软骨细胞中的胶原蛋白和蛋白聚糖合成的促进方法[0002]以商品名“神经妥乐平(Neurotropin) ”销售的药剂包含来自接种有痘苗病毒的兔的炎症皮肤的非蛋白提取物作为有效成分。在日本神经妥乐平(NTP)已广泛用于治疗神经病理性疼痛，包括疱疹后神经痛和腰痛。在动物模型中，NTP已显示出由于下行性单胺能疼痛抑制体系的活化引起的抗伤害性(ant1-nociceptive)效果。NTP还显示出通过抑制激肽释放酶-激肽(kallikrein-kinin)级联的活化，由此抑制舒缓激肽在体内和体外的形成来抑制疼痛路径。[0003]最近报道了 NTP对人椎间盘细胞的肿瘤坏死因子a (TNF- α )和环氧酶-2 (C0X-2)的mRNA表达的抑制效果。然而，不清楚NTP是否具有对椎间盘细胞的胞外基质(ECM)合成的效果。
[0004]将接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于促进软骨细胞如椎间盘细胞(牛髓核细胞(bovine nucleus pulposus cell)或纤维环细胞(annulus fibrosus cell))、关节软骨细胞和半月板细胞中的胶原蛋白和蛋白聚糖的合成。在本发明的方面，提供促进患者的软骨细胞中的蛋白聚糖和/或胶原蛋白合成的方法，所述方法包括向需要此类治疗的患者投与药物学有效量的接种痘苗病毒 的炎症组织提取物。在本发明的另一方面，提供再生软骨细胞的胞外基质的方法，所述方法包括向需要此类治疗的患者投与从接种有痘苗病毒的炎症组织分离的提取物。
[0005]借助附图进一步说明本发明，其中:
[0006]图1为接种痘苗病毒的炎症组织提取物对作为纤维环细胞(AF)的椎间盘细胞中蛋白聚糖合成的活性的实验结果。
[0007]图2为接种痘苗病毒的炎症组织提取物对作为牛髓核细胞(NP)的椎间盘细胞中蛋白聚糖合成的活性的实验结果。
[0008]图3为接种痘苗病毒的炎症组织提取物对作为纤维环细胞(AF)的椎间盘细胞中胶原蛋白合成的活性的实验结果。
[0009]图4为接种痘苗病毒的炎症组织提取物对作为牛髓核细胞(NP)的椎间盘细胞中胶原蛋白合成的活性的实验结果。
[0010]本发明以使用在常氧(normoxic)和低氧(hypoxic)状态下在海藻酸盐小球(bead)中培养的牛髓核细胞(NP)和纤维环细胞(AF)来评价NTP对蛋白聚糖(PG)和胶原蛋白合成的影响的结果为基础。
[0011]关于本发明的接种痘苗病毒的炎症组织提取物，如之前所报道的存在针对在接种有痘苗病毒的炎症组织中产生的生理活性物质、从病变组织中提取该物质的方法和药物学活性等的各种报道(参见W02009/028605的[0008]段，EP2191836，日本专利申请公布号 JP-A-53-101515、JP-A-55-87724、JP-A-1-265028、JP-A-1-319422、JP-A-2-28119、 JP-A-7-97336、 JP-A-8-291077、 JP-A-10-194978、 JP-A-11-80005、JP-A-11-139977、JP-A-2000-336034、JP-A-2000-16942 和 JP-A-2004-300146，以及国际公布号 TO2004/039383)。
[0012]此外，来自接种有痘苗病毒的兔的炎症皮肤的提取物的制剂作为药品是商购可得的，并可用于本发明。如“Drugs in Japan, Ethical Drugs”(2010,由日本医药情报中心(Japan Pharmaceutical Information Center)编辑发行)的 2978-2980 页所记载，该制剂为包含从接种有痘苗病毒的兔的炎症皮肤组织中提取分离的非蛋白活性物质的药剂。已知该制剂有效对抗腰痛，颈臂综合征，症状性神经痛，肩关节周围炎(periarthritisscapulohumeralis)，骨关节炎，伴随皮肤病(湿疹、皮炎、荨麻疹)的瘙痒，过敏性鼻炎，亚急性脊髓视神经炎(subacute myelo-optico-neuropathy)的后遗症如寒冷、感觉异常和疼痛，以及疱疹后神经痛等。批准该制剂作为皮下注射、肌肉注射和静脉注射产品的形式和片剂的形式的处方药，并且商购可得。
