CelITiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega)试剂盒进行MTS分析。该试剂盒含有20ml MTS溶液和ImlPMS溶液。所有的MTS分析都是在96孔平板(Costar)中进行的。以1. 2X IO3-L 5X IO5细胞/cm2及0. 1-0. 2ml的适当生长培养基接种细胞。在所有的情形下，对照孔中含有相同体积的培养基、相同体积的测试试剂和相同体积的MTS溶液，但是不含有细胞。然后将平板培养。使用重复性的吸管(HandySt印)或多通道吸管和槽(Transferpette)将细胞悬液和 MTS溶液加入孔中。定期用无菌的刮铲搅拌槽中的细胞悬液以避免细胞沉降到表面。接种后24-48小时，酌情加入50 μ 1的测试试剂。接种后24-168小时，以每100 μ 1培养基加 20 μ 1 MTS溶液的量将MTS溶液加入到含有细胞或不含有细胞的孔中。然后将平板放回到培养箱中2小时。接着将平板从培养箱中移出并用轨道平板摇床(MSlMinishaker IKA)摇动10秒以确保反应产物均勻地分散在孔中。使用Anthos reader 2001 (Labtech)酶标板读数仪或FLUOstar OPTIMA(Labtech)酶标板读数仪在492nm读出吸光度。关于生长曲线， 在72小时更换培养基，并在此之后的每M小时更换培养基，以使培养基消耗不会成为混淆变量。为了从孔中除去培养基，将无菌纱布置于平板顶部，然后将它们倒置。培养基被无菌纱布吸收，并通过轻轻敷上另一个无菌纱布除去残留的培养基。然后吸取新鲜的培养基 (0. 2ml)到全部的测试和对照孔中。乳香(Boswellia frereana)乙醇提取物的制备将乳香(B. frereana) (3. 01778g)的乙醇提取物溶于IOml无水乙醇(Fisher Scientific)中得到沈6. 7mg/ml的储备溶液。然后将该储备溶液使用Sartorius PTFE膜 (Fisher Scientific UK)过滤以确保无菌。用培养基将储备溶液稀释得到浓度为所需最终浓度3倍的浓缩物，将50 μ 1的该浓缩物加入到含有0. Iml培养基的孔中，得到孔中最终浓度为88-2000 μ g/ml。然后将样品涡旋化使提取物分散在培养基中。调节乙醇的浓度使其在所有的孔中为常量。调节浓度至包含与含有乳香(B. frereana)提取物最高浓度的孔相同的浓度。该范围为0. 17-0. 77%。在与MTS溶液培养的培养基中可以存在非特异性的背景吸光度。这通过使用与测试孔相同但是不含有细胞的对照孔校正。从所有其它的测试孔的吸光度值减去这些对照孔的平均吸光度得到校正的吸光度。用这些校正的吸光度值在图上绘制甲瓒吸光度。误差棒表示测试孔和对照孔之间差异(se(d))的标准误差，使用下列方程计算se(d) = sqrt (set2+sec2)se(d)=差异的标准误差；sqrt =平方根；set =测试孔的标准误差；sec =对照孔的标准误差。计算LD5tl 值LD5tl值计算为乳香(B. frereana)提取物的浓度，在该浓度下甲瓒吸光度有50%的减少。图是用平均甲瓒吸光度绘制，并表示为0μ g/ml时吸光度的百分比。LD5tl是在曲线上在每次取样时间(与乳香(B. frereana)提取物培养M、48和72小时之后)在50%甲瓒吸光度处获取的。每次实验均进行上述操作，将在每次培养时间的平均值记录在结果中。统计分析用Minitab 15进行统计分析。通过一般线性模型的方式进行双因素ANOVA和三因素AN0VA。使用Tukey同时成对比较(Tukey simultaneous pair wise comparison)来对比平均值。如果方差是不均—— 的(使用Bartlett检测确认)，则使用加权回归。