专利名称：肿瘤细胞选择性穿膜肽的应用的制作方法近些年来，一些具有细胞膜穿透能力的多肽，如TAT、MPG、PEP-U penetratin、寡聚精氨酸等逐渐成为生物医药领域研究的焦点。这些带正电荷的多肽序列可以穿过细胞膜而不破坏细胞膜的结构。这些天然或人工合成的多肽具有水溶性、低裂解性，并且能够通过非吞噬作用进入各种细胞，故称之为穿膜肽(cell-permeable peptides, CPP)，因穿膜肽最早发现于全链蛋白质的跨膜转运，故又称之为蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)。虽然穿膜肽的穿膜机制目前尚不完全清楚，但它们对生物大分子的转运效率很高且不耗能。这些细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸等碱性氨基酸残基。利用这一特性，各种新型穿膜肽被设计和合成出来，而且人工合成的 octaarginine等穿膜肽穿膜效率远高于天然存在的穿膜肽。穿膜肽一般含有11 30个氨基酸残基，可以分为三类阳离子型穿膜肽诸如TAT peptide和octaarginine ；两亲性阳离子肽诸如penetratin和PEP-I ；疏水性肽诸如MTS等。穿膜肽可以通过共价键或非共价键偶合等方式携带各种生物大分子透过细胞膜，已经实验证实的生物大分子有基因、多月太、蛋白质、纳米粒禾口月旨质体等。(Lain Prochiantz Protein and peptide transduction, twenty years later a happy birthday[J]. Adv Drug Deliv Rev,2008 Mar 1 ；60(4-5) 448-51.)。虽然普通的穿膜肽具有以上的诸多优势，但当其协助抗肿瘤药物或其抗肿瘤药物的载体进入细胞时，它们不能够对普通细胞和肿瘤细胞加以区分，不能够有选择地发挥穿膜作用，因此会导致抗肿瘤药物药效和毒副作用同时得到加强，给患者带来更大的痛苦。因此，构建一种对肿瘤组织具有高度选择性，并且对正常组织具有高度安全性的新型肿瘤细胞选择性穿膜肽为临床所急需。
发明目的本发明的目的旨在提供肿瘤细胞选择性穿膜肽及其用途。技术方案肿瘤细胞选择性穿膜肽，其含有5-12个连续的精氨酸残基组成的碱性氨基酸簇， 其特征在于所述碱性氨基酸簇的C端或N端连接有3个组氨酸残基。其多肽序列包括 RRRRRHHH (R5H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH(R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH(R9H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)。肿瘤细胞选择性穿膜肽的应用，其特征在于是制备含有所述穿膜肽的药物组合物。所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽的应用，其特征在于所述的药物组合物中药物为紫杉醇、多西紫杉醇、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、长春新碱、长春瑞滨、顺钼、 奥沙利钼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、阿糖胞苷、脱氧氟尿苷、依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、米托蒽醌、环磷酰胺、异环磷酰胺、丝裂霉素C、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、吉西他滨、卡培他滨、地西他滨、安西他滨、顺钼、博来霉素、平阳霉素、藤黄酸、新藤黄酸以及这些药物的各种药用盐。所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽的应用，其特征在于含有所述肿瘤细胞选择性穿膜肽的药物组合物的各种制剂。有益成果本发明所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽，具有细胞膜穿透能力，且能够对肿瘤细胞和正常组织细胞加以区分，能够高效地穿过肿瘤细胞膜而对正常组织细胞膜基本不穿透； 本发明的创新精要之处即在于此，由精氨酸残基和组氨酸残基所组成的多肽序列在不同的 PH环境下所带的电荷不同。正常组织细胞通常处在pH7. 4的环境中，而肿瘤组织细胞其pH 一般偏酸性，为5 6. 5，带有本发明氨基酸序列的穿膜肽在正常pH环境下，仅带有少量正电荷，无法与细胞表面高度结合而穿膜；而当到达肿瘤组织细胞表面时由于其偏酸性的环境使得组氨酸和精氨酸协同表现出带有大量正电荷，从而能够高效地与带负电荷的细胞表面相结合，体现出较强的穿透肿瘤细胞膜的作用。本发明所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽对于肿瘤细胞膜的亲和力以及对药物和纳米药物载体的运载能力已经由体内和体外实验所证明。图1是10 μ mol/L的穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3)进入人类急性白血病细胞株HL60 的荧光强度；图2是10 μ mol/L的穿膜肽RRRRRRRRHHH (R8H3)进入人类乳腺癌细胞株MCF-7的荧光强度；图3是不同浓度的游离盐酸多柔比星、未修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物与肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物对人卵巢癌细胞株SK0V3的抑制率实验结果。在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1. 26gRinkamide-MBHA 树脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入
1.82g(2. 80mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0· 58g(2. 80mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 38g(2. 80mmol)H0Bt (1-羟基苯并三唑)和 20mLDMF,室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保护，氨基酸依次为Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRHHH粗肽。将IOOmg上述的RRRRRRRHHH粗肽溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得RRRRRRRHHH纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为1685，与计算值相符。RRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制备方法和过程获取。实施例4以RRRRRRRRHffiKR8H3，R在C端和N端)为例，说明采用固相合成多肽的方法。在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1. 39gRinkamide-MBHA 树脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入
