瑞香狼毒在制备抗肿瘤转移药物中的应用的制作方法[0002]恶性肿瘤是当今社会威胁人类健康和患者生存的重大疾病病种。针对恶性肿瘤的治疗药物研发也成为当今医药领域的研究重点和难点。近年来，肿瘤治疗药物的干预靶点和药物治疗理念都取得了巨大的进步和完善。特别是肿瘤特异性靶向药物的研发，极大的提高了抗癌的有效性，也使得患者的治疗和预后效果得到了极大改善。但是，恶性肿瘤的侵袭和转移始终是威胁肿瘤患者生存的最大杀手，同时其也成为肿瘤治疗的最大瓶颈。在当今种类繁多的抗癌药物市场中，临床一线的化疗药物(诸如紫杉醇、阿霉素、多柔比星等)大多作用于肿瘤的生存、增殖、血管生成等领域，以肿瘤转移为特异性靶点的药物较为少见，同时在研药物中，以肿瘤侵袭-转移为作用靶点的设计思路和理论也刚刚处于起步阶段。因此，急迫的临床需求和薄弱的药物支持这一矛盾，成为现今肿瘤治疗的最大障碍，也反映出成为未来肿瘤药物研发的方向和趋势。[0003]瑞香狼毒(Stellera chamaejasme Linn.)为瑞香科狼毒属多年生根莖型草本植物，广泛分布于东北、华北、西北等地。药材获取和制备极为经济便利。同时，狼毒入药最早在《神农本草经》中有所记载。瑞香狼毒在中医中具有散结、逐水等功效；其临床应用在古医书《神农本草经》、《集效方》、《滇南本草》等中也均有记载[6]。瑞香狼毒治疗肿瘤部分具有深厚的中医经验炎症和良好的中医理论支持，首先，其杀伤肿瘤，是基于中医的以毒攻毒的治则。他同时还具有“逐水祛痰”作用和“扶正”的功能[7]，因此也是基于“痰症”治疗的典范。[0004]基于此，现代中药学研究为瑞香狼毒抗癌作为抗癌候选药物的可行性提供了全新和可信的证据，进一步支持和佐证了狼毒抗癌的中医理论。[0005]首先，化学分析表明，其主要含有二萜类、黄酮类、香豆素类以及木脂素类等化合物，在其根部还含有留醇、三萜、树脂以及有毒的高分子有机酸。在上述诸多提取物中，部分组分被证明具有明确的抗癌活性。[0006]更为重要的是，药理学研究表明瑞香狼毒可以通过多样化的途径杀伤肿瘤细胞。一方面，他具有较强的肿瘤细胞毒(Cytotoxicity effects)作用，同时还能抑制肿瘤细胞的周期和分裂增殖；另一方面，瑞香狼毒还对宿主免疫系统具有一定的调节功能，从而从肿瘤-宿主相互作用的角度，为瑞香狼毒的抗肿瘤作用提供了证据。[0007] 自古至今，瑞香狼毒的抗癌功效虽得到了较高的重视，但是其在应用中的较高毒副作用极大地限制了其广泛应用，也成为目前狼毒药效和药理学研究的最大困境。而在降低使用剂量和用药浓度后，其杀伤肿瘤细胞的药效又大大降低。因此，着力解决狼毒应用中的“毒-效关系”，如何在保证用药安全的低毒剂量范围内，最大限度的保留狼毒提取物的药效，高效的抑制肿瘤疾病的进展，缓解用药者的疾病负荷，是解决狼毒应用难题的唯一有效解决策略，也自然成为狼毒广泛应用的切入点和突破点。[0008]本发明立足于临床癌症治疗的急迫需求，以具有良好理论支持和初步研究提不的瑞香狼毒为研究对象，对其抗癌组分的提取和鉴定进行了全面而全新的分析研究。并在低毒的剂量范围内，通过药效学鉴定和药理学分析证明，瑞香狼毒提取物及其中包含的部分单体组分(诸如ICJ)在高侵袭力乳腺癌中具有明确的抑制肿瘤运动-转移的药效，并且通过在体和离体实验首次证明，其能够以TGF-beta为体内的药物作用靶点，通过抑制肿瘤细胞的EMT进程，有效抑制肿瘤的局部浸润和远隔转移。本发明将瑞香狼毒的作用模式从高剂量、高毒性、肿瘤生存抑制的靶点转移至低剂量、低毒性、肿瘤运动调节的靶点。从而通过改变药物作用靶点和作用模式的方法有效的降低了瑞香狼毒毒副作用，并且为临床肿瘤转移的干预这一治疗困境提供了有效的思路和方向；并为其未来的药物研发和临床试验提供了可信的的理论支持和基础研究证据。
[0009]本发明以具有肿瘤耐药细胞株为研究对象，观察瑞香狼毒及单体对耐药株的作用，研究显示瑞香狼毒可以诱导耐药株发生周期阻滞，进而发生凋亡，同时存货通路AKT活化减少，对耐药细胞株有良好的杀伤作用。


[0010]本发明的目的在于提供瑞香狼毒在制备抗肿瘤转移的药物中的应用。
