专利名称：新型exendin激动剂制剂及其给药方法 以下描述包含对理解本发明可能有用的信息。但既不是承认在此提供的任何信息是目前要求保护的本发明或有关申请的现有技术，也不是承认任何具体或隐含涉及的公开是现有技术。Exendin是一种肽，存在于原产于Arizona和Northem Mexico的爬行动物Gila畸形体和Mexican Beaded Lizard蜥蜴的唾液分泌物中。Exendin-3[SEQ.ID.NO.1His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu SerLys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]存在于Helodermahorridum(Mexican Beaded Lizard)的唾液分泌物中，而exendin-4[SEQ.ID.NO.2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met GluGlu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser SerGly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]存在于Heloderma suspectum(Gila畸形体)的唾液分泌物中(Eng，J.等，J.Biol.Chem.，26520259-62，1990；Eng，J.等，J.Biol.Chem.，2677402-05，1992)。Exendin-3的氨基酸序列见图1。Exendin-4的氨基酸序列见图2。最初认为exendin-4是毒液中的一种(潜在毒性)组分。目前认为exendin-4是无毒性，相反它产生于Gila畸形体唾液腺。Exendin部分序列与胰高血糖素样肽家族的数个成员相似，与GLP-1[7-36]NH2[SEQ.ID.NO.3]的最高同源性为53％(Goke等，J.Biol.Chem.，26819650-55，1993)。GLP-1[7-36]NH2也称为胰高血糖素原[78-107]，或者简称为“GLP-1”，本文最常使用后者。GLP-1具有促胰岛素作用，刺激胰腺β细胞分泌胰岛素。据报道，GLP-1还抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素(?rsov等，Diabetes，42658-61，1993；D’Alessio等，J.Clin.Invest.，97133-38，1996)。GLP-1的氨基酸序列见图3。据报道GLP-1抑制胃排空(Willms B等，J Clin EndocrinolMetab 81(1)327-32，1996；Wettergren A等，Dig Dis Sci 38(4)665-73，1993)和胃酸分泌(Schjoldager BT等，Dig Dis Sci 34(5)703-8，1989；O’Halloran DJ等，J Fndocrinol 126(1)169-73，1990；Wettergren A等，Dig Dis Sci 38(4)665-73，1993))。GLP-1[7-37]在其羧基末端具有一个额外甘氨酸残基，它也刺激人类胰岛素分泌(?rsov等，Diabetes，42658-61，1993)。据报道已从β细胞系克隆出跨膜G蛋白偶联腺苷酸环化酶的受体，据认为它至少部分与GLP-1的促胰岛素作用有关(Thorens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898641-45，1992)。近年来，因为文献报道的GLP-1作用，例如增强刺激产生胰岛素(Byrne MM，Goke B.，用胰高血糖素样肽-1在人体进行研究的教训所述胃肠激素在临床应用中的潜力，载于Fehmann HC，Goke B.促胰岛素胃肠激素胰高血糖素样肽1，Basel，SwitzerlandKarger，1997219-33)、抑制胃排空(Wettergren A.等，截短的GLP-1(胰高血糖素原78-107-酰胺)抑制人体胃以及胰腺功能，Dig.Dis.Sci.1993年4月；38(4)665-73)、抑制胰高血糖素分泌(Creutzfeldt WOC等，外源性胰高血糖素样肽I(7-36)酰胺对I型糖尿病患者的抑制胰高血糖素和降低空腹高血糖的作用，Diabetes Care 1996；19(6)580-6)以及食欲控制作用(Turton MD等，胰高血糖素样肽-1在进食的中枢调节中的作用，Nature 1996年1月；379(6560)69-72)，使GLP-1成为重要研究的焦点。还报道GLP-1可恢复老年大鼠胰岛细胞对葡萄糖的敏感性，使其葡萄糖耐受性恢复到年轻大鼠的水平(Egan JM等，胰高血糖素样肽-1恢复老年大鼠的急性期胰岛素释放，Diabetologia 1997年6月，40(增刊1)A130)。GLP-1的体内生物作用时间短是其特征之一，这妨碍它开发为治疗药物。药理学研究证实了exendin-4和GLP-1之间的相似与不同。据报道exendin-4作用于分泌胰岛素的βTC1细胞上的GLP-1受体、豚鼠胰腺分散的腺泡细胞和胃壁细胞。还报道所述肽刺激促生长素抑制素的释放和抑制立体胃中的胃泌素释放(Goke等，J.Biol.Chem.26819650-55，1993；Schepp等，Eur.J.Pharmacol.，69183-91，1994；Eissele等，Life Sci.，55629-34，1994)。报道发现exendin-3和exendin-4刺激胰腺腺泡细胞产生cAMP和释放淀粉酶(Malhotra，R.等，RegulatoryPeptides，41149-56，1992；Raufman等，J.Biol.Chem.26721432-37，1992；Singh等，Regul.Pept.5347-59，1994)。Exendin-4的作用时间较GLP-1明显延长。例如在一个实验中，报道exendin-4降低糖尿病小鼠葡萄糖的作用持续数小时，而且根据剂量最长长达24小时(Eng J.，exendin-4对db/db小鼠高血糖的作用延长，Diabetes 1996年5月；45(增刊2)152A(摘要554))。根据exendin-3和exendin-4的促胰岛素活性，提出将其用于治疗糖尿病以及防止高血糖(Eng，美国专利号5,424,286)。据报道，C末端截短的exendin肽例如exendin-4[9-39]、羧酰胺分子和3-39至9-39的片段是GLP-1的有效选择性拮抗剂(Goke等，J.Biol.Chem.，26819650-55，1993；Raufman，J.P.等，J.Biol.Chem.2662897-902，1991；Schepp，W.等，Eur.J.Pharm.269183-91，1994；Montrose-Rafizadeh等，Diabetes，45(增刊2)152A，1996)。据认为，exendin-4[9-39]在体内阻断内源性GLP-1，导致胰岛素分泌减少。Wang等，J.Clin.Invest.，95417-21，1995；D’Alessio等，J.Clin.Invest.，97133-38，1996)。文献报道，从大鼠胰岛细胞克隆出了与GLP-1在大鼠促胰岛素作用明显有关的受体(Thorens，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898641-8645，1992)。人们认为exendin类和exendin-4[9-39]结合克隆的大鼠GLP-1受体(大鼠胰腺β细胞GLP-1受体(Fehmann HC等，Peptides 15(3)453-6，1994)和人GLP-1受体(Thorens B等，Diabetes 42(11)1678-82，1993))。文献报道，在用克隆的GLP-1受体转染的细胞中，exendin-4为激动剂，即它增加cAMP，而exendin[9-39]鉴定为拮抗剂，即它阻止exendin-4和GLP-1的刺激作用。同上。