使用的权重为方差的倒数(59)。结果令人惊讶地，如表2所示，发现乳香(B. frereana)油树脂几乎完全可溶于己烷和乙醇，导致了非常高的树脂提取收率(99% )。表2和3表明，乳香(B.frereana)油树脂含有非常少的乙醇不溶性树胶(多糖)。 这点不同于乳香属的其它物种，如卡氏乳香(B. carteri)和衣索比亚乳香，它们中含有的乙醇不溶性树胶成分分别占48%和51 %，如表2所示。据报道来自印度的乳香属油树脂 (齿叶乳香)也含有大量的醇不溶性树胶成分，在对％左右(55)。与来自卡氏乳香、齿叶乳香和衣索比亚乳香的油树脂不同的是，发现这种特别的乳香属物种(乳香(B.frereana))由于其低的树胶含量而不适用于蒸汽蒸馏。与蒸汽接触后树脂软化并且完全地通过多孔的金属网进入热水中。因此，这种用于分离精油的方法成了一种水蒸馏而不是蒸汽蒸馏。如表5所示，使用水蒸馏的乳香(B. frereana)的精油含量非常低(0. 87% )。在植物化学中，通常使用非极性溶剂如己烷来从油树脂中提取挥发油组分，同时通常使用乙醇来提取油树脂中更大极性的树脂馏分。我们先前使用己烷来分离相关的芳香油树脂例如乳香(卡式乳香、衣索比亚乳香)，红没药(Opoponax)(没药(Commiphora guidotti))和没药(myrrh) (Commiphora moImo 1)中的挥发油组分，同时完整地留下油树脂中的内容物树脂和树胶。意料不到的是，在这种情形下，己烷不适用于提取乳香(B.frereana)中的挥发油组分，因为该溶剂同样也提取树脂组分。见图7。乳香 (B. frereana)不影响软骨细胞生存力在沘天的培养期内，用5ng/ml IL-I α和10ng/ml OSM或100 μ g/ml乳香 (B. frereana)分别或联合处理软骨外植块没有显著地影响细胞生存力(数据没有显示)。乳香(B. frereana)不影响软骨退化的体外模型中的sGAG水平用5ng/ml IL-I α 和 10ng/ml OSM 或 100 μ g/ml 乳香(B. frereana)分别或联合处理外植块不影响组织中的sGAG水平(图1A)。相反，相对于那些没有处理的或单独用乳香(B. frereana)处理的外植块，在用IL_1 α /OSM处理的外植块的培养基中检测到了 sGAGs 的量显著增加。(P < 0. 01 ；需要对数变换以分析第3天和第7天的数据)。在培养期内乳香(B. frereana)没有挽救软骨外植块的细胞因子诱导的sGAG损失(图1B)。乳香(B. frereana)减少了软骨退化的体外模型中的胶原蛋白释放在处理期间的外植块中测得的胶原蛋白的量没有可察觉到的差异(图2A)。在培养28天后，相对于未处理的或乳香(B. frereana)处理的外植块，用IL-I α /OSM处理的外植块有显著更多的胶原蛋白从软骨外植块释放到培养基中(P = 0. 001 ；对数变换)。然而， 用IL-I α/OSM和乳香(B. frereana)联合处理的软骨外植块释放的胶原蛋白显著减少(ρ =0. 012 ；对数变换)，回到基本量的水平(图2Β)。在软骨退化的体外模型中，由于ΜΜΡ9的转录的减少，乳香(B. frereana)抑制细胞因子诱导的MMP9的表达和活化。在未处理的外植块中，7天后有极少的MMP9酶原的表达，但是在未处理的和乳香 (B. frereana)处理的外植块中均观察到了 MMP2酶原和活性MMP2 (图3A)。7天后，IL-I α / OSM-刺激的软骨合成了显著更高水平的ΜΜΡ9酶原(ρ < 0. 0001 ；对数变换)。在这个时间点没有观察到活性ΜΜΡ9。在IL-I α /OSM-刺激后，ΜΜΡ2酶原和活性ΜΜΡ2水平没有一点改变。