[0011]本发明所述 的瑞香狼毒，既可以是瑞香狼毒药材，也可以是瑞香狼毒提取物，或者单体组分。
[0012]本发明所述的瑞香狼毒或其提取物或单体组分具有调节TGF-beta的功能平衡，促进TGF-beta在肿瘤细胞中的功能重塑的药效活性。
[0013]本发明所述瑞香狼毒或其提取物或单体组分具有上调抑制癌基因和上皮分子核心标志物CDHl的表达水平，抑制间质核心分子标志物VIM的表达，调控肿瘤细胞的EMT进程，抑制肿瘤细胞的间质化转变，从分子水平恢复肿瘤细胞的上皮属性的作用。
[0014]本发明所述瑞香狼毒或其提取物或单体组分具有阻断TGF-beta诱导的肿瘤细胞运动能力和侵袭能力的增强，维持肿瘤细胞在TGF-beta诱导下迁移_侵袭能力在较低水平，从而从功能水平拮抗TGF-beta对肿瘤细胞迁移-侵袭能力的促进作用。同时，在体内水平，能明显抑制乳腺癌高转移株的转移强度。
[0015]本发明所述瑞香狼毒或其提取物或单体组分具有逆转抑制TGR-beta诱导的肿瘤细胞EMT进程，保持在TGF-beta诱导下的肿瘤细胞上皮分子核心标志物⑶Hl的表达水平，抑制TGF-beta诱导的间质核心分子标志物VM的表达上调，从而拮抗TGF-beta对肿瘤细胞EMT进程的诱导和影响。
[0016]本发明所述瑞香狼毒提取物既可以在市场上购买到，也可以通过常规技术手段加工得到，包括:粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到。
[0017]本发明所述的瑞香狼毒提取物，可以通过以下方法制备得到:
[0018]以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料，第一步正相柱层析采用200~300目硅胶，第二步反相柱层析采用40~50 μ m 0DS,第三步高效液相色谱制备采用5 μ mC18键合相制备柱，采用体积浓度75%的甲醇-水溶液为洗脱体系，经三步分离即获得6种化合物纯品O
[0019]根据实施例之一，制备工艺步骤如下:
[0020](I)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏，以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解，在不断搅拌下，加入与浸膏等质量的00目柱层析硅胶，拌样，常温下充分晾干；之后干法上样，常压下过200~300目200~3硅胶柱，依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱，收集氯仿-甲醇20:1流份，负压浓缩回收溶剂后，得一级粗分物。
[0021](2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后，加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50 μ m ODS柱层析填料拌样，常温下充分晾干并处理成粉状；之后干法上样，过40~50 μ m ODS层析柱(柱长40cm，内径8cm)，中压泵加压，压力为5~lOMPa，流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱，收集70%甲醇-水流份，负压浓缩回收溶剂后，得二级粗分物。
[0022]本发明的瑞香狼毒提取物既可以是一级粗分物，也可以是二级粗分物。
[0023]本发明所述的瑞香狼毒单体，可以是以下成分:
[0024]异西瑞香素，雁皮素D，雁皮素C，( + )-狼毒宁B，异狼毒宁B，狼毒宁E。 [0025]本发明的另一个目的在于，提供含有瑞香狼毒或其提取物或单体组分的药物组合物在制备抗肿瘤转移的药物中的应用。
[0026]本发明的再一个目的在于，提供含有瑞香狼毒或其提取物或单体组分的药物组合物在制备抗抗耐药性的药物中的应用。
[0027]本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如:胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。最优选的是胶囊剂。