还报道exendin-4[9-39]起作全长exendin的拮抗剂作用，抑制exendin-3和exendin-4对胰腺腺泡细胞的刺激作用(Raufman等，J.Biol，Chem.2662897-902，1991；Raufman等，J.Biol，Chem，26621432-37，1992)。还报道exendin[9-39]抑制exendin-4对血浆胰岛素水平的刺激作用，以及抑制exendin-4和GLP-1的刺激促生长素抑制素释放和抑制胃泌素释放的活性(Kolligs，F.等，Diabetes，4416-19，1995；Eissele等，Life Sciences，55629-34，1994)。Exendin[9-39]已经用于研究中枢GLP-1在控制摄取食物中的生理相关性(Turton，M.D.等，Nature 37969-72，1996)。脑室内注射给予的GLP-1抑制大鼠摄取食物。据报道，脑室内注射给予的GLP-1产生的这种饱感作用受到脑室内注射的exendin[9-39]的抑制(Turton，同上)。但是，文献报道当外周注射给予GLP-1时，不能抑制小鼠摄取食物(Turton，M.D.，Nature 37969-72，1996；Bhavsar，S.P.，Soc.Neurosci.Abstr.21460(188.8)，1995)。
Chen和Drucker从Gila畸形体克隆出了exendin基因，他们报道了exendin是否为哺乳动物GLP-1的种同系物的研究结果(J.Biol.Chem.272(7)4108-15(1997))。观测结果为Gila畸形体也具有不同胰高血糖素基因(由加工GLP-1而得)，该胰高血糖素基因与哺乳动物胰高血糖素基因更相似(相对于exendin)，说明exendin类不是GLP-1的种同系物。
发现用来延迟胃排空的药物在医学上可用作胃肠道放射学检查的诊断性辅助手段。例如胰高血糖素是一种Langerhans胰岛α细胞产生的多肽激素。它是通过激活肝脏糖元分解代谢葡萄糖的高血糖药物。它能够在较低程度上刺激分泌胰岛素。例如当不能静脉内给予葡萄糖时，胰高血糖素可用于治疗胰岛素引起的低血糖。然而，因为胰高血糖素降低胃肠道动力，所以也可用作胃肠道放射学检查的诊断性辅助手段。在数个研究中还使用胰高血糖素治疗与痉挛有关的各种疼痛性胃肠道疾病。Daniel等(Br.Med.J.，3720，1974)报道，与采用镇痛剂或抗痉挛剂治疗相比，采用胰高血糖素治疗急性憩室炎患者的症状缓解更快。Glauser等(J.Am.Coll.Emergency Physns，8228，1979)的综述描述在胰高血糖素治疗后缓解急性食道食物梗阻。另一文献报道，与用安慰剂治疗的22名患者比较，胰高血糖素明显缓解21名胆道疾病患者的疼痛和触疼(M.J.Stower等，Br.J.Surg.，69591-2，1982)。
1995年3月16日公开的共同拥有的国际申请号PCT/US94/10225描述了采用糊精激动剂调节胃肠道动力的方法。
1997年8月8日申请的题为“调节胃肠道动力的方法”的共同拥有的美国专利申请序号08/908,867描述了应用exendin激动剂调节胃肠道动力的方法，所述申请为1996年8月8日申请的美国专利申请序号08/694,954的部分连续申请。
1998年1月7日申请的题为“应用Exendin及其激动剂减少摄取食物”的共同拥有的美国专利申请序号09/003,869描述了应用exendin激动剂减少摄取食物的方法，该申请要求以下申请的权益1997年1月7日申请的美国临时申请号60/034,905、1997年8月7日申请的60/055,404、1997年11月14日申请的60/065,442和1997年11月14日申请的60/066,029。
还报道，exendin具有促胰岛素作用和利尿作用，如1999年2月5日申请的共同拥有的国际专利申请号PCT/US99/02554所述，它要求1998年2月13日申请的临时申请号60/075,122的权益。
1998年8月6日申请的题为“新型exendin激动剂化合物”的共同拥有的PCT申请序号PCT/US98/16387描述了新型exendin激动剂化合物，该申请要求1997年8月8日申请的美国专利申请序号60/055,404的权益。
1998年11月13日申请的题为“新型exendin激动剂化合物”的共同拥有的PCT专利申请序号PCT/US98/24210描述了其它新型exendin激动剂，该申请要求1997年11月14日申请的美国临时申请号60/065,442的权益。
1998年11月13日申请的题为“新型exendin激动剂化合物”的共同拥有的PCT专利申请序号PCT/US98/24273描述了其它新型exendin激动剂，该申请要求1997年11月14日申请的美国临时申请号60/066,029的权益。
自从出现基因工程生产的第一批治疗性活性肽类以来，就越来越需要通过胃肠途径传递这些药物。但是，这受阻于肽和蛋白的特有性质，使其不能象目前广泛使用的小分子药物一样经胃肠给药。这些性质包括分子大小问题、易被蛋白酶水解、血浆清除率快、特有的剂量效应曲线、免疫原性、生物相容性以及肽类和蛋白易于发生聚集、吸附和变性。
人们一般认为，通过皮下或静脉内注射或静脉内输注途径以外的途径给予肽类药物通常是不可行的，因为例如口服给药时，在胃肠道内既会发生酶降解同时又不会吸收。因此，仍然需要开发不方便、有时是痛苦的注射给予肽类药物例如上述的exendin类和exendin激动剂类似物肽的替代方法。除了注射给予exendin类和exendin激动剂的有效制剂和剂量之外，本文描述并要求保护解决了这些问题而且有效地非注射传递治疗有效量的exendin和exendin激动剂的制剂、剂量制剂(dosage formulation)和方法。
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发明概述按照一个方面，本发明提供具有优良特性的新型exendin和exendin激动剂化合物的制剂和剂量，所述优良特性包括有效减慢胃排空和降低血浆葡萄糖水平。因此，本发明的该方面包括exendin和exendin激动剂的制剂，该制剂包含与缓冲剂(优选醋酸盐缓冲剂)、等渗调节剂(优选山梨醇)和任选包含防腐剂(优选间甲酚)混合在一起的exendin或exendin激动剂，所述制剂的pH约3.0-约7.0(优选约4.0-约5.0)。“exendin激动剂”是指模拟exendin的一种或多种作用的化合物，例如通过与exendin产生其中一种或多种作用的受体结合，或者激活exendin由其产生其中一种或多种作用的信号级联。Exendin激动剂包括exendin激动剂肽类，例如具有exendin的一种或多种需要活性的exendin-3和exendin-4的类似物和衍生物。本文鉴定或引用了各种exendin激动剂类似物。
本发明范围的其它exendin和exendin激动剂制剂包括胃肠外液体剂型、冻干单位剂型、冻干多用剂型、和这些剂型的改进剂型，它们可用于经口、鼻、颊、舌下、气管内和肺传递exendin和exendin激动剂。
所以，本发明包括胃肠外液体剂型，它于液体系统中分别包含约0.005-约0.4％，更具体为约0.005-约0.02％、或约0.005-约0.05％(w/v)的所述活性成分，同时它还包含约0.02-0.5％(w/v)醋酸盐、磷酸盐或谷氨酸盐或单独的或组合的类似缓冲剂，使最终组合物的pH约3.0-7.0，更具体为约4.0-约6.0、或约4.0-5.0，以及它还包括约1.0-10％(w/v)碳水化合物或多元醇等渗调节剂(优选山梨醇)或者最高可含约0.9％盐水或者含有以上二者的混合物，使得水连续相为等张或等渗溶液。如果所述制剂用多用容器包装，则还包含约0.005-1.0％(w/v)选自以下的抗微生物防腐剂间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯以及酚。加入足够量注射用水获得需要浓度的溶液。如果需要的话，还可以含有氯化钠以及其它赋形剂。但是，这类赋形剂必须保持所述活性成分的整体稳定性。可用的多元醇包括诸如山梨醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)的化合物。所述多元醇和碳水化合物将有效稳定蛋白质，以抵抗温度升高或冻融或冻干工艺引起的蛋白质变性。合适的碳水化合物包括半乳糖、阿拉伯糖、乳糖或任何其它碳水化合物，如果所述碳水化合物用于该用途，它们对糖尿病患者没有副作用，即所述碳水化合物不会代谢形成高浓度的血糖。本发明的肽类优选与诸如山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/乙二醇共聚物的多元醇以及分子量为200、400、1450、3350、4000、6000和8000的各种聚乙二醇(PEG)。甘露醇为优选的多元醇。