[0013]用于本发明的接种痘苗病毒的炎症组织提取物为如上所述从接种有痘苗病毒的炎症组织中提取的非蛋白生物功能调节物质，而在“Drugs in Japan, Ethical Drugs”中列出的来自接种有痘苗病毒的兔的炎症皮肤的提取液制剂被批准为药品，并且商购可得。另外，在上述专利文献中记载的来自接种有痘苗病毒的炎症组织的各种提取物可用作本发明的物质，它们的生产方法和适当的剂量等也在文献中给出。
[0014]可以如下方法获得本发明的接种痘苗病毒的炎症组织提取物:将接种有痘苗病毒的炎症组织压碎；添加提取溶剂来除去组织碎片；然后进行脱蛋白处理；将脱蛋白溶液吸附到吸附剂上；接着洗脱有效成分。
[0015]例如根据下述方法生产接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0016](a)收集接种有痘苗病毒的兔或小鼠等的炎症皮肤组织，并将炎症组织压碎。向压碎的组织添加提取溶剂如水、酹水(phenolated water)、生理盐水或添加有苯酹的甘油水(phenol-added glycerin water) 0然后，过滤或离心混合物，从而获得提取液(滤液或上清液)。
[0017](b)将提取液的pH调整为酸性状态，并加热液体来进行脱蛋白处理。然后，将脱蛋白溶液调整为碱性状态，加热，然后过滤或离心。
[0018](C)将所得滤液或上清液制成酸性，并吸附到吸附剂如活性炭或高岭土上。
[0019](d)向吸附剂添加提取溶剂如水，将pH调整为碱性状态，洗脱吸附组分，从而获得接种痘苗病毒的炎症组织提取物。随后，根据期望，可使洗脱液在减压下蒸发至干燥或冷冻干燥从而给出干物质。。[0020]关于为了通过接种痘苗病毒获得炎症组织的动物，可使用感染有痘苗病毒的各种动物如兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠或小鼠，并且优选的炎症组织为兔的炎症皮肤组织。
[0021]收集并压碎炎症组织，并添加1-5体积的提取溶剂，从而制备乳化悬液。关于提取溶剂，可使用蒸馏水、生理盐水和弱酸至弱碱性缓冲液等。可适当地添加稳定剂如甘油，抗菌/防腐剂如苯酚，以及盐类如氯化钠、氯化钾或氯化镁。此时，可通过借助处理如冻融、超声波、细胞膜溶解酶或表面活性剂来破坏细胞组织，从而促进提取。
[0022]使所得乳化提取液进行过滤或离心等，从而除去组织碎片，然后进行脱蛋白处理。脱蛋白操作可通过通常已知的方法来进行，可应用例如热处理，借助蛋白变性剂如酸、碱、脲和胍的处理，借助有机溶剂如丙酮的处理，等电沉淀以及盐析。然后，通过除去不溶物的一般方法如使用滤纸(例如，纤维素或硝化纤维)、玻璃滤器、C盐(Celite)或蔡氏(Seitz)滤器等的过滤，超滤以及离心，来除去析出的不溶性蛋白质。
[0023]将包含以该方式获得的有效成分的提取液酸化，优选用酸如盐酸、硫酸或氢溴酸将PH调为3.5-5.5，然后吸附到吸附剂上。可用的吸附剂的实例包括活性炭和高岭土。可在搅拌下将吸附剂添加到提取液中，或者可将提取液穿过填充有吸附剂的柱，从而将有效成分吸附到吸附剂上。当将吸附剂添加到提取液中时，通过过滤或离心等除去溶液，从而获得其中吸附有有效成分的吸附剂。
[0024]为了从吸附剂洗脱(脱附)有效成分，将洗脱溶剂添加到吸附剂，从而在室温下或者借助适当的加热或借助搅拌来洗脱，并通过一般方法如过滤或离心等来除去吸附剂。关于要使用的洗脱溶剂，可使用碱性溶剂如调整为碱性PH的水、甲醇、乙醇或异丙醇或者其适当的混合物，并可优选使用调整为PH9-12的水。
[0025]以该方式获得的提取物(洗出液)可适当地制备为以制剂用原料或药剂的适当形式。例如，可将溶液调整为具有几乎中性的PH，以作为制剂用原料，并且可通过浓缩或稀释而调整为具有期望浓度。另外 ，关于注射用制剂，可添加氯化钠来制备等渗生理盐水溶液。此外，可浓缩干燥或冷冻干燥溶液，从而制备可用于片剂等的原料的固体形式。