[0028]本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
[0029]适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
[0030]可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
[0031]口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
[0032]对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
[0033]本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自:甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β —环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
[0034]本发明的药材植物分布广泛，同时我们所建立的提取物和单体的制备工艺成熟稳定，质量可控可靠。



[0035]图1a:以人高侵袭力乳腺癌MDA-MB-231为细胞模型，证明瑞香狼毒提取物在低剂量范围内，具有极为微弱的体外毒性，对细胞的生长和增殖影响不具有统计学差异。
[0036]图1b:以小鼠高侵袭力乳腺癌4Τ1为细胞模型，证明瑞香狼毒提取物在低剂量范围内，具有极为微弱的体外毒性，对细胞的生长和增殖影响不具有统计学差异。以高侵袭力乳腺癌4Τ1、MDA-231为模型，以MTT实验为检测手段，结果表明低剂量瑞香狼毒提取物及单体组分对细胞的生存和增殖能力的影响较为微弱，提示该剂量处於安全剂量范围内。 [0037]图2:以高侵袭力乳腺癌4Τ1为模型，以Transwell实验和Matrigel实验为检测手段，结果表明低剂量瑞香狼毒提取物及单体组分ICJ能明显抑制肿瘤细胞的运动侵袭潜倉泛。
[0038]图3:体内试验研究表明，低剂量ICJ对小鼠体重影响较为微弱，无统计学差异，提示其在体内处於无毒、低毒剂量范围，安全性可以保障。
[0039]图4a:以荧光素酶标记的小鼠高侵袭力乳腺癌为疾病模型，进行小鼠的原位乳腺荷瘤并进行药物干预。体内试验研究表明，低剂量ICJ能够部分抑制小鼠原位乳腺癌的生长。图中小动物成像照片取自小鼠给药后25天。
[0040]图4b:荷瘤小鼠原位肿瘤切除术后，小鼠原位肿瘤的体积统计。
[0041]图4c:荷瘤小鼠原位肿瘤切除术后，小鼠原位肿瘤瘤重的统计。
[0042]图4d:荷瘤小鼠给药后25天，小鼠原位肿瘤总光子数的同居。
[0043]图5a:体内试验研究表明，低剂量ICJ能够明确抑制乳腺癌荷瘤小鼠的转移，
[0044]小动物成像照片取自手术后25天。
[0045]图5b:曲线图以小鼠手术后天数为横坐标，以小鼠不同天数的成像总光子数为纵坐标。
[0046]图6:利用上述动物实验的小鼠血清，通过ELISA的方法，检测不同药物干预对小鼠体内TGF-beta表达和分泌水平的影响。结果表明，ICJ能够在低剂量范围内剂量依赖的抑制小鼠体内TGF-beta的水平。[0047]图7 =Western blot实验结果表明，以MDA-231为细胞模型，低剂量ICJ处理能够剂量依赖的上调CDHl的表达，抑制VM的表达，进而从分子水平揭示出其对肿瘤细胞EMT进程的有效调控作用。
[0048]图8a:激光共聚焦显微镜观察实验表明，低剂量ICJ处理，能够有效降低F_actin在细胞内的组织，减少其纤维形式的聚合。逆转TGF-beta对F_actin的聚合诱导作用。
[0049]图8b:激光共聚焦显微镜观察实验表明，低剂量ICJ处理，能够有效诱导⑶Hl的膜定位，逆转TGF-beta引起的膜脱落现象和细胞质内的聚集。
[0050]图9a =Transwell实验结果表明，ICJ能够从功能水平逆转TGF-beta对MDA-231细胞运动能力的激活作用。明确抑制EMT进程对细胞运动能力的调控影响。