2.OOg (3. 09mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0. 64g(3. 09mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 42g (3. 09mmol) HOBt (1-羟基苯并三唑)和 20mLDMF,室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Rnoc 保护，氨基酸依次为 Tmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-0H, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后树脂用甲醇洗第三次,真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRHHH粗肽。将IOOmg上述的RRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得RRRRRRRRHHH纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为1859，与计算值相符。RRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制备方法和过程获取。实施例5以RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端和N端)为例，说明采用固相合成多肽的方法。在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1. 52gRinkamide-MBHA 树脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入 2. 19g(3. 38mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0· 70g(3. 38mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 46g(3. 38mmol) HOBt (1-羟基苯并三唑)和 20mLDMF,室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Rnoc 保护，氨基酸依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-Arg (Pbf)-0H> Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) _0H。最后树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRHHH粗肽。将IOOmg上述的RRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得RRRRRRRRRHHH纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为2033，与计算值相符。RRRRRRRRRHHH (R在N端)可以采取相同的制备方法和过程获取。实施例6以RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在C端和N端)为例，说明采用固相合成多肽的方法。在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1. 65gRinkamide-MBHA 树脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入 2. 38g(3. 67mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0· 76g(3. 67mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 50g (3. 67mmol) HOBt (1-羟基苯并三唑)和 20mLDMF,室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保护，氨基酸依次为Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH> Fmoc-Arg(Pbf)-OH>Fmoc-His(Trt)-OH>Fmoc-His(Trt)-OH^ Fmoc-His (Trt) -0H。最后树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRRHHH粗肽。将IOOmg上述的RRRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得RRRRRRRRRRHHH纯肽。纯肽的质谱表明， 其分子量为2207，与计算值相符。RRRRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制备方法和过程获取。实施例7以RRRRRRRRRRRHHH(RnH3，R在C端和N端)为例，说明采用固相合成多肽的方法。在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1. 78gRinkamide-MBHA 树脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入 2. 57g(3. 96mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0. 82g(3. 96mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 53g(3. 96mmol) HOBt (1-羟基苯并三唑)和 20mLDMF,室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保护，氨基酸依次为Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRRRHHH粗肽。将IOOmg上述的RRRRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化， 收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得RRRRRRRRRRRHHH纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为2382，与计算值相符。RRRRRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制备方法和过程获取。实施例8
以RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R在C端和N端)为例，说明采用固相合成多肽的方法。在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1. 9IgRinkamide-MBHA 树脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入 2. 75g(4. 25mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0. 88g(4. 25mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 57g(4. 25mmol) HOBt (1-羟基苯并三唑)和 20mLDMF,室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保护，氨基酸依次为Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后树脂用甲醇洗第三次,真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRRRRHHH粗肽。将IOOmg上述的RRRRRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化， 收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得RRRRRRRRRRRRHHH纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量为2556，与计算值相符。RRRRRRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制备方法和过程获取。实施例9以本实验室合成的一系列16种多肽RRRRRHffiKR5H3，R在C端或N端)、 RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH (R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH (R9H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)为例说明本发明肿瘤细胞选择性穿膜肽对2种常见的人类肿瘤细胞的穿膜活性。16种肿瘤细胞选择性穿膜肽N端标记FITC荧光素。RRRRRRRR(R8)购自AnaSpec公司N端标记 FITC荧光素。取人类急性白血病细胞株HL60，离心后加入DMEM完全培养基，吹打成单细胞悬液-M 6孔板，每孔中加入0. 9mL细胞悬液，然后加入0. ImL, 100 μ mol/L的FITC标记的肿瘤细胞选择性穿膜肽或R8培养基溶液，孵育(37°C ,5% CO2) 1小时后，用2mL的PBS溶液离心洗3次，重悬于ImL的PBS溶液中，用于流式细胞仪定量分析荧光强度。取对数生长期的人类乳腺癌细胞株MCF-7，胰酶消化，离心，加入DMEM完全培养基，吹打成单细胞悬液；取出2mL细胞悬液并用IOmL DMEM完全培养基稀释。取6孔板每孔加入2mL细胞悬液，CO2培养箱(37°C )孵育至细胞融合度达到约80%。弃去上层培养液，加入ImL 10 μ mol/L的FITC标记的肿瘤细胞选择性穿膜肽或R8培养基溶液，孵育(37°C， 5% CO2) 1小时。弃去上层穿膜肽溶液，用冷PBS溶液ImL洗2次，加入ImL胰酶消化lmin， 每孔再加入ImL DMEM完全培养基终止消化，吹打每孔细胞成单细胞悬液，然后转移至IOmL 离心管中，离心1000rpm，5min。弃去上层液体，加入2mL PBS溶液重悬细胞，用于流式细胞仪定量分析荧光强度。荧光强度数据分析结果如图1和图2所示。结果表明，本实验室合成的16种肿瘤细胞选择性穿膜肽对于人类急性白血病细胞株HL60和人类乳腺癌细胞株MCF-7均能够很好地发挥穿膜作用，且效果明显强于经典穿膜肽RRRRRRRR(R8)。肿瘤细胞选择性穿膜肽 R5H3、R6H3、R7H3、R8H3、Ri3H3、R10H3、R11H3、R12H3各自的两种不同序列(R在C端或N端)具有相同的穿膜活性。实施例10以本实验室合成的一系列16种多肽RRRRRHffiKR5H3，R在C端或N端)、 RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH (R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH (R9H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端) 为例说明本发明肿瘤细胞选择性穿膜肽对相同组织的正常细胞和肿瘤细胞的选择性穿膜活性。16种肿瘤细胞选择性穿膜肽N端标记FITC荧光素。RRRRRRRR(R8)购自AnaSpec公司N端均标记FITC荧光素。将人类肝癌细胞株H印G-2培养于DMEM培养基中，含10%的胎牛血清，各100mg/L 的氨苄青霉素和链霉素。在37°C，5% CO2，完全饱和湿度下正常培养，三天传代一次。取对数生长期的人类肝癌细胞株H印G-2，胰酶消化，离心，加入DMEM完全培养基， 吹打成单细胞悬液；取出2mL细胞悬液并用IOmL DMEM完全培养基稀释。取6孔培养板，加入盖玻片，接种人类乳腺癌细胞株MCF-7，密度为2 X IO5个/孔，培养过夜，待细胞贴壁后， 更换新鲜培养液，30min后，去掉培养液。每孔加入含有一定浓度的荧光标记的肿瘤细胞选择性穿膜肽或R8-FITC培养液。培养箱孵育一定时间后，去掉培养基，细胞再用PBS洗3次， 用3. 7%的多聚甲醛固定液(PBS配制)在室温下固定细胞5min，再用PBS洗3次。用50% 的甘油(PBS配制)封片后，在荧光显微镜下观察。采用Image-Pro Plus (Version 4. 5 for Windows )来分析细胞荧光强度。结果1 :RRRRRHHH(R5H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH(R7H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH(R8H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRHHH(R9H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)均能有效进入细胞；其中尤以RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)、RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)进入细胞最多；其次是RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端或N端)、RRRRRRRHHH(R7H3，R在C端或 N 端)，RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRHHH (R5H3, R在C端或N端)；而RRRRRRRR(R8)进入细胞的最少。另将正常人类肝细胞株HL-7702培养于RPMI1640培养基中，含20%的胎牛血清， 各100mg/L的氨苄青霉素和链霉素。在37°C，5% CO2，完全饱和湿度下正常培养，每三天传代一次。取对数生长期的正常人类肝细胞株HL-7702，胰酶消化，离心，加入RPMI1640培养基，吹打成单细胞悬液；取出2mL细胞悬液并用IOmL RPMI1640培养基稀释。取6孔培养板， 加入盖玻片，接种正常人类肝细胞株HL-7702，密度为2 X IO5个/孔，培养过夜，待细胞贴壁后，更换新鲜培养液，30min后，去掉培养液。每孔加入含有一定浓度的荧光标记的肿瘤细胞选择性穿膜肽或R8-FITC培养液。培养箱孵育一定时间后，去掉培养基，细胞再用PBS洗3 次，用3. 7%的多聚甲醛固定液(PBS配制)在室温下固定细胞5min，再用PBS洗3次。用 50%的甘油(PBS配制)封片后，在荧光显微镜下观察。采用Image-ProPlus (Version 4.5 for Windows )来分析细胞荧光强度。结果2 :RRRRRHHH (R5H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRHHH(R7H3, R在 C 端或 N端)、RRRRRRRRHHH(I 8H3，R在 C 端或 N端)、RRRRRRRRRHHH(I 9H3， R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHffiKR11H3, R 在 C端或N端)、RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端或N端)均不能有效地进入细胞；然而， RRRRRRRR(R8)可以进入细胞。综合以上结果可知，本发明所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽能够有效地穿过肿瘤细胞膜而不能有效地穿过正常细胞的细胞膜，表现出较高的穿膜效率和较高的选择性。其他肿瘤细胞系和正常细胞系的试验结果都得出了相似的结果，在此不一一列举。