[0026]对需要治疗的患者的投与方法的实例包括以药物学有效量经口投与和其他投与形式如皮下、肌肉内和静脉内投与。剂量可依据接种痘苗病毒的炎症组织提取物的类型而适当确定。根据“Drugs in Japan, Ethical Drugs”(2978页)，商购可得制剂中所批准的剂量作为处方药基本上经口投与为每天16NU，注射为每天3.6至7.2NU。然而，剂量可依据疾病类型、严重程度、患者个体差异、投与方法和投与期间等适当增加或减少(NU:神经妥乐平单位。神经妥乐平单位由使用SART-应激小鼠通过改进的Randall-Selitto法测量的镇痛效果的ED5tl值所定义,所述应激小鼠为显示比正常动物低的痛阈(pain threshold)的慢性应激动物。INU表示ED5tl值为100mg/kg制剂时神经妥乐平制剂中Img镇痛成分的活性)。
[0027]下文中示出生产接种痘苗病毒的炎症组织提取物的方法的实例以及关于提取物的新型药理学活性，即，对椎间盘细胞中的胶原蛋白和蛋白聚糖合成的促进活性的药理学试验结果。本发明不意于受限于下述实施例的记载内容，其中除相反说明外，所有份、百分比和比均以重量计，所有温度均为V，所有压力均为大气压:
[0028]实施例1
[0029]将健康成年兔的皮肤接种痘苗病毒。将炎症皮肤剥离并压碎，并向压碎的皮肤添加酚水。然后，在加压下过滤混合物，并用盐酸将所得滤液调整为PH5，然后在90-100°C下加热30分钟。通过过滤脱蛋白后,用氢氧化钠将滤液调整为pH9,进一步在90-100°C下加热15分钟，然后过滤。用盐酸将滤液调整为约pH4.5，并添加2%的活性炭。搅拌混合物2小时后离心。向收集的活性炭中添加水。用氢氧化钠将混合物调整为pHIO，在60°C下搅拌1.5小时，然后离心过滤，从而获得上清液。向所收集的活性炭中再次添加水。用氢氧化钠将混合物调整为pHll，在60°C下搅拌1.5小时后离心，从而获得上清液。将两种上清液组合并用盐酸中和，从而获得来自接种有痘苗病毒的兔的炎症皮肤的提取物。在以下药理学试验中，将提取物调整为适当浓度以供使用。
[0030]实施例2
[0031]将健康成年兔的皮肤接种痘苗病毒以使其感染。随后，将炎症皮肤无菌剥离并切碎，然后加入添加有苯酚的甘油水。用均化器将混合物磨碎成乳状。随后，将乳液过滤。用盐酸将所得滤液调整为弱酸性(PH4.5-5.5)，然后在100°C下加热并过滤。用氢氧化钠将滤液调整为弱碱性(PH8.5-10.0)，进一步在100°C下加热，然后过滤。用盐酸将滤液调整为约pH4.5，并加入约1.5%的活性炭。将混合物搅拌1-5小时后过滤。向通过过滤收集的活性炭,添加水。用氢氧化钠将混合物调整为PH9.4-10，搅拌3-5小时后过滤。用盐酸中和滤液。
[0032]实施例3
[0033]接下来，示出关于对椎间盘细胞中胶原蛋白和蛋白聚糖的合成的促进活性的药理学试验结果的实例，其中将实施例1中获得的本发明的接种痘苗病毒的炎症组织提取物(NTP)用作试验物质。下文及图1-4给出NTP对蛋白聚糖(PG)代谢和胶原蛋白合成以及椎间盘细胞中的细胞增殖的效果。
[0034]1.材料和方法
[0035]从14-18个月大的牛尾骨椎间盘中分离的牛髓核(NP)和纤维环(AF)细胞封装在海藻酸盐中(4E+6个细胞/mL)，并在常氧(21%02)或低氧(5%02)条件下在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12中培养11天。用三种不同浓度(0.001NU/ml、0.0lNU/mL和0.1NU/mL)的NTP处理这些培养物3天。为了评价PG和胶原蛋白的合成，在最后4或16小时分别用35S-硫酸或3H-脯氨酸标记培养物。如前所述，在标记后收集小球和介质并由木瓜蛋白酶消化[Masuda，K.等人，J Orthop Res.，21，922-930 (2003)，和Akeda, K, Spine, 31，959-966 (2006)]，单独在介质和海藻酸盐小球中测量放射性前体的掺入量(incorporation)。使用 CellTiter96Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay (Promega, Madison, WI)评价细胞增殖。用各实验中对照组的平均值将来自细胞的不同批次的三次实验的所有数据标准化。使用ANOVA以PSLD试验作为事后检验(posthoctest)来评价处理效果。
[0036]2.结果
[0037]1)细胞增殖
[0038]在7和14天的时间点，氧浓度和用NTP处理不影响NP和AF细胞的增殖。
[0039]2) PG 合成
