专利名称：脂肪氧合酶的制作方法脂肪氧合酶(EC1.13.11.12)是催化含有顺，顺-1，4-戊二烯单元的多不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸的氧合作用并产生这些脂肪酸的氢过氧化物的酶。该酶在植物和动物中广泛分布。已经分离了各种植物和哺乳动物来源的脂肪氧合酶基因。另一方面，仅数量有限的微生物脂肪氧合酶是已知的，而且还没有微生物来源的脂肪氧合酶基因被描述过。Su和Oliw(J.Biological Chemistry，273(21)，13072-79(1998)描述了来自禾顶囊壳菌(Gaeumannomycesgraminis)的脂肪氧合酶。发明概述本发明人发现了一种新的真菌脂肪氧合酶并测定了其序列，该序列可用于该酶的工业规模的生产。他们将该基因克隆到大肠杆菌中并保藏了该克隆。因此，本发明提供脂肪氧合酶，其为a)克隆到保藏号为DSM14139的大肠杆菌中的质粒pUC19上的DNA序列编码的多肽，b)具有SEQ ID NO1所示的成熟肽的氨基酸序列的多肽或可以从该多肽通过替代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸而得到的多肽，c)(a)或(b)中定义的多肽的类似物，所述类似物i)和所述多肽有至少50％的同源性，ii)与抗纯化形式的所述多肽的抗体具有免疫反应性，iii)为所述多肽的等位变体，或者d)由在低严紧条件下和i)克隆到保藏号为DSM14139的大肠杆菌中的质粒pUC19上的DNA序列或者ii)编码成熟多肽的SEQ ID NO1的DNA序列或其至少有100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的DNA编码的多肽。本发明还提供了多核苷酸，其含有a)克隆到大肠杆菌DSM14139中的质粒上的编码成熟脂肪氧合酶的部分DNA序列，b)SEQ ID NO1中所示的编码成熟脂肪氧合酶的部分DNA序列，c)a)或b)中所定义的序列的类似物，所述类似物编码脂肪氧合酶且i)和所述DNA序列至少有60％的同源性，或者ii)在高严紧性下和所述DNA序列的互补链或其至少有100个核苷酸的亚序列杂交，iii)为其等位变体，或者d)a)，b)或c)的互补链。本发明的其他方面提供了含有该多核苷酸的核酸构建体和重组表达载体，含有该构建体或载体的重组宿主细胞和通过培养细胞生产脂肪氧合酶的方法。此外，本发明提供了筛选真核文库以得到脂肪氧合酶的方法和对筛选有用的寡核苷酸探针。最后，本发明提供了脂肪氧合酶在烘焙和去污剂中的应用。发明详述基因组DNA来源本发明的脂肪氧合酶基因可得自丝状真菌，如子囊菌门(Ascomycota)，特别是Magnaporthaceae，如Magnaporthe菌株，特别是Magnaporthesalvinii Cattaneo(Mycologia 64(1)，110(1972))。此物种亦称为Curvulariasigmoidea、歧曲长蠕孢(Helminthosporium sigmoideum)、稻小球腔菌(Leptosphaeria salvinii)、Nakataea sigmoidea、稻腐小核菌(Sclerotiumoryzae)和Vakrabeeja sigmoidea。一个例子就是菌株M.salvinii IFO6642。
备选地，可从Pyricularia，如P.oryzae或P.grisea，例如P.oryzae IFO30517中分离该基因。IFO菌株可从发酵研究所(Institute for fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka532-8686，日本)购得。
利用基于本说明书中的DNA序列设计的探针可以从这些生物体中分离脂肪氧合酶基因。
本发明人根据布达佩斯条约将含有得自M.salvinii IFO6642的脂肪氧合酶基因的大肠杆菌菌株保藏于DSMZ-德意志微生物保藏中心(Deut-scheSammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig DE，德国)。保藏日期为2001年2月28日，保藏号为DSM14139。
通过培养转化体生产脂肪氧合酶通过用编码本发明脂肪氧合酶的DNA序列转化合适的宿主细胞，将转化的生物体在允许产生此酶的条件下培养并从培养物中回收此酶可以制得本发明的脂肪氧合酶。
宿主生物体可以是真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞，例如曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)或酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、禾本科镰孢霉(F.graminearum)、接骨木镰孢霉(F.sambucinum)、F.cerealis或酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株。可根据EP238,023(Novo Nordisk)，WO96/00787(Novo Nordisk)或EP244,234(Alko)中描述的一般方法在这些宿主生物体中生产脂肪氧合酶。
LOX的性质本发明的脂肪氧合酶能够氧化多种含有顺-顺-戊二烯基部分的底物。这样，它作用于多不饱和脂肪酸如亚油酸(18个碳原子，2个双键)，亚麻酸(18:3)，花生四烯酸(20:4)，二十碳五烯酸(EPA，20:5)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6)。它还作用于除脂肪酸外的底物，如亚油酸甲酯以及也可能地，甘油三酯。该酶对亚油酸的米氏常数(KM)非常低，并且对该底物有高专一性(Vmax/KM)。