[0051]图9b: Transwe 11结果的定量表示。
[0052]图10:ffestern Blot实验结果表明，ICJ能够从分子水平逆转TGF-beta非经典通路各主要参与成员的表达水平和磷酸化水平。证明ICJ对TGF-beta非经典通路的明确抑制作用。揭示出其通过抑制非经典通路，抑制TGF-beta表达和对EMT进程的活化作用，进一步抑制肿瘤细胞运动-侵袭-转移的药理学机制和行为。

[0053]通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。
[0054]实施例1、瑞香狼毒提取物的制备方法
[0055]本实施例中，以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料，第一步正相柱层析采用
[0056]200~300目硅胶，第二步反相柱层析采用40~50 μ m 0DS，第三步高效液相色谱制备采用5 μ m C18键合相制备柱，采用体积浓度75%的甲醇-水溶液为洗脱体系，经三步分离即获得6种化合物纯品。具体工艺步骤如下:
[0057](I)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏，以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解，在不断搅拌下，加入与浸膏等质量的00目柱层析硅胶，拌样，常温下充分晾干；之后干法上样，常压下过200~300目200~3硅胶柱，依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱，收集氯仿-甲醇20:1流份，负压浓缩回收溶剂后，得一级粗分物。
[0058](2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后，加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50 μ m ODS柱层析填料拌样，常温下充分晾干并处理成粉状；
[0059]之后干法上样,过40~50 μ m ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~lOMPa，流量控制在50~100ml/min，依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱，收集70%甲醇-水流份，负压浓缩回收溶剂后，得二级粗分物。
[0060]实施例2、提取组分单体化合物的制备和纯化；
[0061]高效液相色谱制备:将上述二级粗分物以DMSO溶解，配制成浓度为70mg/ml的供试品溶液，经0.45 μ m微孔滤膜过滤；色谱柱为Chromatorex C18制备柱,粒径5 μ m,尺寸500X60mm ;进样体积为1.4ml,以体积浓度为70%甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在60ml/min，在线紫外检测，检测波长设定为295nm，分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份，负压干燥得6种淡棕色粉末，即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品(质量依次约 5.8mg, 14.lmg, 5.8mg, 23.5mg, 20.4mg, 25.8mg)。[0062]提取组分和单体化合物的化学鉴定
[0063]上述6种化合物的物理参数及结构鉴定结果如下:
[0064]化合物1，白色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:205，350。MS (+ESI) m/z:353.068([M+H]+)。分子量352，分子式为C19H1207。该化合物鉴定为异西瑞香素。
