专利名称：PPARγ激动剂15d-PGJ2在制备靶向肝癌干细胞药物中的应用的制作方法
本发明所要解决的技术问题是提供一种PPAR γ激动剂15d_PGJ2在制备靶向肝癌干细胞药物中的应用，该PPAR γ激动剂能有效的抑制CD133+肝癌干细胞亚群的生长，降低肝癌细胞系中CD133+亚群的比率，减弱肝癌细胞的体外单克隆形成及成球能力，同时降低肝癌细胞中干细胞相关基因的表达。本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现本发明的PPARy激动剂15d_PGJ2在制备靶向肝癌干细胞药物中的应用。在所述应用中，该PPAR γ激动剂15d-PGJ2的剂量彡500ng/ml，而彡5000ng/ml。本发明通过研究发现，PPAR γ激动剂15d_PGJ2对⑶133+肝癌干细胞亚群的作用， 结果表明PPAR γ激动剂15d-PGJ2能有效的抑制⑶133+肝癌干细胞亚群的生长，降低肝癌细胞系中CD133+亚群的比率，减弱肝癌细胞的体外单克隆形成及成球能力，同时降低肝癌细胞中干细胞相关基因的表达。这一研究结果提示PPAR γ可作为抑制肝癌干细胞的靶点，为开发有效的靶向肝癌干细胞的药物提供了实验依据。图1为PPAR γ激动剂15-PGJ2对⑶133+肝癌干细胞样亚群的生长抑制情况示意图。图2为PPARy激动剂15-PGJ2对PLC/PRF/5细胞克隆形成的影响示意图。图3为PPAR γ激动剂15-PGJ2对人肝癌细胞中⑶133+肿瘤干细胞样亚群比率的情况示意图。图中A为15-PGJ2对H印3B细胞中⑶133+肿瘤干细胞样亚群比率的情况示意图；B为15-PGJ2对SNU-182细胞中⑶133+肿瘤干细胞样亚群比率的情况示意图。图4为PPAR γ激动剂15-PGJ2对人肝癌细胞的成球能力影响的情况示意图。图中 A为PLC/PRF/5细胞在是否存在15-PGJ2的条件下形成球体的相差图，100X ；B为15-PGJ2 对PLC/PRF/5及!fep3B细胞成球能力影响的统计图。图5为PPAR γ激动剂15-PGJ2对!fep3B细胞中干细胞相关基因表达的影响示意图。 1. PPAR γ激动剂15d_PGJ2抑制⑶133+肝癌干细胞样亚群的生长将体外常规培养、生长至对数生长期的人肝癌细胞PLC/PRF/5，用0.25%胰酶 +0. 1% EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次，离心去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清悬浮细胞，4°C封闭lOmin。随后加入带PE荧光的人CD133抗体lul，4°C孵育30min。用FACS缓冲液(PBS+0. 5% BSA)洗涤两次，弃上清，加入Iml细胞培养液，通过Beckman MoFlo流式分选仪收集⑶133阳性PLC/PRF/5细胞。采用台盼蓝排除法计数活细胞，以每孔5X IO3个细胞接种于96-well细胞培养板中，于37°C、5%二氧化碳/95%空气的恒温培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将细胞培养液换成含1%FBS的DMEM培养液，并加入不同终浓度的 15d-PGJ2 :0、10、100、500、5000ng/ml，培养三天后，常规MTT试验检测540nm吸光度，设3个重复孔，以不加15d-PGJ2为对照组。结果如图1所示低剂量的PPAR γ激动剂15d_PGJ2对⑶133+肿瘤干细胞样亚群并没有明显的杀伤作用，而当15d-PGJ2的剂量达到500ng/ml后，对细胞的生长具有显著的抑制作用，而更高剂量5000ng/ml的15d_PGJ2并没有更强地抑制作用。2. PPAR γ的活化抑制肝癌细胞的克隆形成将体外常规培养、生长至对数生长期的人肝癌细胞PLC/PRF/5，用0.25%胰酶 +0. EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次，加入细胞培养液制备细胞悬液。采用台盼蓝排除法计数活细胞，以每孔500个细胞接种于12-well细胞培养板中，于37°C、5%二氧化碳/95% 空气的恒温培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将细胞培养液换成含FBS的DMEM培养液，并加入终浓度为0. 5ug/ml 15d-PGJ2，培养两周后，进行常规Gimsa染色，拍照。