得自M.salvinii的脂肪氧合酶为9-脂肪氧合酶，即它氧化亚油酸和亚麻酸的第9和第10个碳原子之间的双键。
得自M.salvinii的脂肪氧合酶在约pH7有最佳活力，并且它在3-12的宽pH范围内活性很高，在6-11的pH范围内活力大于最佳活力的50％。它在pH5-11孵育过夜后是稳定的。
得自M.salvinii的天然脂肪氧合酶在50-60℃具有最佳活力。在40-60℃其活力较高，在70℃时其活力开始下降。在pH7、高达50℃的条件下孵育30分钟后，该脂肪氧合酶还是稳定的。
重组脂肪氧合酶(在米曲霉中表达)在最适温度下的催化反应速度比在室温下得到的速度增加约10倍。在67.5℃得到最大反应速度。高于最适温度时可发现速度常数急剧下降。据认为，糖基化使得重组酶比野生型酶对于热更稳定。
重组脂肪氧合酶在高达50℃的温度下能保持相当的稳定性至少1小时。在50-60℃之间的更高温度下，活力呈线性下降，并且在高于60℃孵育1小时后检测不到活力。在45℃下的温度孵育时，检测不到活力损失。
脂肪氧合酶的冰冻溶液在保存时损失一些活力。加入10％的甘油后在-20℃保存2周后看不出活力损失，并且在反复融解-冰冻后该酶没有活力损失。
在阴离子表面活性剂存在下，本发明的脂肪氧合酶具有良好的稳定性。这样，得自M.salvinii的脂肪氧合酶在400ppm LAS(直链烷基-苯磺酸盐)存在下是稳定的。
脂肪氧合酶的应用脂肪氧合酶可用于绿色香料(green flavor)的合成，例如从亚麻酸的9-氢过氧化物得到壬烯醛。合成可类似Whitehead等(Whitehead等，1995，Cereal foods world 40(4)，193-197)和US4769243的方法进行。
脂肪氧合酶也可用于如JP H11-29410描述的植物激素的合成。
脂肪氧合酶还是良好的类胡萝卜素氧化剂，因此它可用于漂白含有类胡萝卜素或类胡萝卜素样色素的食品如面粉、油或海洋食品。
其氧化活力可用于对蛋白质、油、淀粉、纤维或它们的混合物进行交联。化学化合物的交联可用来合成聚合物以得到塑性纤维或塑性树脂。脂肪氧合酶可作为去污剂对酚的、类胡萝卜素的或脂的污渍或污秽进行漂白。或者它可用于漂白废水或纺织染料。
脂肪氧合酶可用于漂白含有类胡萝卜素的植物或海洋食品物质。这样它可用于漂白制作面包、面条或意大利面食(pasta)的面粉或者漂白含有虾青素的鱼肉或鱼油。
脂肪氧合酶也可用于在存在脂肪酸、油或脂肪时蛋白质、油、淀粉、植物纤维或它们的混合物的交联。它可用于改变食品的质地或物理性质或者控制脂肪和油的味道，或者在食品用途外还用于生产由天然材料构成的聚合物。交联的化合物可以是化学化合物，例如酚类、羰基、羧基或酰胺化合物或者它们的混合物。它可用于合成塑性纤维或树脂。
脂肪氧合酶还可以与氢过氧化物裂合酶一起协同作用用于合成香料化合物如己醛或己烯醛。或者对于用作上面两种酶的来源的植物材料，脂肪氧合酶可以加入到植物材料中以提高香料化合物的产量。类似的情况可以发生在植物或动物激素的合成中。
最后，脂肪氧合酶可用作漂白剂。它可以用于去污剂中漂白衣物上的酚的、类胡萝卜素的、脂的污渍或污秽。或者它可以用于废水中漂白纺织染料或制浆工业的染料或者用于改变染料质地。
重组表达载体本发明的表达载体典型地包括编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和可选地，选择标记基因、转录终止子、阻抑物基因或各种激活剂基因的控制序列。载体可以是自主复制载体或者可以整和到宿主细胞基因组中。
通过培养转化体进行生产通过用编码本发明脂肪氧合酶的DNA序列转化合适的宿主细胞、将转化的生物体在允许产生此酶的条件下培养并从培养物中回收此酶，可以制得本发明的脂肪氧合酶。
宿主生物体可以是真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞，例如曲霉属、镰孢霉属、木霉属或酵母属，特别是黑曲霉、米曲霉、禾本科镰孢霉、接骨木镰孢霉、F.cerealis或酿酒酵母的菌株。可根据EP238,023(Novo Nordisk)，WO96/00787(Novo Nordisk)或EP244,234(Alko)中描述的一般方法在这些宿主生物体中生产脂肪氧合酶。
可以通过阳离子交换层析一步纯化该酶到同质。
核苷酸探针可根据SEQ ID NO1的DNA序列或者SEQ ID NO2的多肽序列，特别是成熟肽部分的序列设计核苷酸探针。该探针可用于如下所描述的LOX-编码DNA的筛选中。
可以基于SEQ ID NO2中成熟部分的氨基酸序列或者相应部分的DNA序列用标准技术(例如，Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)Molecular cloninga laboratory manual(第二版)Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York中所描述的)制备合成的寡核苷酸引物。它可以是简并探针，典型的含有至少20个核苷酸。
筛选真核DNA文库可通过包括如下步骤的方法得到具有脂肪氧合酶活性的多肽a)制备真核DNA文库，b)筛选文库以选择与上述探针杂交的DNA分子，c)用所选的DNA分子转化宿主细胞，d)培养转化的宿主细胞以表达该DNA分子编码的多肽，以及e)分析表达的多肽以选择具有脂肪氧合酶活性的多肽。
可通过常用方法制备真核DNA文库。它可包括来自于诸如如上所述的合适来源的基因组DNA或者双链cDNA。
DNA序列的分子筛选可通过聚合酶链式反应(PCR)后进行杂交来实施。