此外，本发明的冻干单位剂量制剂稳定，而不需要是等张和/或等渗的。它们包含活性成分、有助于结块的增量剂(它们在复制时还可起作张力剂和/或等渗调节剂的作用，有助于稳定所述活性成分和/或缓解注射疼痛)，而且还可以包含有益于结块特性和/或有助于复制的表面活性剂。本发明的冻干单位剂量制剂包含约0.005-约0.4％、更具体为约0.005-约0.02％或0.005-0.05％(w/v)的所述活性成分。如果预计在复制的活性成分稳定期内可用完容器中的冻干内容物，所述制剂不必包含缓冲剂和/或用缓冲剂复制所述冻干物。如果使用缓冲剂，它可包含于所述冻干物或复制溶剂中。所以，所述制剂和/或复制溶剂单计或总计含有约0.02-0.5％(w/v)单独的或组合的醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲剂，使得最终组合物的pH约为3.0-7.0，更具体为约4.0-约6.0或者约4.0-5.0。所述增量剂包括约1.0-10％(w/v)碳水化合物或多元醇等渗调节剂(如上所述)或0.9％以内的盐水或二者的组合物，使复制的水相为等张或等渗溶液。可包含表面活性剂，优选约0.1-约1.0％(w/v)吐温80或其它非离子去垢剂。如上所述，需要的话，冻干的单位剂量制剂还可含有氯化钠以及其它赋形剂。冻干前的本发明液体制剂在冻干前基本上为等张和/或等渗或者在复制后能够形成等张和/或等渗溶液。
本发明还包括冻干和液体多剂量制剂。与上述胃肠外液体和冻干单位剂量制剂一样，冻干的多单位剂型应该含有有助于形成结块的增量剂。可包含有助于患者多次使用的防腐剂。这些剂型分别包含约0.005-约0.4％、更具体为约0.005-约0.02％或约0.005-0.05％(w/v)所述活性成分。如果使用缓冲剂，它可包含于所述冻干物或复制溶剂中，而所述制剂和/或复制溶剂单计或总计含有约0.02-0.5％(w/v)单独的或组合的醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲剂，使得最终组合物的pH为约3.0-7.0，更具体为约4.0-约6.0或者约4.0-5.0。所述增量剂包括约1.0-10％(w/v)碳水化合物或多元醇等渗调节剂(优选甘露醇)或0.9％以内的盐水，或二者的组合物，使复制的水相为等张或等渗溶液。可包含表面活性剂，优选约0.1-约1.0(w/v)吐温80或其它非离子去垢剂。如果所述制剂用多用容器包装，则还包含约0.005-1.0％(w/v)选自以下的抗微生物防腐剂间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯以及酚(优选间甲酚)。需要的话，还可含有氯化钠以及其它赋形剂。本发明液体制剂在冻干前基本上为等张和/或等渗或者在复制后能够形成等张和/或等渗溶液。
本发明还包括用于经口、颊、舌下、气管内、鼻和肺传递的固体剂型。最有利于肺和/或气管内剂型的制剂为防腐或非防腐液体制剂和/或干粉制剂。该防腐或非防腐液体制剂与防腐或非防腐胃肠外液体制剂的上述制剂基本相同。所述溶液的pH约3.0-7.0，更具体为约4.0-6.0或约4.0-5.0，最优选pH高于或等于约5.0，以便减小气管收缩的可能性。干粉制剂可含有增量剂和/或盐类，有助于形成的一定大小的颗粒和合适的颗粒大小分布。表面活性剂和/或盐类还有助于颗粒形态学特性和/或促进组织摄取所述活性成分。干粉剂型的活性成分含量范围分别为1％-100％(w/w)。不必含有有助于形成一定颗粒大小和/或颗粒大小分布的增量剂和/或盐类。所述增量剂和/或盐类可包含约0-99％(w/w)碳水化合物或多元醇或者约0-99％盐或者二者的组合物，使得颗粒大小为优选的颗粒大小和分布。可包含表面活性剂，优选约0.1-约1.0％(w/w)吐温80或其它非离子去垢剂。如果需要的话，还可以存在氯化钠和其它赋形剂。但是，这样的赋形剂保持所述活性成分的整体稳定性以及有助于合适水平的水化作用。
还属于本发明范畴的是在含有或不含防腐剂的30mM醋酸盐缓冲液(pH约4.5)和甘露醇中含有50mg/ml以内的exendin或exendin激动剂的制剂。
此外，属于本发明范畴的还有当注射给药或经其它途径给药时，exendin和exendin激动剂的优选剂量。因此，提供相当效力的exendin和exendin激动剂的制剂，以便注射给予约0.1-约0.5μg/Kg，每天以1-3次给药。通常例如对于体重约70公斤(1型糖尿病的平均体重)至约90公斤(2型糖尿病的平均体重)的糖尿病患者而言，每天单次或多次总计给予约10-约120μg。如果分次给药，所述剂量优选以每天2-3次给予，更优选每天2次。
在一个优选注射方法中，胃肠外、更优选注射(例如外周注射)给予exendin或exendin激动剂。优选每天给予约1μg-30μg至约1mgexendin或exendin激动剂。更优选每天给予约1-30μg至约500μg、或者约1-30μg至约50μg exendin或exendin激动剂。更优选根据患者体重和所给予化合物的效力，每天给予约3μg-约50μg exendin或exendin激动剂。大致具有exendin-4效力的化合物的基于患者体重的优选剂量范围为约0.005μg/kg/剂至约0.2μg/kg/剂。更优选大致具有exendin-4效力的化合物的基于患者体重的剂量范围为约0.02μg/kg/剂至约0.1μg/kg/剂。最优选大致具有exendin-4效力的化合物的基于患者体重的剂量范围为约0.05μg/kg/剂至约0.1μg/kg/剂。这些剂量每天以1-4次给予、优选每天1-2次。如果连续输注给药，通常exendin或exendin激动剂的剂量更低。如果通过非注射方法给药，例如口服、颊、舌下、鼻、肺、或皮肤贴片局部给药，exendin或exendin激动剂的剂量通常更高。
按照本发明的口服剂量包括约50至约100倍的所述活性成分，也就是说以单剂或多剂给药的剂量为每天约500至约12,000μg、优选每天约500至约5,000μg。按照本发明的肺部给药剂量包括约10至约100倍的所述活性成分，也就是说以单剂或多剂给药的剂量为每天约100至约12,000μg、优选每天约500-1000μg。按照本发明的鼻、颊和舌下给药剂量也包括约10至约100倍的所述活性成分，也就是说以单剂或多剂给药的剂量为每天约100至约12,000μg。
经鼻给药的优选剂量为每天约10-1000至约1200-12,000μg，经颊给药的优选剂量为每天约10-1000至约1200-12,000μg，舌下给药的优选剂量为每天约10-1000至约1200-8,000μg。最好是舌下剂量低于颊剂量。根据上述剂量和本文其它地方所述剂量，适当增加或降低效力低于或高于exendin-4的exendin激动剂的给药剂量。
此外，属于本发明范畴的还有通过皮下注射或静脉输注的替代给药途径(包括例如经鼻给药、经肺给药、口服给药、气管内给药、舌下给药和经颊给药)给予所述新型exendin激动剂化合物制剂的方法和剂量。
按照另一方面，本发明提供以下新型exendin激动剂化合物制剂和剂量及其给药方法，它们可用于治疗糖尿病(包括1型和2型糖尿病)、肥胖症和其它得益于减慢胃排空、降低血浆葡萄糖水平和减少摄取食物的给药疗法的病症。
本发明还包括通过给予exendin或exendin激动剂治疗患者的方法，以便增强胰岛素敏感性。可使用本文所述的exendin和exendin激动剂制剂和剂量增强患者对内源性或外源性胰岛素的敏感性。
一个优选方面，本发明方法中使用的exendin或exendin激动剂为exendin-3[SEQ.ID.NO.1]。另一个优选方面，所述exendin是exendin-4[SEQ.ID.NO.2]。其它优选exendin激动剂包括exendin-4(1-30)[SEQ.ID.NO.6His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met GluGlu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly]、exendin-4(1-30)酰胺[SEQ.ID.NO.7His Gly Glu Gly Thr Phe Thr SerAsp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly-NH2]、exendin-4(1-28)酰胺[SEQ.ID.NO.40HisGly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu AlaVal Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn-NH2]、14Leu、25Phe exendin-4[SEQ.ID.NO.9His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys GlnLeu Glu Glu GLu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly GlyPro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]、14Leu、25Phe exendin-4(1-28)酰胺[SEQ.ID.NO.41His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser LysGln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH2]和14Leu、22Ala、25Phe exendin-4(1-28)酰胺[SEQ.ID.NO.8His GlyGlu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu GLu Glu Ala ValArg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH2]。