实施例11以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHffiKR5H3，R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH (R5H3，R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C 孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例12以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH (R5H3，R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C 孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例13以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH(R6H3，R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C 孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH(R6H3，R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例14以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C 孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH(R6H3，R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例15以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHffiKR7H3，R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C 孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH(R7H3，R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例16以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH(R7H3，R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C 孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH(R7H3，R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷
13脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例17以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在 4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH (R8H3，R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例18以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在 4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRHHH (R8H3，R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例19以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。
依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在 4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHHHd^^，R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M 小时渗漏率小于3%。实施例20以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在 40C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHHH(R9H3，R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRHHH (R9H3，R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M 小时渗漏率小于3%。实施例21以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(R1QH3，R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在 4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置对小时渗漏率小于3%。实施例22以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(R1QH3，R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在 4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置对小时渗漏率小于3%。实施例23以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明， 肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例M以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明， 肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例25以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R在C端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明， 肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%， 常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例沈
以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在N端)与紫杉醇组成的药物组合物来说明其应用方法。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R在N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在N端)修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明， 肿瘤细胞选择性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在N端)对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%， 常温放置M小时渗漏率小于3%。实施例27以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽与紫杉醇组成的药物组合物来说明这一系列穿膜肽对抗肿瘤药物体外抑瘤效果的促进和增强作用。依处方量称取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。IOmL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实紫杉醇和磷脂有效地进行了结合。