根据熟知的方法，可分离出在分子筛选中产生的PCR片段并将其亚克隆到合适的载体中。此PCR片段可用于通过例如菌落或者噬菌斑杂交筛选DNA文库。
杂交杂交可以用于指示给定的DNA序列和对应于本发明DNA序列的核苷酸探针相类似。杂交可在低、中或高严紧性条件下进行。下面详细描述了一个杂交条件的实例。
决定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列杂交的合适条件包括将含有DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中10min，将滤膜在具有5×SSC(Sambrook等，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml超声变性的鲑鱼精子DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交，然后在含有随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.1326-13)、32P-dCTP标记的(比活力＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中于约45℃杂交12小时。然后将滤膜在2×SSC、0.5％SDS中于温度至少55℃，尤其至少60℃，更尤其至少65℃，例如至少70℃或者至少75℃下洗涤两次，30分钟。
用x-光片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。
序列对比(alignment)与同源性本发明的脂肪氧合酶和核苷酸序列可以和此处公开的序列有至少75％或至少85％，尤其至少90％或至少95％，例如至少98％的同源性。
为了本发明的目的，用对蛋白质和DNA对比都有用的Needleman-Wunsch对比(即总体对比)进行了序列对比和同源性得分的计算。对蛋白质和DNA对比分别使用默认的得分矩阵BLOSUM50和单位矩阵。对于缺口中的第一个残基的罚分，对蛋白质为-12而对DNA为-16；对于缺口中其他残基的罚分，对蛋白质为-2而对DNA为-4。对比采用FASTA软件包，版本v20u6(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“改进的生物学序列分析工具”，PNAS 852444-2448和W.R.Pearson(1990)“用FASTP和FASTA进行快速灵敏的序列比较”，Methods in Enzymology，18363-98)。
实施例材料与方法分子克隆技术在Sambrook等(1989)中描述。
下面的商品化质粒和大肠杆菌菌株用于亚克隆和DNA文库构建pT7Blue(Novagen)pUC19(TOYOBO，日本)大肠杆菌JM109(TOYOBO，日本)大肠杆菌DH12S(GIBCO BRL，Life Technologies，USA)用DIG标记和检测试剂盒(Boehringer Manheim)进行杂交探针的标记和检测。尼龙膜Hybond-N+(Amersham，英国)用于菌落杂交中DNA的转移。
大豆脂肪氧合酶(I-B型)(目录号#L7315)和虾青素(目录号#A-9335)由Sigma提供。β-胡萝卜素(目录号#031-05533)由Wako提供。
培养基和缓冲液COVE-ar每升342.3g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10mM丙烯酰胺，15mM CsCl2，30g纯净琼脂(Difco)COVE2-ar每升30g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10mM丙烯酰胺，30g纯净琼脂(Difco)COVE盐溶液每升26g KCl，26g MgSO4-7H2O，76g KH2PO4，50mlCove微量金属。
Cove微量金属每升0.04g NaB4O7-10H2O，0.4g CuSO4-5H2O，1.2gFeSO4-7H2O，0.7g MnSO4-H2O，0.7g Na2MoO2-2H2O，0.7g ZnSO4-7H2O。
AMG微量金属每升14.3g ZnSO4-7H2O，2.5g CuSO4-5H2O，0.5gNiCl2，13.8g FeSO4，8.5g MnSO4，3.0g柠檬酸。
YPG每升4g酵母抽提物，1g KH2PO4，0.5g MgSO4-7H2O，15g葡萄糖，pH6.0。
STC0.8M山梨糖醇，25mM Tris pH8，25mM CaCl2。
STPC溶于STC缓冲液的40％PEG4000。
Cove顶层琼脂糖每升342.3g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10mM乙酰胺，10g低熔点琼脂糖。
MS-9每升30g大豆粉，20g甘油，pH6.0。
MDU-2Bp每升45g麦芽糖-1H2O，7g酵母抽提物，12g KH2PO4，1g MgSO4-7H2O，2g K2SO4，5g尿素，1g NaCl，0.5ml AMG微量金属溶液pH5.0。
宿主生物体米曲霉BECh2在WO00/39322中描述。它是JaL228(在WO98/123000中描述)的突变株，而JaL228是IFO4177的突变株。