[0065]化合物2，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215, 295。CD (c=0.lmg/ml, MeOH)未出峰。MS (+ESI )m/z:557.148 ([M+H]+)。分子量 556，分子式为 C31H24010。该化合物为新异构体，命名为雁皮素D。
[0066]化合物3，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215, 295。CD (c=0.lmg/ml，MeOH)未出峰。MS (+ESI )m/z:557.148 ([M+H]+)。分子量 556，分子式为 C31H24010。该化合物鉴定为雁皮素C。
[0067]化合物4，淡棕色粉末。UV(Me0H，Umaxnm:215，295。CD(c=0.lmg/ml，MeOH)_4.2(346),0 (325),+13.8 (302),+1.0(274),+3.2(253),0 (240),-2.7 (233),-0.3 (225),-7.3(217)。=+121。( c=0.lmg/ml，MeOH)。MS (+ESI) m/z:571.165 ([M+H]+)。分子量 570，分子式为C32H26010。该化合物鉴定为(+ )-狼毒宁B。
[0068]化合物5，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215, 295。CD (c=0.2mg/ml, MeOH)未出峰。MS (+ESI)m/z:571.165 ([M+H]+)。分子量 570，分子式为 C32H26010。该化合物
鉴定为异狼毒宁B。 [0069]化合物6，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215，295。CD (c=0.lmg/ml,MeOH) -13.0(309) ,0 (299)，+19.4 (286)，O (260)，-1.1 (254) ,0 (247)，+1.6(241)，O (234)，-14.1(217)。MS(+ESI)m/z:571.165( [M+H]+)。分子量 570，分子式为 C32H26010。该化合物为新异构体，命名为狼毒宁E。
[0070]实施例3、瑞香狼毒提取组分及单体成分的体内外药效学筛选和鉴定
[0071]实验中所述瑞香狼毒提取物为实施例1中二级粗分物。
[0072]实验中所述瑞香狼毒单体成分(ICJ)为(+)_狼毒宁B。
[0073]I以高侵袭力乳腺癌为疾病模型，通过MTT法验证了瑞香狼毒对肿瘤细胞体外生存的安全剂量和毒性剂量区间，为低毒、安全的瑞香狼毒提取物研究提供证据。
[0074]选取人高侵袭力乳腺癌MDA-MB-231细胞及小鼠高侵袭力乳腺癌4T1细胞为细胞模型。以3000个细胞/孔的密度铺入96孔板，并与铺板后24小时进行药物处理，使用不同浓度瑞香狼毒提取物处理肿瘤细胞(ESClug/ml和ICJ0.5ug/ml)，并于不同时间点收获细胞(药物处理后24/48/72小时)，通过MTT法检测细胞的生存、增殖水平(以细胞的0D570值和细胞生存率计)。
[0075]实验研究表明，低剂量的瑞香狼毒提取物处理，并不能明显降低药物处理组肿瘤细胞的吸光度数值，肿瘤细胞生存和增殖能力的影响不具有统计学差异。故该实验证明体外低剂量的瑞香狼毒提取物不具有明确药物毒性，剂量安全可靠。
[0076]2以高侵袭力乳腺癌为疾病模型，通过Transwell实验、Matrigel实验、划痕修复实验，证明低剂量瑞香狼毒提取物能够在不影响细胞增殖和生存的前提前下，有效抑制肿瘤细胞的运动、侵袭能力。
[0077]在Transwell实验中，选取人高侵袭力乳腺癌MDA_MB_231细胞及小鼠高侵袭力乳腺癌4T1细胞为细胞模型。将细胞以1*105的细胞数目预先铺入12孔板，铺入后24小时于对数生长期内进行药物处理，处理体系选择无血清培养基。提取组分混合物药物处理浓度设定为lug/ml，单体化合物药物处理浓度设定为0.5ug/ml。药物处理24小时后，消化细胞，以50000/细胞/孔的密度将各组细胞铺入24孔transwell小室中。transwell上层小室培养体系为无血清培养基，下层小室培养体系为10%血清培养基。铺入细胞后，于细胞培养箱中培养18小时。培养结束后，收获、固定细胞，利用棉棒轻柔去除上层未穿膜细胞，并使用结晶紫染色下层穿膜细胞。染色后，随机选取五个高倍镜视野，对穿膜细胞数进行计数，并对各组计数结果进行分析。