精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C孵育4小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇磷脂复合物。对修饰前后紫杉醇磷脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽对紫杉醇磷脂复合物的修饰没有对普通紫杉醇磷脂复合物的理化性质产生显著影响，紫杉醇和磷脂的结合率大于97%，常温放置M小时渗漏率小于3%。取人乳腺癌细胞株MCF-7培养于DMEM (高糖)培养基中，含10%的胎牛血清，各 100mg/L的氨苄青霉素和链霉素。在37°C，5% C02，完全饱和湿度下正常培养，隔天传代一次。选取处于对数生长期的人乳腺癌细胞株MCF-7，胰酶消化，并用培养基稀释配成细胞悬液。将细胞接种于96孔板中，每孔约含IXlO4个细胞，在37°C，5% CO2环境中培养对小时，弃去培养液，以不含血清的培养基分别稀释未修饰的普通紫杉醇磷脂复合物和肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇磷脂复合物浓度至1、4、8、10、15、20、30、50、100nmol/L,每个浓度组设置3个复孔，每孔200 μ L。在37°C，5% CO2环境中培养72小时。然后用4°C的三氯醋酸固定，将96孔板于4°C放置1小时，双蒸水洗5次除去三氯醋酸、培养液、代谢产物及血清，空气干燥后加入4g/L磺基罗丹明B (SRB)染色15min，再用醋酸洗5遍。干燥后， 加入lOmmol/LTris液150 μ L溶解，使用酶标仪于波长540nm处测定吸收值A，计算半数抑制浓度(IC5tl)。采用罗丹明B法考察两种紫杉醇磷脂复合物的细胞毒性。对于人乳腺癌细胞株MCF-7，未修饰的紫杉醇磷脂复合物的IC5tl和肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇磷脂复合物的IC5tl如表一所示，结果表明，与未修饰的紫杉醇磷脂复合物相比，肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇磷脂复合物的细胞毒作用明显增强(P < 0. 05)。脂质材料及其他辅料均无细胞毒性，对测定不形成干扰。肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3、R6H3> R7H3> R8H3> R9H3> R10H3> RnH3> R12H3各自的两种不同序列(R在C端或N端)所修饰的紫杉醇磷脂复合物对人乳腺癌细胞株MCF-7的细胞毒作用之间不存在差异。表一各制剂对人乳腺癌细胞株MCF-7的半数抑制浓度(IC50)
制剂IC50 (nmol/L)
未修饰的普通紫杉醇磷脂复合物49. 6 士 4. 7
R5H3修饰的紫杉醇磷脂复合物27. 7 士 2. 8
R6H3修饰的紫杉醇磷脂复合物24. 3 士 2. 4
R7H3修饰的紫杉醇磷脂复合物22. 4 士 3. 1
R8H3修饰的紫杉醇磷脂复合物20. 8 士 2. 1
R9H3修饰的紫杉醇磷脂复合物23. 6 士 2. 5
R10H3修饰的紫杉醇磷脂复合物26. 1 士 3. 2
R11H3修饰的紫杉醇磷脂复合物30. 2 士 4. 6
R12H3修饰的紫杉醇磷脂复合物32. 3 士 4. 1
实施例28
以本发明所述及的肿瘤细胞选择性穿膜肽与盐酸多柔比星组成的药物组合物来说明这--系列穿膜肽对抗肿瘤药物在体外抑瘤 效果的促进和增强作用。
依处方量称取注射用蛋黄卵磷脂和盐酸多柔比星于圆底烧瓶中，加入一定量四氢
呋喃使蛋黄卵磷脂充分溶解，并加入玻璃珠若干。避光条件下，置于水浴恒温磁力搅拌中于 40°C反应3小时。然后减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。加入磷酸盐缓冲溶液(PH6. 5)常温手摇水化药脂薄膜，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均勻的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。离心3000rpm以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯滤膜各5次进行整粒即可制得盐酸多柔比星磷脂复合物。紫外光谱、红红外光谱和差示扫描量热法证实盐酸多柔比星和蛋黄卵磷脂有效地进行了结合。 精密称取IOmg肿瘤细胞选择性穿膜肽，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到以上制得的盐酸多柔比星磷脂复合物分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4°C孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物。对修饰前后盐酸多柔比星磷
19脂复合物的结合率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽对盐酸多柔比星磷脂复合物的修饰没有对普通盐酸多柔比星磷脂复合物的理化性质产生显著影响，结合率大于 90%，常温放置M小时渗漏率小于4%。 取人卵巢癌细胞株SK0V3，在含有10%胎牛血清的DMEN培养液，5% C02，37°C完全湿度下正常培养。取对数生长期的细胞，胰酶消化后用DMEM培养液稀释，按每孔密度为 2X IO5个/孔，培养过夜，待细胞贴壁后，于M孔板中加入不同量游离盐酸多柔比星、未修饰盐酸多柔比星磷脂复合物和肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物各 lmL，并以培养基作为空白对照组。盐酸多柔比星浓度分别为10、2、0. 4,0. 08和0. 016 μ g/ mL。每个浓度做3个复孔。孵育48小时后，每个复孔加入MTT溶液100 yL(5mg/mL) ,5% CO2, 37°C条件下继续培养4小时，弃去上层液体，再在每个复孔中加入二甲基亚砜600 μ L，振荡 IOmin后在酶标仪上测定570nm处各孔的吸光度，取平均值，以培养基为空白对照，计算细胞抑制率。细胞抑制率(％) = [ 1 -A570nm(samp 1 e) /A570nm(contro 1) ] X 100%, A570nm(samp 1 e) 为加入药物后细胞的吸光度，A57tlnm(control)为空白对照细胞的吸光度。在10、2、0. 4、0. 08 和0. 016μ g/mL浓度组，肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物、未修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物和游离盐酸多柔比星对人卵巢癌细胞株SK0V3的抑制率如图 3所示。由结果可知，肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物对人卵巢癌细胞株I0V3的抑制率明显高于普通盐酸多柔比星磷脂复合物和游离盐酸多柔比星(P < 0. 05)。肿瘤细胞选择性穿膜肽 I 5H3、R6H3> R7H3> R8H3> R9H3>R10H3> R11H3^R12H3 各自的两种不同序列(R在C端或N端)所修饰的盐酸多柔比星磷脂复合物对人卵巢癌细胞株SK0V3的抑制率之间不存在差异。
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本发明属于穿膜肽，特别涉及肿瘤细胞选择性穿膜肽及其应用。肿瘤细胞选择性穿膜肽，序列中含有5-12个连续的精氨酸残基组成的碱性氨基酸簇，其特征在于所述碱性氨基酸簇的C端或N端连接有3个组氨酸残基。本发明所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽，具有细胞膜穿透能力，且能够对肿瘤细胞和正常组织细胞加以区分，能够高效地穿过肿瘤细胞膜而对正常组织细胞膜