米曲霉的转化米曲霉菌株BECh2接种于100ml YPG培养基中并在80rpm搅拌下于32℃孵育16小时。通过过滤收集长大的菌丝体，然后用0.6M KCl洗涤并重新悬浮于含有Glucanex?(Novozymes)的30ml 0.6M的KCl中，使其浓度为30μl/ml。将混合物在60rpm搅拌下于32℃孵育，直到形成原生质体。过滤除去剩余的菌丝体后，离心收集原生质体并用STC缓冲液洗涤两次。原生质体用血细胞计数器(hematitometer)计数并重新悬浮于STC∶STPC∶DMSO(8∶2∶0.1)中使得终浓度为1.2×107个原生质体/ml。向100μl原生质体溶液中加入约4μg DNA，轻轻混合并冰上孵育30分钟。向混合物中加入1μl STPC缓冲液并在37℃再孵育30分钟。加入在50℃预热的10ml Cove顶层琼脂糖后，将反应混合物倒在COVE-ar琼脂平板上。将平板在32℃孵育5天。
SDS-PAGE用商品化的凝胶PAGEL AE6000 NPU-7.5L(7.5T％)在仪器AE-6400(Atto，日本)上按照所提供的方案进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将15μl样品悬浮于15μl 2倍浓度的上样缓冲液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，200mM二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％溴酚蓝和20％甘油)中并煮沸5分钟。将20μl样品溶液上样到聚丙烯酰胺凝胶上并在电泳缓冲液(25mMTris，0.1％SDS，192mM甘氨酸)中电泳，每块凝胶20mA。所得凝胶用SYPRO Orange染色并用分子成像仪FX(BIO-RAD)检测。
分析脂肪氧合酶活力分光光度分析通过跟踪形成的在234nm有光吸收的氢过氧化物，于25℃用分光光度计测定脂肪氧合酶活力。向0.98ml缓冲液(50mM KH2PO4/NaHPO4，pH7.0)中加入10μl底物溶液(10mM亚麻酸，分散于0.2％Tween20中)之后加入10μl酶溶液开始反应。一个单位将使每分钟234nm的光吸收增加0.001。
FOX分析通过用Hiscotron向每一80μl含有分散于0.02％Tween 20中的0.7mM亚麻酸的50mM缓冲液中加入20μl酶溶液起始测定试验，之后孵育10min。通过加入900μl FOX试剂溶于甲醇∶水(9∶1)的硫酸(25mM)、二甲酚橙(100μM)、硫酸亚铁(100μM)、丁化羟基甲苯(4mM)，中止此测定试验。空白对照在孵育时仅含有底物溶液，但在加入FOX试剂后加入酶溶液。酸化的二甲酚橙的黄色由于脂质氢过氧化物介导的染料的Fe2+离子的氧化而转变成蓝色。加入FOX试剂后1小时测定Fe3+复合物在620nm的光吸收。
漂白分析通过跟踪470nm的光吸收在25℃用分光光度计测定脂肪氧合酶的漂白效果。色素溶液制备如下将150μl色素储液(每1ml氯仿中含1mg色素)蒸发至干。然后缓慢加入30ml含有0.3％Tween 20的缓冲液(50mMKH2PO4/NaHPO4，pH7.0)使色素溶解。向0.98ml色素溶液中加入10μl底物溶液(10mM亚麻酸，分散于0.2％的Tween20中)，加入10μl酶溶液开始反应。
实施例1从M.salvinii中克隆基因组LOX基因用SacI消化从Magnaporthe salvinii得到的基因组DNA并在1.0％的琼脂糖凝胶上分离。从凝胶中回收了约2.5kbp的DNA消化物并和用BAP处理过的、用SacI线性化的pUC19连接。将连接混合物转化到大肠杆菌DH12S中以构建部分基因组文库。对其进行筛选，分离出脂肪氧合酶阳性的大肠杆菌菌落并回收称为pSG28的质粒。质粒pSG28含有一个2.5kbp的SacI基因组片段，该片段含有推定的LOX同源序列。2.5kbp中的1973bp序列见SEQ.ID 1所示。
鉴定了内含子并显示于SEQ ID NO1中。对剪接位点的预测方法在S.M.Hebsgaard等，Nucleic Acids Research，1996，Vol.24，No.17，3439-3452中描述。
推定的可读框由1851bp组成，推导的氨基酸序列相应于如SEQ IDNO2所示的617个氨基酸。其分子量估计为67500Da。
含有质粒pSG28的大肠杆菌DH12S作为DSM14139保藏于DSMZ，保藏日期为2001年2月28日。
实施例2在米曲霉中表达M.salvinii LOX构建表达质粒M.salvinii基因组基因的部分基因组序列通过PCR，用pSG28作为模板进行扩增。设计引物3和4(SEQ ID NO3和4)使得BamHI和XhoI位点位于PCR产物的两端(分别为引物3的第4-9位核苷酸和引物4的第5-10位核苷酸)。PCR反应混合物由2.5mM dNTP、引物3和引物4各30pmol、5个单位LA taq聚合酶(Takara)和提供的GC缓冲液I组成。反应条件如下所示。步骤1之后向反应混合物中加入LA taq聚合酶。
*步骤2到步骤4重复30次。
分离PCR扩增的1.9kb的片段并克隆到pT7Blue上得到pSG29。
将质粒pSG29用BamHI和XhoI消化，并将含有LOX基因的1.9kb片段与用BamHI和XhoI消化的pMT2188连接。质粒pMT2188有修饰的黑曲霉中性淀粉酶启动子、构巢曲霉TPI引导序列、黑曲霉葡糖淀粉酶终止子、作为真菌转化标志的构巢曲霉amdS基因和作为大肠杆菌转化标志的酿酒酵母ura3。用大肠杆菌DB6507进行转化，在大肠杆菌DB6507中有pyrF基因缺陷，但可以用酿酒酵母Ura3弥补。所得质粒称为pSG30。
在米曲霉中表达M.salvinii的LOX用质粒pSG30转化米曲霉BECh2并分离选择阳性转化体。转化体于32℃在COVE 2-ar上生长5天并接种到100ml MS-9摇瓶中。在32℃剧烈振荡培养1天后，将3ml培养物转移到100ml置于摇瓶中的MDU-2Bp中并于32℃培养3天。3500rpm离心培养液10分钟并收集上清液。