[0078]在Matrigel实验中，同样选取高侵袭力乳腺癌MDA_MB_231细胞及小鼠高侵袭力乳腺癌4T1细胞为细胞模型。前期细胞处理和药物处理同Transwell实验设计。在Transwell小室上层小室中，预先于4°C铺入Matrigel胶(按照说明书,使用培养基1:1稀释胶体)，并与37°C孵育6小时，使凝胶凝集，并于凝集后铺入药物处理各组细胞，铺入密度为80000/孔，铺入后继续于细胞培养箱中培养24小时。收获、固定、染色方法及结果获取方法同上述Transwell实验方法。
[0079]通过Transwell实验、Matrigel实验实验证明，低剂量瑞香狼毒提取物和其单体成分处理组，穿膜细胞数明显减少，同阴性对照组相比，具有明确的统计学差异。低剂量瑞香狼毒提取物及单体成分能显著抑制肿瘤细胞的运动和迁移潜能。
[0080]3以小鼠高侵袭力乳腺癌4T1为基本细胞模型，构建带有荧光素酶报告系统的4T1细胞株。并利用该细胞构建荷瘤小鼠模型，通过小动物成像的方法，在体内动态评价低剂量瑞香狼毒单体组分对肿瘤原位癌生长的影响及其对转移肿瘤的抑制效果。实验表明低剂量瑞香狼毒单体成分(ICJ)能够在不影响小鼠体重的低毒剂量范围内，部分抑制小鼠原位肿瘤的生长，同时明显抑制小鼠乳腺癌的转移，该结果支持了体外实验的药效学证据，从体内水平为其抗转移活性提供了研究基础。
[0081]在体内药效学评价中，建模方法为以10000个/鼠的密度接种于BALB/C小鼠的第四对乳垫中。于模型构建一周后进行小动物成像检测(IOOul荧光素钾盐/鼠)，通过总光子数的多少，对小鼠进行随机分组，保证各实验组和对照组中小鼠总光子数不具备统计学差异。分组后，通过腹腔注射的方法，按照0ug/kg30ug/kg300ug/kg的药物浓度对小鼠进行药物体内干预，每日注射一次，每次的药物注射体系为IOOul/鼠。药物干预连续进行36天，期间每隔三天进行小动物成像，动态、无创的监测荷瘤小鼠原位肿瘤的生长情况。给药后36天，通过手术切除小鼠原位肿瘤，计算原位肿瘤的体积和重量，同时观察原位乳腺癌的转移状态和强度(以总光子数计)，并于原位瘤切除后按照原药物浓度和给药方法继续给药25天，评判药物暴露对转移肿瘤的抑制效果。25天后，处死小鼠，收获小鼠肺、肝等脏器，以备后续检查。
[0082] 实验结果表明，低剂量ICJ对小鼠体重影响较为微弱，各给药物同阴性对照组小鼠体重无统计学差异。证明低剂量ICJ的体内毒性较为微弱。在低毒剂量范围内，ICJ能够在体内部分抑制原位肿瘤的体积和重量，部分抑制原位肿瘤的总光子数。同时，ICJ能够在低剂量范围内剂量依赖的抑制转移瘤的转移灶数目和转移强度(以总光子数计)。因此，体内实验明确证明低毒ICJ能够部分抑制原位肿瘤的生长，明显抑制肿瘤的转移进程，具有有效而明确的抗肿瘤转移药效。实施例4、低剂量瑞香狼毒提取物及单体成分的药理机制研究[0083]I利用上一部分中的动物实验模型，获取各组实验动物血清，利用ELISA法，检测药物处理组血清样品中TGF-beta的表达情况，并分析药物处理对TGF-beta的影响趋势。实验证明，瑞香狼毒提取物和单体成分能有效抑制荷瘤小鼠体内血清中TGF-beta的表达水平。
[0084]通过摘眼球取血的方法，从第二部分第三标题的实验动物中获取各药物处理组及阴性对照组动物血清。并适度稀释各组血清(稀释比例为1:30)，利用该血清样品通过ELISA法进行检测。ELISA检测结果表明，各低剂量瑞香狼毒组处理动物血清中TGF-beta含量明显降低，因此本实验证明，低剂量瑞香狼毒提取物及单体成分能够在体内剂量依赖的抑制TGF-beta的表达和分泌。