本发明的其它特征和优势由以下描述的其优选实施方案和权利要求书显而易见。
按照本发明以及作为本文使用的以下术语，定义为具有以下涵义，除非另有明确说明。“药学上可接受的盐”包括这类化合物和有机酸或无机酸化合产生的本发明化合物的盐。实际上使用盐形式等于使用碱形式。本发明的化合物既可以游离碱又可以盐形式使用，两种形式均属于本发明范畴。
附图简述图1图示exendin-3的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.1]。
图2图示exendin-4的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.2]。
图3图示GLP-1[7-36]NH2(GLP-1)的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.3]。
图4图示气管内给予exendin-4后大鼠的血浆水平。
图5a图示气管内滴注给予后db/db小鼠的血浆exendin-4浓度。
图5b图示气管内给予exendin-4对db/db小鼠血浆葡萄糖的影响。
图6a和6b图示气管内给予exendin-4对ob/ob小鼠血浆葡萄糖的影响。
图7a图示气管内滴注后大鼠血浆exendin-4浓度。
图7b图示气管内滴注后大鼠的exendin-4生物利用度。
图8图示暴露于气溶胶exendin-4大鼠的血浆exendin-4浓度。
图9a图示暴露于气溶胶exendin-4 10分钟对db/db小鼠血浆葡萄糖的影响。
图9b图示db/db小鼠暴露于气溶胶exendin-4 10分钟后的血浆exendin-4浓度。
图10图示鼻内给予exendin-4后大鼠的血浆exendin-4浓度。
图11图示胃内给予exendin-4对db/db小鼠血浆葡萄糖的影响。
图12a图示舌下给予db/db小鼠后血浆exendin-4浓度。
图12b图示舌下给予exendin-4对db/db小鼠血浆葡萄糖的影响。
图12c图示舌下给予大鼠后的血浆exendin-4浓度。
图12d图示舌下给予后的exendin-4生物利用度。
图12e图示舌下给予exendin-4的Cmax。
图13图示exendin-4(每天腹膜内注射给予2次)对摄取食物(a)、体重变化(b)(最初体重为441±39g)或者血红蛋白A1c变化(c)(0周为7.68±0.20％)的影响。剂量-效应(右侧组)为6周治疗中的最后2周的平均值。
图14图示对ZDF大鼠进行钳法(clamp procedure)的血浆葡萄糖浓度(a)、维持血糖正常需要的葡萄糖输注率(b)和血浆乳酸盐浓度(c)，大鼠预先用特定剂量的exendin-4治疗(每天腹膜注射2次)6周。葡萄糖输注率和血浆乳酸盐浓度的剂量-效应基于钳法60-180分钟之间获得的平均值。
图15图示用于本发明的某些exendin激动剂化合物的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.9-39]。
图16和17图示实施例12描述的降低葡萄糖临床研究的结果。
发明详述Exendin和exendin激动剂Exendin-3和exendin-4是从Gila畸形体和Mexican Beaded Lizard唾液分泌物分离获得的天然肽类。用exendin-4进行动物试验表明，它能够持续降低血糖数小时。Exendin-4为39个氨基酸的多肽，如本文所述可用固相合成法合成制得，而且已经证实这种合成物质与天然exendin-4相同。
研究了exendin-4的各方面非临床药理学。在大脑中，exendin-4主要结合到后脑的最后区和孤束核区以及前脑的穹隆下器官(subfornical organ)。在大鼠和小鼠的大脑和肾脏观测到exendin-4的结合。不知道exendin-4在肾脏中的结合部位。
许多其它试验比较了exendin-4和GLP-1的生物学作用，证实了exendin-4更有利的特性谱。对db/db(糖尿病)和ob/ob(肥胖型糖尿病)小鼠单剂皮下给予exendin-4，降低血浆葡萄糖高达40％。在DiabeticFatty Zucker(ZDF)大鼠，用exendin-4治疗5周降低HbA1c(糖基化血红蛋白测量值，用以评价血浆葡萄糖水平)高达41％。治疗肥胖型ZDF大鼠5周后胰岛素敏感性也提高76％。在葡萄糖耐受不良的灵长类动物，也观测到剂量依赖性血浆葡萄糖降低。此外参见实施例6，它描述了一个试验结果，说明exendin在增强葡萄糖刺激的胰岛素释放方面比GLP-1更强和/或更有效。而且实施例8描述了一项研究，证明exendin-4在体内降低葡萄糖的能力比GLP-1强3430倍。
用啮齿动物也观测到exendin-4的促胰岛素作用，改善非禁食的Harlan Sprague Dawley(HSD)大鼠对葡萄糖的胰岛素效应100％以上，而改善非禁食的db/db小鼠对葡萄糖的胰岛素效应高达约10倍。较高的治疗前血浆葡萄糖浓度与降低葡萄糖的作用更强有关。因此，对exendin-4观测到的降低葡萄糖作用似乎是葡萄糖依赖性的，而且如果动物的血糖已经是正常的，则其降低作用最小。Exendin-4治疗还与血糖指标和胰岛素敏感性改善有关，如实施例9和13所述。
Exendin-4呈剂量依赖性降低HSD大鼠的胃排空，而且该作用比GLP-1强约90倍。还证实exendin-4在外周给予后降低NIH/Sw(Swiss)小鼠的摄取食物量，其作用比GLP-1更强至少1000倍。Exendin-4降低高胰岛素、高血糖钳状态的麻醉ZDF大鼠的血浆胰高血糖素浓度约40％，但是不会影响正常大鼠正常血糖状态的血浆胰高血糖素浓度。参见实施例4。证实exendin-4剂量依赖性降低肥胖型ZDF大鼠的体重，同时在瘦型ZDF大鼠所观测到体重降低似乎是暂时性的。
由于exendin-4具有增强和恢复胰岛素分泌以及抑制胰高血糖素分泌的作用，所以它可用于保持分泌胰岛素能力的2型糖尿病患者。其抑制摄取食物、胃排空、调节营养吸收的其它机制以及抑制胰高血糖素的作用还支持exendin-4用于治疗例如肥胖症、1型糖尿病和胰岛素分泌减少的2型糖尿病患者。
用小鼠、大鼠和猴以单剂量研究，用大鼠和猴以重复剂量(最高为28个连续日剂量)研究以及突变和染色体畸变的体外实验研究了exendin-4的毒理学。迄今，没有发生死亡，没有观测到治疗相关性血液学、临床化学变化或者肉眼或显微镜组织学变化。证实exendin-4无致突变作用，而且在所测试的浓度(最高为5000μg/mL)不会引起染色体畸变。
为了有利于研究exendin-4的非临床药代动力学和机理，建立了许多免疫测定。在最初的药代动力学研究中使用了敏感性有限(约100pM)的放射免疫测定。然后用更低定量限为15pM的验证exendin-4的两点IRMA测定。参见实施例5和7。采用放射免疫测定发现皮下给予的exendin-4的生物利用度约50-80％。这类似于腹膜内给予后观测到的结果(48-60％)。在30-43分钟(Tmax)之间出现血浆峰浓度(Cmax)。Cmax和AUC值均只与剂量有关。皮下给予exendin-4的表观终末半衰期约90-110分钟。这明显比静脉给药后观测到的14-41分钟长。采用IRMA测定获得类似的结果。比较exendin-4与GLP-1的降解研究表明，exendin-4相对耐受降解。