用前面描述的分光光度计方法测定上清液的脂肪氧合酶活力。阳性转化体的培养液显示约100,000U/ml的活性而未转化的米曲霉BECh2未显示活力。对培养上清液还进行SDS-PAGE分析。阳性转化体显示出80-100kDa的成片条带，这表明蛋白高度糖基化。未转化的米曲霉BECh2没有显示任何显著的条带。
实施例3脂肪氧合酶的底物专一性用标准方法测定了M.salvinii脂肪氧合酶对许多底物的动力学参数。
作为比较，也用大豆脂肪氧合酶对一种底物进行了试验。
实施例3脂肪氧合酶活力的pH依赖性用上面描述的FOX分析测定了在各种pH值下M.salvinii脂肪氧合酶的相对活力，使用下面的缓冲液50mM柠檬酸/柠檬酸钠(pH2.21-3.73)，KH2PO4/Na2HPO4(pH5.30，6.17)，Tris/HCl(pH7.01，8.02)，甘氨酰甘氨酸NaCl/NaOH(pH9.33-11.0)。
实施例4脂肪氧合酶活力的温度依赖性在pH7.0孵育10min研究温度对M.salvinii脂肪氧合酶的影响
实施例5脂肪氧合酶的漂白效果检测了M.salvinii LOX的漂白效果。包括大豆L1用于比较。β-胡萝卜素和虾青素用作色素。
结果表明M.salvinii LOX漂白了色素溶液。大豆LOX对漂白几乎无作用。
序列表<110>诺和酶股份有限公司(Novozymes A/S)<120>脂肪氧合酶<130>10148<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1973<212>DNA<213>Magnaporthe salvinii<220>
<221>CDS<222>(1)..(381)<220>
<221>mat_peptide<222>(52)..()<220>
<221>CDS<222>(501)..(1970)<400>1atg cgc atc gga ctc ttg gcc ttc gcc gtc gcg gcg cgc tat gtg gaa 48Met Arg Ile Gly Leu Leu Ala Phe Ala Val Ala Ala Arg Tyr Val Glu-15 -10 -5gcg ctg cca gtc gcg agc ggc gaa gaa gtg gcc tcg tcg tcc gct ccg 96Ala Leu Pro Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser Ala Pro-1 1 5 10 15acg acg ctg ccc tcg acg tcg agc agc tct gcg ctt ccc tcc ccg acc 144Thr Thr Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Leu Pro Ser Pro Thr20 25 30aag tac acg ctt ccc cac gag gac ccc aac ccg gaa gcg agg aag gcc 192Lys Tyr Thr Leu Pro His Glu Asp Pro Asn Pro Glu Ala Arg Lys Ala35 40 45gag ata gcg tta aag agg gga ggg ttc ctc tac gga ccc tcc acc ctg 240
Glu Ile Ala Leu Lys Arg Gly Gly Phe Leu Tyr Gly Pro Ser Thr Leu50 55 60ggc cag act acc ttt tac ccc agc ggg acc ctg ggg acc gcc atg tcg 288Gly Gln Thr Thr Phe Tyr Pro Ser Gly Thr Leu Gly Thr Ala Met Ser65 70 75caa cgc gac cag gcc ctc tgg ctc agg gat gca gag aac caa acg ata 336Gln Arg Asp Gln Ala Leu Trp Leu Arg Asp Ala Glu Asn Gln Thr Ile80 85 90 95aca gcg tat cgt gaa gcc aac gag aca ctg agg gat atc cag agc 381Thr Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Glu Thr Leu Arg Asp Ile Gln Ser100 105 110gtatgtgtcg agccgtgttt atgcgttcca atcattctct gtgctcctgt ccgtccccgc 441ccggggttac agccaagccg attcagtagc taactcggaa tgtctggttt gctctgcag500cat ggc ggt ctc aag acg ctt gac gac ttc gcg ctc ctc tac gac ggc 548His Gly Gly Leu Lys Thr Leu Asp Asp Phe Ala Leu Leu Tyr Asp Gly115 120 125cat tgg aaa gcg tcg gtc cca gag gga ata gaa aag ggc atg ctg agc 596His Trp Lys Ala Ser Val Pro Glu Gly Ile Glu Lys Gly Met Leu Ser130 135 140aac tac act tcg gac ctg ctc ttt tcc atg gag cgg ctc tcc aac aac 644Asn Tyr Thr Ser Asp Leu Leu Phe Ser Met Glu Arg