有趣的是，乳香(B. frereana)抑制细胞因子诱导的MMP9酶原合成(ρ < 0. 0001 ；对数变换)，但对于ΜΜΡ2酶原的表达或活化没有影响。培养观天后，在未处理的软骨外植块中没有再观察到ΜΜΡ9酶原，但是存在ΜΜΡ2酶原和活性ΜΜΡ2 (图。在用乳香(B. frereana处理的软骨中这些观察结果也是明显的。总的来说，乳香(B.frereana消除了细胞因子诱导的MMP9的表达和活化。用IL-I α /OSM与乳香(B. frereana)联合处理的外植块表达的 MMP9酶原的量有巨大的减少，该减少从第7天向前非常显著。减少MMP9合成的结果是，消除了活性MMP9酶原的水平，使得表达水平回到未处理的外植块的表达水平。IL-I α /OSM-介导的ΜΜΡ2酶原表达也出现减少，但没有达到显著性(ρ = 0.06;对数变换)。然而，乳香 (B. frereana)的确显著地阻碍了 IL_1 α /OSM对ΜΜΡ2酶原的活化(p = 0. 04 ；分类对数变换)。为了保持简洁，底稿中仅包括第7天和第28天后从外植块中除去的培养基，但是代表了在全部的时间点观察到的趋势。由于ΜΜΡ9蛋白表达对处理敏感，在已经处理3天的组织中将MMP9mRNA水平量化(图3C)。在未处理的和乳香(B. frereana)处理的软骨外植块中 MMP9mRNA低于检测限。然而，乳香(B. frereana)减少了几乎50%的IL-I α /OSM-诱导的 ΜΜΡ9转录，尽管这没有完全达到显著性(ρ = 0. 079 ；2-样品t_检验)。在软骨退化的体外模型中乳香(B. frereana)减少细胞因子-诱导的亚硝酸盐生成并抑制iNOS mRNA表达。由未处理的外植块和用乳香(B. frereana)处理的外植块产生的亚硝酸盐的量是低的(< 5 μ M/mg干重组织)，并且在观天的培养期内没有一点改变(图4A)。如预期的， 相对于未处理的外植块，在细胞因子处理3天后(p< 0. 0033)、7天后(p = 0. 0009)、14天后(P < 0. 0029)、21天后(ρ < 0. 0001)和28天后(ρ < 0. 0001)(数据的对数变换)，显著地增加了亚硝酸盐的生成，但是在乳香(B. frereana)处理14天后(p = 0. 003)、21天后 (P = 0. 0007)和28天后(ρ = 0. 001)(数据的对数变换)显著地抑制IL-1 α /OSM诱导的亚硝酸盐生成。对iNOS mRNA表达水平定量以测定在后期时间点亚硝酸盐的减少是否可能归于在培养早期的转录抑制(图4B)。培养3天后在未处理的软骨外植块中有变化但是少量的iNOSmRNA。在用乳香(B. frereana)处理的软骨中没有检测到iNOS mRNA。如预期的， 相对于未处理的对照，在IL-I α /OSM-刺激的外植块中iNOS mRNA水平有大约50倍的增加 (P < 0. 0001 ；对数变换)，在乳香(B. frereana)的存在下，iNOS mRNA水平减少了大约75% (p = 0. 02 ；对数变换)，与在培养基中观察到的亚硝酸盐的水平一致。在软骨退化的体外模型中乳香(B. frereana)减少细胞因子-诱导的PGE2生成并抑制PGE2合酶和C0X-2mRNA表达。由未处理的外植块和用乳香(B. frereana)处理的外植块产生的PG&的量在28 天的培养期内没有一点改变(< 25pg/mg干重组织)(图5A)。如预期的，相对于未处理的外植块，在细胞因子处理3天后(p = 0. 012 ；对数变换)，7天后(p = 0. 0002)，14天后(ρ =0. 006 ；对数变换)，21天后(ρ < 0. 0001 ；对数变换)以及28天后(ρ < 0. 