研究评价可能涉及exendin抗糖尿病活性、其代谢稳定性和改善其物理特性的结构活性关系(SAR)，特别是因为它涉及肽稳定性和替代传递系统的可能性(amenability)，使得发现了exendin激动剂肽化合物。Exendin激动剂包括exendin肽类似物，其中一个或多个天然氨基酸被去除或被另一个氨基酸取代。优选的exendin激动剂为exendin-4激动剂类似物。特别优选的exendin激动剂为描述于1998年8月6日申请的题为“新型exendin激动剂化合物”的国际申请号PCT/US98/16387中的exendin激动剂，所述申请要求1997年8月8日申请的美国临时申请号60/055,404的权益，包括下式(I)[SEQ.ID.NO.3]的化合物Xaa1Xaa2Xaa3Gly Thr Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Ser Lys Gln Xaa9Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuXaa10Xaa11Xaa12Xaa13Leu Lys Asn Gly Gly Xaa14Ser Ser Gly Ala Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18-Z其中Xaa1为His、Arg或Tyr；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Asp或Glu；Xaa4为Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa5为Thr或Ser；Xaa6为Ser或Thr；Xaa7为Asp或Glu；Xaa8为Leu、Ile、Val、苯基甘氨酸或Met；Xaa9为Leu、Ile、苯基甘氨酸、Val或Met；Xaa10为Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa11为Ile、Val、Leu、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa12为Glu或Asp；Xaa13为Trp、Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立为Pro、高脯氨酸(homoproline)、3Hyp、4Hyp、硫脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基苯基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；Xaa18为Ser、Thr或Tyr；而Z为-OH或-NH2；前提是所述化合物不是exendin-3或exendin-4。
N-烷基甘氨酸、N-烷基苯基甘氨酸和N-烷基丙氨酸的优选N-烷基包括优选1-约6个碳原子、更优选1-4个碳原子的低级烷基。合适的化合物包括具有SEQ.ID.NO.9-39的氨基酸序列的图1所示的化合物。
优选的exendin激动剂化合物包括其中Xaa1为His或Tyr的化合物。更优选Xaa1为His。
优选其中Xaa2为Gly的化合物。
优选其中Xaa9为Leu、苯基甘氨酸或Met的化合物。
优选的化合物包括其中Xaa13为Trp或Phe的化合物。
还优选其中Xaa4为Phe或萘基丙氨酸；Xaa11为Ile或Val，而Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立选自Pro、高脯氨酸、硫脯氨酸或N-烷基丙氨酸的化合物。N-烷基丙氨酸最好具有1-约6个碳原子的N-烷基。
按照一个特别优选的方面，Xaa15、Xaa16和Xaa17为相同的氨基酸残基。
优选其中Xaa18为Ser或Tyr、更优选Ser的化合物。
优选Z为-NH2。
按照一个方面，优选这样的式(I)化合物其中Xaa1为His或Tyr、更优选His；Xaa2为Gly；Xaa4为Phe或萘基丙氨酸；Xaa9为Leu、苯基甘氨酸或Met；Xaa10为Phe或萘基丙氨酸；Xaa11为Ile或Val；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立选自Pro、高脯氨酸、硫脯氨酸或N-甲基丙氨酸；而Xaa18为Ser或Tyr、更优选Ser。更优选Z为-NH2。
按照一个特别优选的方面，特别优选的化合物包括这样的式(I)化合物，其中Xaa1为His或Arg；Xaa2为Gly；Xaa3为Asp或Glu；Xaa4为Phe或萘基丙氨酸；Xaa5为Thr或Ser；Xaa6为Ser或Thr；Xaa7为Asp或Glu；Xaa8为Leu或苯基甘氨酸；Xaa9为Leu或苯基甘氨酸；Xaa10为Phe或萘基丙氨酸；Xaa11为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa12为Glu或Asp；Xaa13为Trp或Phe；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立为Pro、高脯氨酸、硫脯氨酸或N-甲基丙氨酸；Xaa18为Ser或Tyr；Z为-OH或NH2；前提是所述化合物不具有SEQ.ID.NO.1或2的分子式。更优选Z为-NH2。特别优选的化合物包括具有SEQ.ID.NO.9、10、21、22、23、26、28、34、35和39的氨基酸序列的化合物。
按照一个特别优选的方面，提供以下这样的化合物其中Xaa9为Leu、Ile、Val或苯基甘氨酸，更优选Leu或苯基甘氨酸，而Xaa13为Phe、Tyr或萘基丙氨酸，更优选Phe或萘基丙氨酸。这些化合物将具有有利的作用持续时间，而且在体外和体内以及合成所述化合物期间均不容易氧化降解。
Exendin激动剂化合物还包括描述于1998年11月13日申请的题为“新型exendin激动剂化合物”的国际申请号PCT/US98/24210中的化合物，所述申请要求1997年11月14日申请的美国临时申请号60/065,442的权益，包括下式(II)[SEQ.ID.NO.4]的化合物Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1为His、Arg或Tyr；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala、Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、苯基甘氨酸或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、苯基甘氨酸、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Ala、Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile、Val、Leu、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立为Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基苯基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；以及Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不多于3个为Ala。
N-烷基甘氨酸、N-烷基苯基甘氨酸和N-烷基丙氨酸的优选N-烷基包括优选1-约6个碳原子、更优选1-4个碳原子的低级烷基。
优选的exendin激动剂化合物包括其中Xaa1为His或Tyr的化合物。更优选Xaa1为His。
优选其中Xaa2为Gly的化合物。
优选其中Xaa14为Leu、苯基甘氨酸或Met的化合物。
优选的化合物为其中Xaa25为Trp或Phe的化合物。
优选的化合物为其中Xaa6为Phe或萘基丙氨酸；Xaa22为Phe或萘基丙氨酸；而Xaa23为Ile或Val的化合物。
优选其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立选自Pro、高脯氨酸、硫脯氨酸和N-烷基丙氨酸的化合物。
优选Z1为-NH2。
优选Z2为-NH2。
按照一个方面，优选式(II)的化合物，其中Xaa1为His或Tyr、更优选His；Xaa2为Gly；Xaa6为Phe或萘基丙氨酸；Xaa14为Leu、苯基甘氨酸或Met；Xaa22为Phe或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立选自Pro、高脯氨酸、硫脯氨酸或N-烷基丙氨酸。更优选Z1为-NH2。