Leu Ser Asn Asn145 150 155ccc tac agc ctc aag cgc ctc cat cca acc aag gac aag ctg ccg ttc 692Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Leu His Pro Thr Lys Asp Lys Leu Pro Phe160 165 170agc gtc gag gac aag gtg gtc aag cag ctg acg gcc acg acg ctt gcg 740Ser Val Glu Asp Lys Val Val Lys Gln Leu Thr Ala Thr Thr Leu Ala175 180 185 190gcg ctc cac aag gcc ggc cgt ctc ttc ttc gtt gac cac agc gat cag 788Ala Leu His Lys Ala Gly Arg Leu Phe Phe Val Asp His Ser Asp Gln195 200 205aag aaa tac acg ccg cag gca ggt cgg tat gct gcg gcc tgc cag ggg 836Lys Lys Tyr Thr Pro Gln Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Gln Gly210 215 220
ctt ttc tat gtg gac gcg cgg tcc aat cag ttc ctg ccg ctg gcc atc 884Leu Phe Tyr Val Asp Ala Arg Ser Asn Gln Phe Leu Pro Leu Ala Ile225 230 235aag acc aac gtg ggc gca gac ctg acg tac acg cca ctc gac gac aag 932Lys Thr Asn Val Gly Ala Asp Leu Thr Tyr Thr Pro Leu Asp Asp Lys240 245 250aac gac tgg ctt ctg gcc aag atc atg ttc aac aac aat gac ctg ttc 980Asn Asp Trp Leu Leu Ala Lys Ile Met Phe Asn Asn Asn Asp Leu Phe255 260 265 270tac tcg cag atg tac cat gtc ctg ttc cac acg gtt cca gaa atc gtg 1028Tyr Ser Gln Met Tyr His Val Leu Phe His Thr Val Pro Glu Ile Val275 280 285cac atg gcc gcc atc cgg acg cta agc gag agc cac ccg gtg ctg gcc 1076His Met Ala Ala Ile Arg Thr Leu Ser Glu Ser His Pro Val Leu Ala290 295 300gtg ctc aat cgg atc atg tat caa gcc tat gcg atc cgg cca gtg ggc 1124Val Leu Asn Arg Ile Met Tyr Gln Ala Tyr Ala Ile Arg Pro Val Gly305 310 315gaa cgc atc ctg ttc aac ccg ggc ggg ttt tgg gac cag aac ctt ggc 1172Glu Arg Ile Leu Phe Asn Pro Gly Gly Phe Trp Asp Gln Asn Leu Gly320 325 330ctg ccc gcc acg gcg gcc gtc gac ttt ctc agt tcc atc tac gcc cat 1220Leu Pro Ala Thr Ala Ala Val Asp Phe Leu Ser Ser Ile Tyr Ala His335 340 345 350ggc gag ggc ggg ttc cgg gcc ggc tac gtg gaa aac aac ctg cgc aag 1268Gly Glu Gly Gly Phe Arg Ala Gly Tyr Val Glu Asn Asn Leu Arg Lys355 360 365cgg ggg ctg gtg ggc gac acc ttt ggc ggc ccg gcg ctc ccg cac ttc 1316Arg Gly Leu Val Gly Asp Thr Phe Gly Gly Pro Ala Leu Pro His Phe370 375 380ccc ttc tac gag gac gcg cag cgc gtc ctc ggg gcg atc cgc ggc ttc 1364Pro Phe Tyr Glu Asp Ala Gln Arg Val Leu Gly Ala Ile Arg Gly Phe385 390 395atg cag gcc ttt gtc gsc tcg acc tsc ggg ggc gac gsc ggc gcg ctg 1412Met Gln Ala Phe Val Asp Ser Thr Tyr Gly Gly Asp Asp Gly Ala Leu400 405 410