0001 ；对数变换)显著地增加了 PG&生成，范围为100-1000pg/mg干重组织。在乳香(B. frereana)的存在下处理7天后(p = 0. 03)，21天后(p = 0. 005 ；对数变换)以及28天后(p = 0. 0005 ； 对数变换)显著地抑制了外植块中IL-I α /OSM-诱导的PGE2生成；然而这没有回到基态水平。也对PGE2合酶mRNA表达水平进行定量以测定在培养期观察到的PGE2减少是否可能归于PGE2合酶转录的抑制(图5B)。在培养3天后，在未处理的软骨或用乳香(B. frereana) 处理的组织中的PGE2合酶mRNA都是检测不到的。在软骨中IL-I α /OSM刺激PGE2合酶 mRNA表达，当用乳香(B. frereana)共处理细胞因子-刺激的外植块时，PGE2合酶mRNA表达减少了几乎60% (p = 0.007 ;2_样品t-检验)。共同地，也对C0X-2(PG&合成中的限速酶)的mRNA水平进行定量。在未处理的软骨中观察到了极少量的C0X-2 mRNA，而在用乳香(B. frereana)处理的软骨中的水平是检测不到的(图5B)。相对于未处理的软骨，在 IL-I α /OSM刺激的外植块中C0X-2 mRNA水平有显著的12倍的增加(ρ < 0. 0001)，当用乳香(B. frereana)共处理时 C0X-2 mRNA 水平减少了将近 75% (p = 0. 0001)。表-羽扇豆醇是乳香(B. frereana)的主要成分如图所示，使用GC-MS鉴定出大约81%的存在于乳香(B. frereana)乙醇提取物中的组分(图6)。鉴定出的主要组分，并且占乳香(B. frereana)提取物的59. 3%的是表-羽扇豆醇(图6B)。鉴定的乳香(B. frereana)乙醇提取物中的其它次要成分是β _香树素 (6. 35%)、醋酸羽扇豆醇酯(3. 10%), α -香树素(2. 38%), α -水芹烯二聚体3 (1. 10%), α -水芹烯二聚体5 (0. )、α -侧柏烯(0. 34% )和α -水芹烯(0. 24% ) 0乳香(B. frereana)抑制乙酰胆碱酯酶发现乳香(B. frereana)提取物用酶、底物和检测试剂喷雾后，在TLC板的黄色背景上产生亮白色的点。在全部的检测浓度下(101.6-3. 17mg/ml)，它们能够抑制乙酰胆碱酯酶活性。参考标准氢溴酸加兰他敏(lmM)，一种已知的AChE抑制剂，也在TLC板的基线上产生亮白色的点。在对照TLC板上，没有观察到相应于假阳性的白色的点。乳香(B. frereana)杀死癌细胞乳香(B. frereana)提取物浓度为800 μ g/ml或更大导致甲瓒吸光度的下降，表明线粒体活性的下降和细胞数目的减少。如果乳香(B. frereana)提取物活性组分引起细胞周期停滞(白细胞郁积)会发生这种细胞数目减少。在除了 GO外的阶段延长的细胞周期停滞对细胞来说是无法忍受的，并最终导致间接的细胞损伤和细胞死亡。乳香(B. frereana) 提取物的细胞毒性组分可以因此表现为针对MCF-7人癌细胞的细胞凋亡诱导物和细胞死亡的增强子。讨论在本研究中，我们利用软骨退化的体外模型( ，30)来测定知道较少的乳香属物种-乳香(B. frereana)是否具有任何抗炎功效，并因此可以开发成为治疗多种炎症性疾病的替代疗法。在存在或不存在100 μ g/ml乳香(B. frereana)的情况下，在观天的时间内，用5ng/ml IL-I α和lOng/iriOSM处理软骨外植块。在28天的培养期内没有IL-1/ OSM或乳香(B. frereana)-诱导的细胞毒性的迹象。在该体外模型中，细胞因子或乳香 (B. frereana)对于保留在外植块中的sGAG或胶原蛋白的量都没有任何可辨别的效果。