按照一个特别优选的方面，特别优选的化合物包括式(II)的化合物，其中Xaa1为His或Arg；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala、Phe或萘基丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或苯基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu或苯基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、Gly Gly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31Ser-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly AlaXaa36Xaa37-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立为Pro高脯氨酸、硫脯氨酸或N-甲基丙氨酸；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不多于3个为Ala。特别优选的化合物包括具有SEQ.ID.NO.40-61氨基酸序列的化合物。
按照一个特别优选的方面，提供这样的化合物其中Xaa14为Leu、Ile、Val或苯基甘氨酸，更优选Leu或苯基甘氨酸，而Xaa25为Phe、Tyr或萘基丙氨酸，更优选Phe或萘基丙氨酸。这些化合物在体外和体内以及合成所述化合物期间均不容易氧化降解。
exendin激动剂化合物还包括描述于1998年11月13日申请的题为“新型exendin激动剂化合物”的国际专利申请号PCT/US98/24273中的化合物，所述申请要求1997年11月14日申请的美国临时申请号60/065,029的权益，包括下式(III)[SEQ.ID.NO.5]的化合物Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1为His、Arg、Tyr、Ala、Norval、Val或Norleu；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala、Norval、Val、Norleu或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala、Norval、Val、Norleu、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、苯基甘氨酸或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、苯基甘氨酸、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile、Val、Leu、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立为Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基苯基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；以及Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不多于3个为Ala；另一前提是如果Xaa1为His、Arg或Tyr，则Xaa3、Xaa4和Xaa9中的至少一个为Ala。化合物的制备应用标准固相肽合成技术而且优选自动或半自动肽合成仪可合成组成所述制剂活性成分的化合物以及本发明用量。在下文实施例1和2中描述exendin-3和exendin-4的制备。其它exendin激动剂肽类似物的制备描述于下文的实施例13-198。
通常采用自动或半自动肽合成技术，在一种碱如二异丙基乙胺存在下，在偶联剂如二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑存在下，在惰性溶剂如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯二酮(N-methylpyrrolidinone)或二氯甲烷中，于室温下使α-N-氨基甲酰基保护的氨基酸和连接在树脂上的延长肽链的氨基酸偶联。采用试剂如三氟乙酸或哌啶从产生的肽-树脂去除α-N-氨基甲酰基保护基，用加入到所述肽链的下一个需要的N-保护的氨基酸重复偶联反应。合适的N-保护基团是本领域众所周知的，本发明优选叔丁氧基羰基(tBoc)和芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
用于肽合成仪的溶剂、氨基酸衍生物和4-甲基二苯甲基-胺树脂可购自Applied Biosystems Inc.(Foster City，CA)。以下侧链保护的氨基酸可购自Applied Biosystems，Inc.Boc-Arg(Mts)、Fmoc-Arg(Pmc)、Boc-Thr(Bzl)、Fmoc-Thr(t-Bu)、Boc-Ser(Bzl)、Fmoc-Ser(t-Bu)、Boc-Tyr(BrZ)、Fmoc-Tyr(t-Bu)、Boc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Lys(Boc)、Boc-Glu(Bzl)、Fmoc-Glu(t-Bu)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Asn(Trt)和Fmoc-Gln(Trt)。Boc-His(BOM)可购自Applied Biosystems，Inc.或Bachem Inc.(Torrance，CA)。茴香醚、二甲基硫化物、酚、乙二硫醇和硫茴香醚可得自Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)。AirProducts和Chemicals(Allentown，PA)提供HF。乙醚、乙酸和甲醇可购自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。
利用NMP/HOBt(Option 1)系统和封端的tBoc或Fmoc化学(参见Applied Biosystems的ABI 430A肽合成仪用户使用手册，1.3B版，1998年7月1日，第6部分，第49-70页，Applied Biosystems，Inc.，FosterCity，CA)，使用自动肽合成仪(430A型，Applied Biosystems Inc.，FosterCity，CA)可进行固相肽合成。用HF(-5℃-0℃，1小时)裂解Boc-肽-树脂。交替用水和乙酸从树脂提取肽，冻干滤液。按照标准方法(裂解技术介绍，Applied Biosystems，Inc.，1990，第6-12页)裂解Fmoc-肽树脂。采用Advanced Chem Tech合成仪(MPS 350型，Louisville，Kentucky)又可以装配肽。
可采用Waters Delta Prep 3000系统经RP-HPLC(制备型和分析型)纯化肽。C4、C8或C18制备型柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，CA)可用来分离肽，可用C4、C8或C18分析型柱(5μ，0.46×25cm；Vydac)测定纯度。可以1.0ml/min流速将溶剂(A＝0.1％TFA/水，而B＝0.1％TFA/CH3CN)输送至分析型柱，以15ml/min输送至制备型柱。可用Waters Pico Tag系统进行氨基酸分析，采用Maxima程序进行处理。可通过汽相酸水解(115℃，20-24h)水解肽。可用标准方法(Cohen等，Pico Tag方法氨基酸分析先进技术手册，第11-52页，MilloporeCorporation，Milford，MA(1989))产生并分析水解产物。可用M-Scan，Incorporated(West Chester，PA)进行快原子轰击分析。可用碘化铯或碘化铯/甘油进行质量校正(mass calibration)。可用Applied BiosystemsBio-Ion 20质谱仪进行利用飞行时间检测的血浆解析离子分析。可用VG-Trio仪器进行电子喷雾质谱分析。
也可以采用本领域已知的方法，用重组DNA技术制备可用于本发明制剂和剂量的肽活性成分化合物。参见例如Sambrook等，Molecular ClongingA Laboratorv Manual，第二版，Cold Spring Harbor(1989)。实用性鉴于其药理特性，本文所述制剂和剂量是有效的。具体地说，本发明的制剂和剂量作为exendin和exendin激动剂是有效的，具有降低血糖药物的活性，而且可调节胃动力以及减慢胃排空，其证据是它们能够降低哺乳动物的餐后血糖水平。制剂和给药方法鉴于其exendin样作用，本发明的exendin和exendin激动剂制剂和剂量是有效的，而且可以方便地提供适合胃肠外(包括静脉内、肌内和皮下)给药的制剂形式。本文还描述了可用于替代传递途径(包括口、鼻、颊、舌下和肺)的制剂和剂量。