gcg cgc gac ttt gag ctg cag gac tgg gtg gcc gag gcc aac ggg ccg 1460Ala Arg Asp Phe Glu Leu Gln Asp Trp Val Ala Glu Ala Asn Gly Pro415 420 425 430gcg cag gtg cgc gac ttc ccc acg gcg ccg ctg cgg cgg cgc gag gag 1508Ala Gln Val Arg Asp Phe Pro Thr Ala Pro Leu Arg Arg Arg Glu Glu435 440 445ctg gtg ggc atc ctg acg cac ata gcc tgg aac acg ggc ggc gcg cac 1556Leu Val Gly Ile Leu Thr His Ile Ala Trp Asn Thr Gly Gly Ala His450 455 460cac gtt cta aac cag ggg gcg ccc gtg cgc gcc tcg ggc gtg ctg ccg 1604His Val Leu Asn Gln Gly Ala Pro Val Arg Ala Ser Gly Val Leu Pro465 470 475ctc cac ccg gcg gct ctt tac gcg ccc gtc ccg gcg gcc aag ggc gcc 1652Leu His Pro Ala Ala Leu Tyr Ala Pro Val Pro Ala Ala Lys Gly Ala480 485 490gtc gcg tcc agc gac ggc ctg ctg gcg tgg ctg ccg gac gag gtc aaa 1700Val Ala Ser Ser Asp Gly Leu Leu Ala Trp Leu Pro Asp Glu Val Lys495 500 505 510tcg gtg gag cag gtg tcg ctg ctg gcg cgc ttc aac cgc gcg cag gtt 1748Ser Val Glu Gln Val Ser Leu Leu Ala Arg Phe Asn Arg Ala Gln Val515 520 525agg gac aga aac cag acg gtg cgc aac atg ttc gcc gca ccg gag ctg 1796Arg Asp Arg Asn Gln Thr Val Arg Asn Met Phe Ala Ala Pro Glu Leu530 535 540ctg gct gga aat ggc gag gcg tac gcg gcg gcc aac gcg agg ttc gtc 1844Leu Ala Gly Asn Gly Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Asn Ala Arg Phe Val545 550 555gag gag acg ggc cgg ata agc cgc gag ata gag ggc agg ggt ttc gat 1892Glu Glu Thr Gly Arg Ile Ser Arg Glu Ile Glu Gly Arg Gly Phe Asp560 565 570agc aag ggc ctg agc cag ggg atg ccc ttt atc tgg acc gcc ttg aat 1940Ser Lys Gly Leu Ser Gln Gly Met Pro Phe Ile Trp Thr Ala Leu Asn575 580 585 590ccc gcg gtg aac ccg ttt ttc ctg agc atc tag 1973Pro Ala Val Asn Pro Phe Phe Leu Ser Ile
595 600<210>2<211>617<212>PRT<213>Magnaporthe salVinii<400>2Met Arg Ile Gly Leu Leu Ala Phe Ala Val Ala Ala Arg Tyr Val Glu-15 -10 -5Ala Leu Pro Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser Ala Pro-1 1 5 10 15Thr Thr Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Leu Pro Ser Pro Thr20 25 30Lys Tyr Thr Leu Pro His Glu Asp Pro Asn Pro Glu Ala Arg Lys Ala35 40 45Glu Ile Ala Leu Lys Arg Gly Gly Phe Leu Tyr Gly Pro Ser Thr Leu50 55 60Gly Gln Thr Thr Phe Tyr Pro Ser Gly Thr Leu Gly Thr Ala Met Ser65 70 75Gln Arg Asp Gln Ala Leu Trp Leu Arg Asp Ala Glu Asn Gln Thr Ile80 85 90 95Thr Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Glu Thr Leu Arg Asp Ile Gln Ser His100 105 110Gly Gly Leu Lys Thr Leu Asp Asp Phe Ala Leu Leu Tyr Asp Gly His115 120 125Trp Lys Ala Ser Val Pro Glu Gly Ile Glu Lys Gly Met Leu Ser Asn130 135 140Tyr Thr Ser Asp Leu Leu Phe Ser Met Glu Arg Leu Ser Asn Asn Pro145 150 155Tyr Ser Leu Lys Arg Leu His Pro Thr Lys Asp Lys Leu Pro Phe Ser160 165 170 175Val Glu Asp Lys Val Val Lys Gln Leu Thr Ala Thr Thr Leu Ala Ala180 185 190