然而，在IL-I α /OSM分别刺激3天和21- 天后，sGAG和胶原蛋白从外植块释放的量均有显著的增加，这与先前的报道是一致的01，42)。在IL-la/OSM的存在下，在观天的时间里， sGAG含量的大约50%释放到培养基中，因此，稍微有些令人吃惊的是在组织中的sGAG的量没有反映出这一点。我们推测在细胞因子的存在下，组织不断地合成新的sGAG来代替损失掉的SGAG03)。培养基中的sGAG和胶原蛋白的检测主要表示ECM组分从组织中的降解和释放。有趣的是，乳香(B. frereana只能挽救IL-1/0SM-介导的胶原蛋白降解。在28天的时间里，乳香(B. frereana)对于细胞因子刺激后释放到培养基中的sGAG的量没有影响；这表明在胶原蛋白和sGAG之间应该存在不同的作用机制以解释观察到的不同的抑制。胶原蛋白分解的关键的介质包括MMP9和MMP1304)。在病态的关节软骨中观察到了活性MMP9的水平增加(1，3-6)。为了确定观察到的由IL-I α/OSM释放的胶原蛋白的增加以及随后由乳香(B.frereana)的调节是否表示分解代谢的表型，分析了 MMP9酶原的表达和活化状态。在28天的时间里，在细胞因子-刺激的外植块中MMP9酶原的合成和活化大量增加，这可能正像先前报道的(44)，促进了在第21- 天的胶原蛋白的显著释放。乳香(B. frereana)抑制IL_1 α /OSM-介导的ΜΜΡ9酶原的合成和活化，使表达恢复到基态水平。[尽管出现活性ΜΜΡ2的水平增加，但是IL-I α /OSM对于ΜΜΡ2酶原的表达没有显著的影响。第观天后，乳香(B. frereana)也抑制MMP2酶原的活化]。我们的数据表明，在用乳香(B. frereana)处理的外植块中，IL_1 α /OSM-诱导的ΜΜΡ9酶原的表达的减少可能起于我们观察到的ΜΜΡ9的转录抑制。ΜΜΡ9的合成由大量的前炎症分子调节，所述前炎症分子包括NO和C0X-2 (45)，并且已经很好的确定NO和C0X-2都涉及软骨退化03，46)。在整个培养期内，在用IL-Ia/ OSM刺激的软骨外植块中亚硝酸盐显著上升，所述亚硝酸盐是NO的稳定的终产物，同时在乳香(B. frereana)的存在下，细胞因子诱导的NO生成被显著地抑制。我们推测MMP9酶原合成和活化的大量增加可以部分地归因于NO水平以及乳香(B. frereana)抑制NO生成的作用阻止了下游MMP9的合成和/或活化。OA中的关节炎症也增加了 C0X-2的循环水平，导致了 PGE2合成的增加，所述C0X-2是PGE2合成的限速酶。先前的研究表明，在试验的OA的犬模型中，在NO和C0X-2表达之间有联系(45)。在未处理的软骨外植块中观察到IL-I α与 OSM联合使PGE2的合成显著地提高至大约80倍，与先前的研究一致(37，47)。使用IL-I α / OSM联合，乳香(B. frereana)降低了 PG&水平，尽管没有回到基态水平。为了进一步理解在这个软骨退化的体外炎症模型中乳香(B. frereana)的作用机制，我们使用qPCR定量iNOS、PGE2合酶和C0X-2的基因转录物的量。在用IL_1 α /OSM处理以及IL-I α /OSM与乳香(B. frereana)组合存在处理的外植块中观察到了全部都显著增加，基因转录水平显著下降；然而，它们并没有回到在未处理的外植块中观察到的基态水平。我们的数据将显示乳香(B. frereana)对NO和PG&合成的抑制作用是在转录水平受到控制的。尽管已经对齿叶乳香进行了一些研究，并且已鉴定出它的药理学活性成分主要为α-和β-乳香酸(M)，但是对于乳香(B. frereana)的生物活性组分知道较少，仅报道过它的生物活性组分与其它物种不同G8)。