可以注射或输注用胃肠外组合物提供用于本发明的化合物。一般来说，它们可例如悬浮于惰性油、合适的植物油如芝麻油、花生油、橄榄油或者其它可接受的载体中。它们最好是悬浮于水性载体中，例如pH约3.0-约7.0、更特别约4.0-6.0以及优选约4.0-约5.0的等张缓冲液。这些组合物可用常规消毒技术消毒或者可以过滤除菌。根据需要，所述组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理状态，例如pH缓冲剂。有效的缓冲剂包括例如醋酸钠/醋酸缓冲剂。可采用氯化钠或其它药学上可接受的物质例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、聚乙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)或其它无机溶质或有机溶质达到需要的等张性。对于含钠离子的缓冲剂特别优选氯化钠。
所述exendin和exendin激动剂化合物也可以配制为药学上可接受的盐(例如酸加成盐)和/或其复合物。药学上可接受的盐为在其给予浓度无毒的盐。这样的盐的制剂通过改变所述组合物的物理化学特性而不会妨碍所述组合物发挥其生理作用，从而能促进所述药理作用。有用的物理特性改变的实例包括降低熔点，以有助于经粘膜给药以及增加溶解性而有助于给予更高浓度的所述药物。
药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐的酸加成盐。能够由以下酸获得药学上可接受的盐，所述酸例如盐酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸和奎尼酸。可如下制得这样的盐例如使游离酸或游离碱形式的所述制品与一个或多个相当量的合适碱或酸在其中所述盐是不溶性的溶剂或介质中进行反应，或者在溶剂如水中反应，然后通过真空或冷冻干燥去除所述溶剂，或者在合适的离子交换树脂上使现存盐的离子交换为另一种离子而制得。
一般来说，也可以使用载体或赋形剂，以有助于给予本发明的剂量。载体和赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖如乳糖、或者各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理学上相容的溶剂。
如果需要的话，可用增稠剂例如甲基纤维素增稠上述剂量组合物溶液。它们可以制成油包水或水包油的乳化形式。可以应用各种各样的药学上可接受的乳化剂中的任何一种，包括例如金合欢胶粉、非离子表面活性剂(例如吐温)或离子表面活性剂(例如碱金属聚醚醇硫酸盐或磺酸盐，例如Triton)。
一般来说，按照周知的方法混合所述成分制备本发明的制剂和剂量组合物。例如，在混合器或其它标准装置中简单混合所选定的组分以便产生浓缩的混合物，然后加入水或增稠剂调节至最终浓度和粘度，可加入缓冲剂控制pH或者加入额外溶质控制张力。
其它药学上可接受的载体及其制剂描述于标准制剂疗法，例如E.W.Martin编著的Remington’s Pharmaceutical Sciences。此外参见Wang，Y.J.和Hanson，M.A.“蛋白质和肽类的胃肠外制剂稳定性和稳定剂”，Journal of Parenteral Science and Technology，第10号技术报告，增刊422S(1988)。
为了便于医生应用，所述化合物以单位剂型提供，所述单位剂型含有一定量的exendin激动剂，可以含有或不含有另一治疗药物，例如降低葡萄糖药物、胃排空调节剂、降低脂质药物或摄取食物抑制剂。用于控制血糖或控制胃排空和得益于胃排空减慢或胃排空调节的病症的exendin激动剂的治疗有效量为降低餐后血糖水平的剂量，优选在约8-9mM范围内或者使血糖水平按照需要降低的剂量。在糖尿病或葡萄糖耐受不良的个体，血浆葡萄糖水平比正常个体高。在这类个体中，可达到有益地降低餐后血糖水平或者使餐后血糖水平“平滑”。本领域技术人员已知，治疗药物的有效量随许多因素而变化，包括患者的机体状况、血糖水平或需要达到抑制胃排空的水平、或者需要降低摄取食物的水平以及其它因素。
这样的药用组合物可用于增加患者的胰岛素敏感性，也可以用于有益地增加对胰岛素的敏感性的疾病，例如糖尿病。
可以使用一种贮藏或“储存(depot)”缓释制剂，使得治疗有效量的所述制剂在经皮注射或其它传递形式数小时或数天内输送入血流。
介绍了所述化合物的有效日剂量。主治医师可决定需要给予的准确剂量，而且准确剂量还取决于所使用的具体exendin或exendin激动剂化合物的效力以及个体的年龄、体重和身体状况。给予患者本申请化合物的最佳模式取决于本领域已知的因素，例如具体的疾病或紊乱、所需要的作用和患者的类型。尽管所述化合物常规用于治疗人类患者，但是也可以用来治疗其它脊椎动物的相似或相同疾病，所述脊椎动物例如其它灵长类动物，家禽如猪、牛和鸡，以及体育运动动物和宠物例如马、狗和猫。
本发明包括exendin和exendin激动剂的制剂，它包含exendin或exendin激动剂和混合在一起的缓冲剂(优选醋酸盐缓冲剂)、等渗调节剂(优选甘露醇)以及任选包含防腐剂(优选间甲酚)，所述制剂的pH约3.0-约7.0(优选约4.0-约5.0)。
最有利于胃肠外液体剂型的制剂为所述活性成分是稳定的、具有足够的缓冲能力以在所述产品的预定储藏期内维持所述溶液的pH。该剂型应该是等张和/或等渗溶液，以有助于稳定所述活性成分或者缓解注射部位疼痛或者二者兼而有之。然而传送非常微量的注射体积的装置可能不要求所述制剂为等张和/或等渗。如果所述剂型包装为单位剂量，则可含有防腐剂，但是不是必须的。然而如果所述剂型用多用容器包装，则防腐剂是必需的。
这些剂型在水性体系中分别含有约0.005-约0.4％、更优选约0.005-约0.02％或者约0.005-约0.05％(w/v)所述活性成分，所述剂型同时含有约0.02-0.5％(w/v)单独的或组合的醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐或类似的缓冲剂，以使最终组合物的pH约3.0-7.0、更优选约4.0-约6.0或者约4.0-5.0，以及含有约1.0-10％(w/v)碳水化合物或多元醇等渗调节剂(优选甘露醇)或最高约0.9％盐水或二者的混合物，使得连续水相为等张或等渗溶液。如果所述制剂用多用容器包装，则还可含有约0.005-1.0％(w/v)抗微生物的防腐剂，防腐剂选自间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯以及酚。加入足够量的注射用水获得需要浓度的溶液。如果需要的话，也可以含有氯化钠以及其它赋形剂。但是这样的赋形剂必须保持所述活性成分的整体稳定性。
多元醇和碳水化合物具有相同的主链特征，即-CHOH-CHOH-。多元醇包括诸如山梨醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)的化合物。这些化合物是直链分子。另一方面，诸如甘露糖、核糖、海藻糖、麦芽糖、甘油、肌醇、葡萄糖和乳糖的碳水化合物是可含有一个酮基或醛基的环形分子。这两类化合物也可有效稳定蛋白质，以抵抗温度升高和冻融或冻干工艺引起的蛋白质变性。合适的碳水化合物包括半乳糖、阿拉伯糖、乳糖或任何其它对糖尿病患者没有副作用的碳水化合物，也就是所述碳水化合物不会代谢形成高浓度的血糖。适合糖尿病的这样的碳水化合物是本领域众所周知的。
本发明的肽最好与以下成分混合一种诸如山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/乙二醇共聚物的多元醇以及分子量为200、400、1450、3350、4000、6000和8000的各种聚乙二醇(PEG)。甘露醇为优选的多元醇。
本发明的液体制剂应该为大致等张和/或等渗的。等张溶液可定义为这样的溶液与将导入其中的溶液的渗透压相同的电解质浓度或电解质和非电解质组合物浓度的溶液，在本文中如果胃肠外注射给予所述制剂，则溶液的渗透压将与哺乳动物组织渗透压相同。同样，等渗溶液可定义为这样的溶液与将导入其中的溶液的渗透压相同的非电解质浓度的溶液。本文使用的“大致等张”是指±20％的等张性，优选在±10％范围内。本文使用的“大致等渗”是指±20％等重量克分子渗透浓度，优选在±10％范围内。配制的注射制品包装于容器中，通常例如为小瓶、药筒、预灌注的注射器或一次性笔。
最有利于单位剂量的胃肠外冻干剂型的制剂是其中所述活性成分相当稳定、具有或不具有足够缓冲能力以维持复制制品在预定保存期内的溶液pH的制剂。所述剂型应含有有助于结块的增量剂。所述增量剂在复制时还可用作张力剂和/或等重量克分子渗透浓度调节剂，以有助于稳定所述活性成分和/或减轻注射疼痛。如上所述，传送非常微量注射体积的装置可能不需要所述制剂是等张和/或等渗的。表面活性剂也有利于结块性质和/或有助于复制。