[0040]在NP细胞中，在5%02培养下用NTP处理使PG合成显著增加(在0.01NU/ml下，+65%，ρ〈0.05，在0.1NU/ml下，+66%，ρ〈0.05，图2)。常氧培养下NP细胞中的PG合成没有明显差异。如图1所示，在AF细胞中，在常氧和低氧条件下，NTP均不改变PG合成的水平。
[0041]3)胶原蛋白合成
[0042]如图3和4所示，通过NTP处理使5%02下的NP细胞以及21%02下的NP和AF细胞的胶原蛋白合成以剂量依赖方式增加(0.1NU/ml下的最高刺激:NP，5%02，+50% ；NP,21%02,+63% ；AF, 21%02，+47%)。
[0043]如上所示，该研究首次示出NTP可刺激椎间盘细胞的胞外基质合成。有趣的是，NTP对NP细胞的PG合成的作用在5%02的培养条件下比在21%02的培养条件下更明显。考虑到NP的体内低氧条件，这些结果可表明NP细胞可在生理相关条件下响应NTP。尽管在5%02和21%02下均观察到NTP对NP细胞的胶原蛋白合成的积极作用，但AF中的刺激仅在21%02条件下观察到。与NP细胞的PG合成增加响应于NTP不同，AF细胞在21%02条件下更响应NTP。因为AF中的氧张力(oxygen tension)显著高于NP,所以21%02下AF细胞对NTP的更大的响应还可反应最佳培养条件。
[0044]软骨细胞存在于各种软骨中，如关节软骨、椎间盘、半月板等。软骨细胞随着细胞分裂而在其周围产生胞外基质，从而使软骨形成。软骨根据无定形基质和纤维成分的含量比而分组为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。胞外基质的主要成分为胶原蛋白和蛋白聚糖。由于NTP对软骨细胞如椎间盘细胞中的胶原蛋白和蛋白聚糖的合成具有促进活性，所以表明NTP对各种软骨的软骨细胞的胞外基质具有再生活性。
[0045]产业h的可利用件
[0046]本发明涉及接种痘苗病毒的炎症组织提取物的新医药用途，特别涉及软骨细胞如椎间盘细胞、关节软骨细胞和半月板细胞中的胶原蛋白和蛋白聚糖合成的促进方法。以下给出本发明的优选实施方案:
[0047]1.一种患者的软骨细胞中的蛋白聚糖和/或胶原蛋白合成的促进方法，其包括向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0048]2.一种软骨细胞中的蛋白聚糖和/或胶原蛋白的合成促进剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0049]3.接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于促进软骨细胞中的蛋白聚糖和/或胶原蛋白合成的用途。
[0050]4.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其中使用培养的软骨细胞中的蛋白聚糖和/或胶原蛋白的合成促进活性作为指标。
[0051]5.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物，其具有对软骨细胞中的蛋白聚糖和/或胶原蛋白的合成促进活性。
[0052]6.一种软骨细胞的胞外基质的再生方法，其包括向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0053]7. 一种软骨细胞的胞外基质的再生剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0054]8.接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于使软骨细胞的胞外基质再生的用途。
[0055]9.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其中使用软骨细胞的胞外基质的再生活性作为指标。