如图2显示PLC/PRF/5在加有PPAR γ激动剂15d_PJG2的培养液中所形成的细胞克隆数显著少于在未加15d-PJG2的培养液中形成的细胞克隆数。3. PPAR Y的活化降低肝癌细胞中的⑶133+肿瘤干细胞样亚群的比例将体外常规培养、生长至对数生长期的人肝癌细胞SNU-182或H印3B，用0. 25%胰酶+0. 1 % EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次，加入细胞培养液制备细胞悬液。采用台盼蓝排除法计数活细胞，以每孔5X IO4个细胞接种于12-well细胞培养板中，于37°C、5%二氧化碳 /95%空气的恒温培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将细胞培养液换成含FBS的DMEM 培养液，并加入终浓度为0. 5ug/ml 15d-PGJ2，培养三天后用0. 25%胰酶+0. 1 % EDTA消化细胞，PBS洗涤两次，取1 X IO5 1 X IO6的细胞放入流式管中，离心，去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清悬浮细胞，4°C封闭lOmin，再加入PE-CD133荧光抗体lul，4°C孵育30min。加入FACS缓冲液，轻轻混勻，300g离心5min，弃上清。最后加入300_500ul的FACS缓冲液， 用BD流式分析仪进行检测，结果见图3。结果显示经PPAR γ激动剂15d_PGJ2处理的肝癌细胞中⑶133+细胞亚群的比例显著低于未经PPAR γ激动剂15d-PGJ2处理的对照组。4. PPAR γ的活化抑制肝癌干细胞的球体形成将体外常规培养、生长至对数生长期的人肝癌细胞PLC/PRF/5或H印3Β，用0. 25% 胰酶+0. EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次，加入无血清sphere培养液(含1 XB27、20ng/ ml EGF、20ng/ml FGF的DMEM/F12培养液)制备细胞悬液。采用台盼蓝排除法计数活细胞， 以每孔250个细胞接种于24孔低吸附细胞培养板中，于37°C、5%二氧化碳/95%空气的恒温培养箱中培养过夜后，加入终浓度为0. 5ug/ml 15d-PGJ2，培养两周后，镜下计形成悬浮生长的肝球体(hepatospheres)。结果如图4所示在加有PPAR γ激动剂15d_PJG2后，PLC/PRF/5及H印3B细胞所形成的无论是直径50um-100um还是大于IOOum的肝球体数显著少于未加15d_PGJ2处理的细胞。5. qRT-PCR检测15d_PGJ2对肝癌细胞中干细胞相关基因表达的影响 将体外常规培养、生长至对数生长期的人肝癌细胞H印3B，用0. 25%胰酶+0. 1% EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次，加入细胞培养液制备细胞悬液。采用台盼蓝排除法计数活细胞，以每孔2. 5X IO5个细胞接种于6-well细胞培养板中，于37°C、5%二氧化碳/95% 空气的恒温培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将细胞培养液换成含FBS的DMEM培养液，并加入终浓度为0. 5ug/ml 15d-PGJ2，培养三天后去培养液，PBS洗涤两次后，加入 RNAiso Plus 提取细胞总 RNA，用 PrimeScript RT reagent Kit 将其反转录成 cDNA，以 cDNA 为模板进行实时定量PCR，采用ABI 7300荧光定量PCR仪检测干细胞相关基因的表达。所扩增的目的基因、其引物序列及相应探针序列如表1所示，所述引物及探针由 Takara生物技术有限公司合成。结果如图5所示H印3B细胞经15d-PGJ2处理后，干细胞相关基因AFP、Bmil、 Nanog的表达均有明显下降。表1.实时定量PCR扩增中各基因的特异性引物及探针序列

本发明公开了PPARγ激动剂15d-PGJ2在制备靶向肝癌干细胞药物中的应用。本发明通过研究发现，PPARγ激动剂15d-PGJ2对CD133+肝癌干细胞亚群的作用，结果表明PPARγ激动剂15d-PGJ2能有效的抑制CD133+肝癌干细胞亚群的生长，降低肝癌细胞系中CD133+亚群的比率，减弱肝癌细胞的体外单克隆形成及成球能力，同时降低肝癌细胞中干细胞相关基因的表达。这一研究结果提示PPARγ可作为抑制肝癌干细胞的靶点，为开发有效的靶向肝癌干细胞的药物提供了实验依据。