这些剂型包含约0.005-约0.4％、更优选约0.005-约0.02％或者约0.005-约0.05％(w/v)所述活性成分。所述制剂不必包含缓冲剂和/或如果在复制的活性成分决定的稳定期内用完容器内的内容物，不必用缓冲液复制所述冻干制剂。如果使用缓冲剂，它可包含于所述冻干物或复制溶剂中。所以，所述制剂和/或复制溶剂单计或总计含有约0.02-0.5％(w/v)单独的或组合的醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲剂，使得最终组合物的pH约为3.0-7.0，更具体为约4.0-约6.0或者约4.0-5.0。所述增量剂包括约1.0-10％(w/v)碳水化合物或多元醇等渗调节剂(如上所述)或0.9％以内的盐水或二者的组合物，使复制的水相为等张或等渗溶液。可包含表面活性剂，优选约0.1-约1.0％(w/v)吐温80或其它非离子去垢剂。如上所述，需要的话，冻干的单位剂量制剂还可含有氯化钠以及其它赋形剂。但是，这样的赋形剂必须保持所述活性成分的整体稳定性。在鉴定用以维持所述活性成分稳定性的有效参数范围内冻干所述制剂。
冻干前的本发明液体制剂应该在冻干前基本上为等张和/或等渗或者在复制后能够形成等张和/或等渗溶液。所述制剂应该在冻干形式和复制后的保存期研究确立的时间内使用。所述冻干制品包装在容器中，通常例如为小瓶。如果使用其它容器，例如药筒、预灌装的注射器或一次性笔，则也可以包含所述复制溶剂。
与上述胃肠外液体制剂和冻干单位剂量制剂一样，最有利于多剂胃肠外冻干剂型的制剂是其中所述活性成分相当稳定、具有足够缓冲能力以维持所述溶液在所述制品预定“有效”保存期内的pH的制剂。所述剂型应含有有助于结块的增量剂。所述增量剂在复制时还可用作张力剂和/或等重量克分子渗透浓度调节剂，以有助于稳定所述活性成分和/或减轻注射疼痛或者二者兼而有之。再者，传送非常微量注射体积的装置可能不需要所述制剂是等张和/或等渗的。但是表面活性剂是必需的，以有利于患者多次使用。
这些剂型分别包含约0.005-约0.4％、更优选约0.005-约0.02％或者约0.005-约0.05％(w/v)所述活性成分。所述制剂不必包含缓冲剂和/或如果在复制的活性成分决定的稳定期内用完容器内的内容物，不必用缓冲液复制所述冻干制剂。如果使用缓冲剂，它可包含于所述冻干物或复制溶剂中。所以，所述制剂和/或复制溶剂单计或总计含有约0.02-0.5％(w/v)单独的或组合的醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲剂，使得最终组合物的pH约为3.0-7.0，更具体为约4.0-约6.0或者约4.0-5.0。所述增量剂包括约1.0-10％(w/v)碳水化合物或多元醇等渗调节剂(优选甘露醇)或0.9％以内的盐水或二者的组合物，使复制的水相为等张或等渗溶液。可包含表面活性剂，优选约0.1-约1.0％(w/v)吐温80或其它非离子去垢剂。如果所述制剂用多用容器包装，则还包含约0.005-1.0％(w/v)选自以下的抗微生物防腐剂间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯以及酚(优选间甲酚)。如果需要的话，还可以含有氯化钠以及其它赋形剂。但是，再者，这类赋形剂必须保持所述活性成分的整体稳定性。在鉴定用以维持所述活性成分稳定性的有效参数范围内冻干所述制剂。本发明液体制剂应该在冻干前基本上为等张和/或等渗或者在复制后能够形成等张和/或等渗溶液。所述制剂应该在冻干形式和复制后的保存期研究确定的时间内使用。所述冻干制品包装在容器中，通常例如为小瓶。如果使用其它容器，例如药筒、预灌装的注射器或一次性笔，则也可以包含复制溶剂。
最有利于口服、鼻、肺和/或气管内剂型的制剂为防腐或非防腐的液体制剂和/或干粉制剂，或者对于口服给药，为固体制剂。该防腐或非防腐液体制剂与防腐或非防腐胃肠外液体制剂的上述制剂基本相同。所述溶液的pH应该约3.0-7.0，最优选pH高于或等于约5.0，以便减小气管收缩的可能性。干粉制剂可含有增量剂和/或盐类，有助于形成的一定大小的颗粒和合适的颗粒大小分布。表面活性剂和/或盐类还有助于颗粒形态学特性和/或促进组织摄取所述活性成分。
这些干粉剂型的活性成分含量范围分别为1％-100％(w/w)。不必含有有助于形成一定颗粒大小和/或颗粒大小分布的增量剂和/或盐类。所述增量剂和/或盐类可包含约0-99％(w/w)碳水化合物或多元醇或者约0-99％盐或者二者的组合物，使得颗粒大小为优选的颗粒大小和分布。可包含表面活性剂，优选约0.1-约1.0％(w/w)吐温80或其它非离子去垢剂。如果需要的话，还可以存在氯化钠和其它赋形剂。但是，这样的赋形剂必须保持所述活性成分的整体稳定性以及有助于合适水平的水化作用。
最有利于鼻和/或气管内剂型的制剂为上述防腐或非防腐的液体制剂。
可使用可溶凝胶和/或贴片促进口颊部给药。可用不同类型的淀粉和/或纤维素衍生物制备所述凝胶。
类似于上述的胃肠外液体制剂或复制后的胃肠外冻干制剂的液体制剂可能最有利于舌下给药，不同的是该剂型不需要为等张和/或等渗溶液。固体剂型可类似于口服固体剂型，不同的是它们必须容易在舌下溶解。
类似于所述胃肠外液体制剂的液体(凝胶盖)制剂可能最有利于口服给药，不同的是所述溶液浓度可以更高而且可含有其它有助于小肠吸收所述活性成分的添加剂。固体剂型含有惰性成分和所述活性成分，以有助于制片。这些成分可包括多元醇(甘露醇)、碳水化合物或各种类型的淀粉、纤维素衍生物和/或其它惰性生理相容性物质。所述片剂可进行肠溶包衣，以使其在胃内的消化减至最小，因此促进溶解以及进一步沿消化道吸收。
本发明还包括注射给药以及通过其它途径给药的exendin和exendin激动剂的优选剂量。因此，本发明提供相当效力的exendin和exendin激动剂的制剂供注射给药，包括约0.1-约0.5μg/Kg，每天1-3次。通常例如对于体重约70公斤(1型糖尿病的平均体重)至约90公斤(2型糖尿病的平均体重)的糖尿病患者而言，每天单次或分次总计给予约10-约120μg。如果分次给药，所述剂量优选以每天2-3次给予，更优选每天2次。
在一个优选注射方法中，胃肠外、更优选注射(例如外周注射)给予exendin或exendin激动剂。优选每天给予约1μg-30μg至约1mgexendin或exendin激动剂。更优选每天给予约1-30μg至约500μg、或者约1-30μg至约50μg exendin或exendin激动剂。更优选根据患者体重和所给予化合物的效力，每天给予约3μg-约50μg exendin或exendin激动剂。大致具有exendin-4效力的化合物的基于患者体重的优选剂量范围为约0.005μg/kg/剂至约0.2μg/kg/剂。更优选大致具有exendin-4效力的化合物的基于患者体重的剂量范围为约0.02μg/kg/剂至约0.1μg/kg/剂。最优选大致具有exendin-4效力的化合物的基于患者体重的剂量范围为约0.05μg/kg/剂至约0.1μg/kg/剂。这些剂量每天以1-4次给予、优选每天1-2次。如果连续输注给药，通常exendin或exendin激动剂的剂量更低。如果通过非注射方法给药，例如口服、颊、舌下、鼻、肺、或皮肤贴片局部给药，exendin或exendin激动剂的剂量通常更高。
按照本发明的口服剂量包含约50至约100倍的所述活性成分，也就是说，每天单剂或多剂剂量约500至约12,000μg、优选每天约500至约5,000μg。按照本发明的肺部剂量包含约10至约100倍的所述活性成分，也就是说，每天单剂或多剂约100至约12,000μg、优选每天约500-1000μg。按照本发明的鼻、颊和舌下给药剂量也包含约10至约100倍的所述活性成分，也就是说每天单剂或多剂剂量约100至约12,000μg。
经鼻给药的优选剂量为每天约10-1000至约1200-12,000μg，经颊给药的优选剂量为每天约10-1000至约1200-12,000μg，舌下给药的优选剂量为每天约10-1000至约1200-8,000μg。最好是舌下剂量低于颊剂量。根据上述剂量和本文其它地方所述剂量，适当增加或降低效力低于或高于exendin-4的exendin激动剂的给药剂量。临床研究如下文实施例10所述，进行了双盲、安慰剂对照的不断递增的单剂量(single ascending dose)研究，在健康志愿者检测皮下给予exendin-4的安全性、耐受性和药代动力学。对40名空腹健康男性志愿者进行5个单剂量(0.01、0.05、0.1、0.2或0.3μg/kg)的皮下给予exendin-4的研究。在给药后1-2小时达到最大血浆exendin-4浓度，所检测的各剂量之间差异微小。检测数据表明，Cmax呈剂