Leu His Lys Ala Gly Arg Leu Phe Phe Val Asp His Ser Asp Gln Lys195 200 205Lys Tyr Thr Pro Gln Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Gln Gly Leu210 215 220Phe Tyr Val Asp Ala Arg Ser Asn Gln Phe Leu Pro Leu Ala Ile Lys225 230 235Thr Asn Val Gly Ala Asp Leu Thr Tyr Thr Pro Leu Asp Asp Lys Asn240 245 250 255Asp Trp Leu Leu Ala Lys Ile Met Phe Asn Asn Asn Asp Leu Phe Tyr260 265 270Ser Gln Met Tyr His Val Leu Phe His Thr Val Pro Glu Ile Val His275 280 285Met Ala Ala Ile Arg Thr Leu Ser Glu Ser His Pro Val Leu Ala Val290 295 300Leu Asn Arg Ile Met Tyr Gln Ala Tyr Ala Ile Arg Pro Val Gly Glu305 310 315Arg Ile Leu Phe Asn Pro Gly Gly Phe Trp Asp Gln Asn Leu Gly Leu320 325 330 335Pro Ala Thr Ala Ala Val Asp Phe Leu Ser Ser Ile Tyr Ala His Gly340 345 350Glu Gly Gly Phe Arg Ala Gly Tyr Val Glu Asn Asn Leu Arg Lys Arg355 360 365Gly Leu Val Gly Asp Thr Phe Gly Gly Pro Ala Leu Pro His Phe Pro370 375 380Phe Tyr Glu Asp Ala Gln Arg Val Leu Gly Ala Ile Arg Gly Phe Met385 390 395Gln Ala Phe Val Asp Ser Thr Tyr Gly Gly Asp Asp Gly Ala Leu Ala400 405 410 415Arg Asp Phe Glu Leu Gln Asp Trp Val Ala Glu Ala Asn Gly Pro Ala420 425 430Gln Val Arg Asp Phe Pro Thr Ala Pro Leu Arg Arg Arg Glu Glu Leu
435 440 445Val Gly Ile Leu Thr His Ile Ala Trp Asn Thr Gly Gly Ala His His450 455 460Val Leu Asn Gln Gly Ala Pro Val Arg Ala Ser Gly Val Leu Pro Leu465 470 475His Pro Ala Ala Leu Tyr Ala Pro Val Pro Ala Ala Lys Gly Ala Val480 485 490 495Ala Ser Ser Asp Gly Leu Leu Ala Trp Leu Pro Asp Glu Val Lys Ser500 505 510Val Glu Gln Val Ser Leu Leu Ala Arg Phe Asn Arg Ala Gln Val Arg515 520 525Asp Arg Asn Gln Thr Val Arg Asn Met Phe Ala Ala Pro Glu Leu Leu530 535 540Ala Gly Asn Gly Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Asn Ala Arg Phe Val Glu545 550 555Glu Thr Gly Arg Ile Ser Arg Glu Ile Glu Gly Arg Gly Phe Asp Ser560 565 570 575Lys Gly Leu Ser Gln Gly Met Pro Phe Ile Trp Thr Ala Leu Asn Pro580 585 590Ala Val Asn Pro Phe Phe Leu Ser Ile595 600<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>引物3
<400>3cgcggatcca tgcgcatcgg actcttggc29<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>引物4<400>4cccgctcgag ctagatgctc aggaaaaacg g 3

本发明人从Magnaporthe salvinii中发现了一种新的真菌脂肪氧合酶并测定了其序列。他们对该酶的基因进行了测序，将该基因克隆到大肠杆菌中并保藏了此克隆。基于该序列信息的寡核苷酸探针对于筛选真核文库以得到脂肪氧合酶是有用的。该脂肪氧合酶可用于烘焙和去污剂中。