[0056]10.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物，其具有软骨细胞的胞外基质的再生活性。[0057]11.一种椎间盘细胞(牛髓核细胞)中的蛋白聚糖合成的促进方法，其包括向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0058]12.一种椎间盘细胞(牛髓核细胞或纤维环细胞)中的胶原蛋白合成的促进方法，其包括向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0059]13.一种椎间盘细胞(牛髓核细胞)中的蛋白聚糖的合成促进剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0060]14.一种椎间盘细胞(牛髓核细胞或纤维环细胞)中的胶原蛋白的合成促进剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0061]15.接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于促进椎间盘细胞(牛髓核细胞)中蛋白聚糖合成的用途。
[0062]16.接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于促进椎间盘细胞(牛髓核细胞或纤维环细胞)中胶原蛋白合成的用途。
[0063]17.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其中使用培养的椎间盘细胞(牛髓核细胞)中的蛋白聚糖的合成促进活性作为指标。
[0064]18.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其中使用培养的椎间盘细胞(牛髓核细胞或纤维环细胞)中的胶原蛋白的合成促进活性作为指标。
[0065]19.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物，其具有对椎间盘细胞(牛髓核细胞)中的蛋白聚糖的合成促进活性。
[0066]20.一种接种痘苗 病毒的炎症组织提取物，其具有对椎间盘细胞(牛髓核细胞或纤维环细胞)中的胶原蛋白的合成促进活性。
[0067]21.一种椎间盘细胞的胞外基质的再生方法，其包括向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0068]22.一种椎间盘细胞的胞外基质的再生剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0069]23.接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于使椎间盘细胞的胞外基质再生的用途。
[0070]24.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物的判定或评价方法，其中使用椎间盘细胞的胞外基质的再生活性作为指标。
[0071]25.一种接种痘苗病毒的炎症组织提取物，其具有椎间盘细胞的胞外基质的再生活性。
[0072]26.一种变性椎间盘(degenerative intervertebral discs)的治疗或预防方法，其包括向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0073]27.一种变性椎间盘的治疗或预防剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织提取物。
[0074]28.接种痘苗病毒的炎症组织提取物用于治疗或预防变性椎间盘的用途。
[0075]29.一种由椎间盘变性(degeneration)引起的疼痛的治疗或预防方法,其中通过向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物来使椎间盘细胞的胞外基质再生。
[0076]30.一种由椎间盘变性引起的疼痛的治疗或预防方法，其中通过向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物来促进椎间盘细胞(牛髓核细胞)中的蛋白聚糖的合成。[0077]31.一种由椎间盘变性引起的疼痛的治疗或预防方法，其中通过向需要此类治疗的患者投与接种痘苗病毒的炎症组织提取物来促进椎间盘细胞(牛髓核细胞或纤维环细胞)中的胶原蛋白的合成。[0078]32.如上所述在副段落1-31任一中的实施方案，所述炎症组织为兔皮肤组织。