使用气相色谱法与质谱法联合，我们鉴定出乳香(B. frereana)的主要组分，其中表-羽扇豆醇几乎占提取物的60 %。尽管乳香 (B. frereana)具有乳香属物种的族谱，但是它没有所述活性组分例如乳香酸，如先前提到的活性组分乳香酸是其它家族成员的特征G8)。表-羽扇豆醇是一种五环三萜；它的异构体羽扇豆醇是一种天然存在的三萜，存在于多种水果和蔬菜中，包括橄榄、草莓和无花果 09)。有趣的是，在我们的研究中理解乳香(B. frereana)作用机制的潜在的重要性是羽扇豆醇的生物化学性质。已显示羽扇豆醇在体外和体内具有大范围的药理学性质包括抗炎和抗关节炎活性(50，51)。口服给予羽扇豆醇到抗原诱导的关节炎的大鼠模型导致足肿胀减少39%，并且尿中的羟脯氨酸和sGAG的量减少，表明羽扇豆醇可以改善炎症症状(51)。局部给予羽扇豆醇到由12-0-十四烷酰-佛波醇酯诱导的炎症的鼠模型，由于显著减少PGE2 以及较弱的抑制亚硝酸盐释放，从而抑制了耳浮肿(50)。我们的观察支持了这种体内数据， 尽管我们看到了就PG&水平而言更大的对抗亚硝酸盐生成的功效，然而，这可能反映了乳香(B. frereana)的活性组分是表-羽扇豆醇而不是羽扇豆醇的事实。局部给予羽扇豆醇到小鼠皮肤肿瘤生成模型显著地抑制皮肤浮肿和增生，同时减少C0X-2和NO合成酶的表达 (52)，与我们体外试验中表-羽扇豆醇的功效一致。C0X-2和NO合成酶的减少归因于抑制 NF-KB的活化。该核转录因子NF-KB在包括类风湿性关节炎在内的慢性炎症性疾病的发展和进展中是关键的参与者(53)。如最近使用动脉粥样硬化的小鼠模型的研究中所证明的， 齿叶乳香的抗炎性质包括调节NF-KB活化(54)。然而，尽管已知齿叶乳香能够抑制5-脂氧合酶功能(25)，但是显示羽扇豆醇对于脂氧合酶产物没有作用(50)，因此羽扇豆醇不可能影响5-脂氧合酶途径。此外，乳香(B. frereana)提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，并且杀死熟知的癌症模型，即乳腺癌细胞系MCF-7。最后，这是首次详细报道乳香(B. frereana)的抗炎、抗乙酰胆碱酯酶和细胞毒性功效。我们新的数据证明用乳香(B. frereana)处理IL_1 α/OSM刺激的软骨外植块通过抑制ΜΜΡ9的表达和活化并显著降低包括N0、PG&*C0X-2的炎症介质的表达来抑制胶原性基质的破坏，从而对于组织退化有一些保护。接着乳香(B. frereana)可以因此被开发成治疗 MMP9介导的疾病或病症的药物，在所述疾病或病症中需要显著减少包括NO、PGE2和C0X-2 在内的炎症介质的表达。乳香(B. frereana)是无毒的，并且对于PG&调节特别有效，对于这种天然存在的化合物的治疗作用可以提供另外的前景。此外，乳香(B. frereana)对于以乙酰胆碱酯酶活性增加为特征的，或是当需要阻断这种活性时的神经性障碍有一些保护。 另外，乳香(B. frereana)具有破坏癌细胞的作用。参考文献1. Davidson RK, Waters JG, Kevorkian L, Darrah C, Cooper A, Donell ST, et al. Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in synovium and cartilage. Arthritis Res Ther. 2006 ；8 (4) :R124.2. Bayliss MT, Hutton S, Hayward J, Maciewicz RA. Distribution of aggrecanase(ADAMts 4/5)cleavage products in normal and osteoarth