一种可替代抗生素的蛇毒提取物及其制备方法与应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于农业生物【技术领域】，具体涉及一种可替代抗生素的蛇毒提取物及其制备方法与应用。[0002]我国每年大约有6000吨抗生素用于动物饲养。大量抗生素的使用不仅造成了动物免疫功能的退化，而且导致了耐药性普遍发生。一些抗生素残留在动物体内，被人食用后对人体产生了不良后果； 一些抗生素自动物排放到环境中，导致环境污染，对人类的安全构成威胁。[0003]在抗生素替代物中，微生物发酵制剂、中草药制剂、功能性寡糖、有机酸是目前研究的热点。长期使用虽有一定增强动物免疫功能的作用，但是其抗菌效果仍然较抗生素差，长期使用的成本较高。[0004]蛇毒是蛇分泌的毒液经冻干而成的粉状固体，其主要成分为蛋白酶和多肽。蛇毒虽为有毒物质，但在一定剂量下是安全的。临床用蛇毒可治疗肿瘤、消化道溃疡、血栓等。李云龙等报道了多种蛇毒具有一定抗菌作用(李云龙，张宏.蛇毒的抗菌作用.安徽中医学院学报，1995，14(1):54-55),表明蛇毒含有抗菌成分。[0005]将蛇毒抗菌成分经过提取，以降低蛇毒毒性，并提高其抗菌效果，将其研制成安全的抗生素替代物用于动物畜禽疾病的防治。此方面研究未见报道。
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可替代抗生素的蛇毒提取物的制备方法；
[0007]本发明的另一目的在于提供上述制备方法得到的可代替抗生素的蛇毒提取物；
[0008]本发明的再一目的在于提供上述可代替抗生素的蛇毒提取物的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0010]一种可替代抗生素的蛇毒提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0011](I)将蛇毒用缓冲盐水溶液溶解后，离心除去不溶物，所得上清液用阳离子交换树脂吸附，再用含lmol/L氯化钠的相应的缓冲盐水溶液洗脱吸附部分，得到蛇毒组分洗脱液；
[0012]优选的，所述的蛇毒为蝮蛇毒和眼镜蛇毒；
[0013]优选的，所述的缓冲盐水溶液为pH为3~6的磷酸盐或醋酸盐缓冲液；
[0014]优选的，所述离心的条件为转速3000~10000转/min,离心时间10~60min ；
[0015]优选的，所述阳离子交换树脂为苯乙烯强酸性阳离子交换树脂、苯乙烯弱酸性阳离子交换树脂或丙烯酸弱酸性阳离子交换树脂；
[0016]优选的，所述阳离子交换树脂的用量为所述蛇毒的质量的I~5倍；
[0017]优选的，所述上清液在阳离子交换树脂中的吸附时间为2~12h ;[0018]优选的，所述含lmol/L氯化钠的相应的缓冲盐水溶液的用量为所述阳离子交换树脂的质量的2~5倍；
[0019](2)将步骤(1)所得蛇毒组分洗脱液通过超滤膜进行超滤，截留相对分子质量小于0.5~2万的组分，并通过纳滤膜进行纳滤以除去盐分，得到蛇毒组分提取液；
[0020]优选的，所述超滤的压力为0.1~0.5MPa ；
[0021]优选的，所述纳滤的压力为0.5~2MPa ；
[0022](3)将所述蛇毒组分提取液进行冷冻干燥成冻干粉，即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0023]一种由上述制备方法得到的可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0024]上述可替代抗生素的蛇毒提取物在预防与治疗细菌感染性畜禽疾病中作为抗生素替代物的应用；
[0025]优选的，所述可替代抗生素的蛇毒提取物在预防与治疗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或沙门氏菌感染性畜禽疾病中作为抗生素替代物的应用。
[0026]本发明的原理:
[0027]本发明将蛇毒经过阳离子交换树脂吸附，除去了大部分酸性纤溶酶，再经过超滤膜超滤，除去神经毒素；用纳滤除盐，并冷冻干燥，得到的提取物毒性显著降低，且保留了抗菌活性组分。
[0028]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0029](I)本发明所述制备方法除去了蛇毒中毒性强的大分子酶，降低了所述可替代抗生素的蛇毒提取物对动物的毒性，但保留了抗菌活性，使其安全性和活性有明显提高。
[0030](2)本发明所述制备方法不需要将蛇毒各组分经过柱层析分离，适合工业化生产，成本较低。

[0031]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0032]实施例1
[0033]一种可替代抗生素的蛇毒提取物，其制备方法如下:
[0034](I)取蝮蛇毒10g，用IOOmL的pH为3的醋酸钠缓冲液溶解，10000转/min离心IOmin,所得上清液用50g丙烯酸弱酸性阳离子交换树脂进行吸附12h,再用100g含lmol/L氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱树脂，得到蛇毒组分洗脱液；
[0035](2)将所得蛇毒组分洗脱液通过2万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力为
0.1MPa，通过超滤膜部分再经纳滤膜进行纳滤以除去盐分，纳滤压力2.0MPa，得到蛇毒组分提取液；
[0036](3)将所得蛇毒组分提取液冷冻干燥，得冻干粉2.Sg,即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0037]实施例2
[0038]一种可替代抗生素的蛇毒提取物，其制备方法如下:
[0039](I)取蝮蛇毒10g，用IOOmL的pH为6的磷酸钠缓冲液溶解，3000转/min离心60min，所得上清液用IOg苯乙烯强酸性阳离子交换树脂进行吸附2h，再用50g含lmol/L氯化钠的磷酸钠缓冲液洗脱树脂，得到蛇毒组分洗脱液；
[0040](2)将所得蛇毒组分洗脱液通过0.5万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力
0.5MPa，通过超滤膜部分再经纳滤膜进行纳滤以除去盐分，纳滤压力0.5MPa，得到蛇毒组分提取液；
[0041](3)将所得蛇毒组分提取液冷冻干燥，得冻干粉1.1g,即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0042]实施例3
[0043](I)取蝮蛇毒10g，用IOOmL的pH为5的醋酸钠缓冲液溶解，5000转/min离心30min，所得上清液用30g苯乙烯弱酸性阳离子交换树脂进行吸附6h，再用100g含lmol/L氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱树脂，得到蛇毒组分洗脱液；
[0044](2)将所得蛇毒组分洗脱液通过I万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力0.3MPa，通过超滤膜部分再经纳滤膜进行纳滤以除去盐分，纳滤压力l.0MPa，得到蛇毒组分提取液；
[0045](3)将所得蛇毒组分提取液冷冻干燥，得冻干粉2.4g，即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0046]实施例4
[0047]一种可替代抗生素的蛇毒提取物，其制备方法如下:
[0048](I)取眼镜蛇毒10g，用IOOmL的pH为3的磷酸钠缓冲液溶解，6000转/min离心20min，所得上清液用50g苯乙烯弱酸性阳离子交换树脂进行吸附12h，再用150g含lmol/L氯化钠的磷酸钠缓冲液洗脱树脂，得到蛇毒组分洗脱液；
[0049](2)将所得蛇毒组分洗脱液通过2万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力0.2MPa，通过超滤膜部分再经纳滤膜进行纳滤以除去盐分，纳滤压力2MPa，得到蛇毒组分提取液；
[0050](3)将所得蛇毒组分提取液冷冻干燥，得冻干粉3.6g，即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0051]实施例5
[0052]一种可替代抗生素的蛇毒提取物，其制备方法如下:
[0053](I)取眼镜蛇毒10g，用IOOmL的pH为4的醋酸钠缓冲液溶解，3000转/min离心50min，所得上清液用30g丙烯酸弱酸性阳离子交换树脂进行吸附10h，再50g含lmol/L氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱树脂，得到蛇毒组分洗脱液；
[0054](2)将所得蛇毒组分洗脱液通过I万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力0.4MPa，通过超滤膜部分再经纳滤膜进行纳滤以除去盐分，纳滤压力l.0MPa，得到蛇毒组分提取液；
[0055](3)将所得蛇毒组分提取液冷冻干燥，得冻干粉1.9g，即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0056]实施例6
[0057]一种可替代抗生素的蛇毒提取物，其制备方法如下:
[0058](I)取眼镜蛇毒10g，用IOOmL的pH为3的醋酸钠缓冲液溶解，10000转/min离心lOmin，所得上清液用20g苯乙烯强酸性阳离子交换树脂进行吸附5h，再用100g含lmol/L氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱树脂，得到蛇毒组分洗脱液；[0059](2)将所得蛇毒组分洗脱液通过0.5万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力
0.5MPa，通过超滤膜部分再经纳滤膜进行纳滤以除去盐分，纳滤压力0.5MPa，得到蛇毒组分提取液；
[0060](3)将所得蛇毒组分提取液冷冻干燥，得冻干粉1.4g，即得所述可替代抗生素的蛇毒提取物。
[0061]实施例7
[0062]取实施例1~6制备的可替代抗生素的蛇毒提取物进行对畜禽的抗菌性实验:
[0063]方法:从腹泻猪和病鸡分泌物中分离出的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的实验菌液，分别加入到MH肉汤培养基中，配制成108cfu/mL的浓度，于37°C培养6~8h，备用。
[0064]采用试管内药液稀释法，将所述可替代抗生素的蛇毒提取物的生理盐水溶液
2.0mL (浓度为50 μ g/mL)用肉汤呈倍稀释，分别与上述3种试验菌液0.1mL混匀后一起放入37°C孵箱中培育16~24h。将所述可替代抗生素的蛇毒提取物浓度最低的一管清亮未生长细菌的肉汤转种到琼脂平板上，仍无细菌生长，即表示该管的药量就是茶皂苷元衍生物的最小抑菌浓度(MIC)。采用庆大霉素作为阳性对照药。
[0065]结果:所述可替代抗生素的蛇毒提取物对致病菌的最低抑菌浓度的检测结果如表I所示，由表1分析可知，实施例1~6制备的可替代抗生素的蛇毒提取物对三种致病细菌均有良好的抑制作用，其最低抑菌浓度与阳性对照药庆大霉素相当，说明本发明所述可替代抗生素的蛇毒提取物具有抗生素的治疗效果。
[0066]表1本发明所述可替代抗生素的蛇毒提取物对致病菌的最低抑菌浓度(I μ g/mL)