[0085]2以高侵袭力乳腺癌MDA-231和4LK细胞为模型，通过WesternBlot检测证明低剂量瑞香狼毒提取物能够明显促进抑癌基因和上皮分子核心标志物CDHl的表达水平，抑制间质核心分子标志物VIM的表达，调控肿瘤细胞的EMT进程，抑制肿瘤细胞的间质化转变，从分子水平恢复肿瘤细胞的上皮属性。
[0086]细胞以2*105的数目铺入6孔板，并于铺入后24小时进行药物干预，药物处理浓度设定为0.1/0.5/lug/ml ICJ,继续培养24/48小时，并于各时间点收获细胞，利用RIPA裂解液提取细胞总蛋白质提取物，并利用Westernblot技术，检测各药物处理组中相关蛋白的表达水平和磷酸化水平。
[0087]3以乳腺癌MDA-231和ZR75-1细胞为模型，通过间接免疫荧光的方法，检测瑞香狼毒单体成分ICJ对肿瘤细胞内CDHl及F-actin亚细胞定位及形态的影响。并评价其对TGF-beta的阻断作用。
[0088]利用20ng/ml TGF_beta预处理肿瘤细胞24小时，并与处理后加入低剂量瑞香狼毒单体成分ICJ (lug/ml)，继续药物作用48小时，于相应时间点收获细胞，通过间接免疫荧光的方法检测细胞内CDHl的分布情况:第一抗体选择CDHl抗体，抗体稀释比例为1:200，第二抗体选择FITC标记的兔二抗，稀释比例为1:200。并于染色成功后进行DAPI染色，染色液浓度为100ng/ml。染色后进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
[0089]4以乳腺癌MDA-231细胞为模型，通过Transwell实验，证明低剂量瑞香狼毒提取物能够明显阻断TGF-beta诱导的肿瘤细胞运动能力的增强,维持肿瘤细胞在TGF-beta诱导下运动迁移能力在较低水平，从而从功能水平拮抗TGF-beta对肿瘤细胞运动-迁移能力的促进作用。从而证明ICJ的药物作用靶点分子为TGF-beta。
[0090]利用20ng/mlTGF_beta预处理肿瘤细胞36小时，并与处理后加入低剂量瑞香狼毒单体成分ICJ(lug/ml)，继续药物作用24/48小时，于各时间点收获细胞，利用RIPA裂解液提取细胞总蛋白质提取物，并利用Westernblot技术，检测各药物处理组中相关蛋白的表达水平和磷酸化水平。
[0091]5以乳腺癌MDA-231细胞和ZR75-1细胞为模型，通过WesternBlot检测证明:低剂量瑞香狼毒提取物能够明显逆转抑制TGR-beta诱导的肿瘤细胞EMT进程，保持在TGF-beta诱导下的肿瘤细胞上皮分子核心标志物(⑶Hl等)的表达水平，抑制TGF-beta诱导的间质核心分子标志物(VM等)的表达上调。从而从分子水平证明，ICJ能够拮抗TGF-beta对肿瘤细胞EMT进程的诱导和影响。从而进一步明确ICJ的药物作用靶点分子为TGF-beta。
[0092]利用20ng/mlTGF_beta预处理肿瘤细胞36小时，并与处理后加入低剂量瑞香狼毒单体成分ICJ(lug/ml)，继续药物作用24/48小时，于各时间点收获细胞，利用RIPA裂解液提取细胞总蛋白质提取物，并利用Westernblot技术，检测各药物处理组中相关蛋白的表达水平和磷酸化水平。
[0093]6以乳腺癌MDA-231细胞为模型，过WesternBlot检测，验证TGF-beta相关信号通路的活化水平。实验结果表明，ICJ处理肿瘤细胞后，TGF-beta非经典通路中各重要组成分子的表达水平(ITGB3)磷酸化水平(FAK/p38)均表现出明确的抑制状态，从而从信号通路水平，进一步明确瑞香狼毒单体成分ICJ能够以TGF-beta为药物作用靶点，通过抑制TGF-beta非经典信号通路的活化，进一步抑制了肿瘤细胞的运动_迁移水平，进而最终，抑制了肿瘤的侵袭和转移。
[0094]利用20ng/mlTGF_beta预处理肿瘤细胞36小时，并与处理后加入低剂量瑞香狼毒单体成分ICJ(lug/ml)，继续药物作用24/48小时，于各时间点收获细胞，利用RIPA裂解液提取细胞总蛋白质提取物，并利用Westernblot技术，检测各药物处理组中相关蛋白的表达水平和磷 酸化水平。