一种提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法

武改红, 贾文娣, 钱世钧, 陈树林, 马延和, 马立娟

2012年3月28日

2011年11月29日

2011年11月29日

天津工业生物技术研究所

C12N9/42GK102392006SQ20111038828

霉菌 纤维素 酸性 利用 提高 生产

1.一种提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，包括有以下步骤步骤一、制备木霉菌种种子液；步骤二、预生产阶段将所述木霉菌种种子液接种于预生产发酵培养基中，调节初始 PH值在3. 0 7. 0，开始进行发酵，测定在发酵过程中，预生产发酵培养基的PH值开始持续增长的拐点，确定拐点时间T ；步骤三、生产阶段将所述木霉菌种种子液接种于与所述预生产发酵培养基组分及组分含量完全相同的生产发酵培养基中，调节初始PH值也相同，开始进行发酵，发酵过程中， 对所述生产发酵培养基的PH值进行分段调节，调节方法如下(1)发酵开始至所述拐点时间T为第一时段，对所述生产发酵培养基的pH值不加控制，(2)从所述拐点时间T至发酵结束为第二时段，控制所述生产发酵培养基的pH值在4. 0 5. 32.如权利要求1所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，其中，按质量百分比计，所述预生产发酵培养基还包括微晶纤维素3% 7%，有机氮源2 4%，无机氮源0. 3 0. 6%，无机盐0. 6 1. 3%，甘油0. 15 0. 4%，以及溶剂水3.如权利要求1或2所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤二中，调节所述预生产发酵培养基的初始pH值在4. 5 5. 54.如权利要求3所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤三中，发酵过程中，从时间拐点T至发酵结束的第二时段，控制所述生产发酵培养基的PH值在4. 7 5. 15.如权利要求3所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤三中，在所述发酵过程中，发酵20h至80h，控制所述生产发酵培养基的中的溶解氧的体积百分比在30% 40%，发酵80h至发酵结束，控制所述生产发酵培养基的溶解氧的体积百分比在20% 30%6.如权利要求2所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，步骤二中，微晶纤维素占所述预生产发酵培养基的总质量的5%7.如权利要求1所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤二和步骤三中，发酵过程中的温度控制在25 30°C8.如权利要求1所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤二中，所述预生产发酵培养基的体积为0. IL ；所述步骤三中，所述生产发酵培养基的体积为3L9.如权利要求1所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤二和步骤三中，发酵过程是在250 350r/min恒温摇床上震荡培养10.如权利要求1所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，其特征在于，所述步骤一中，制备木霉菌种种子液的方法是，将木霉菌种孢子悬浮液接入活化培养基中，在观 30°C，170 200r/min恒温摇床上震荡培养M 3 得到菌种种子液，其中，所述活化培养基包括微晶纤维素1 4%，玉米浆1 2%，以及溶剂水，调节初始pH值 4. 0 5. O0

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施如图1所示，本发明提供一种提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法，包括有以下步骤步骤一、制备木霉菌种种子液；步骤二、预生产阶段将所述木霉菌种种子液接种于预生产发酵培养基中，调节初始pH值在3. 0 7. 0，开始进行发酵，测定在发酵过程中，预生产发酵培养基的PH值开始持续增长的拐点，确定拐点时间T ；步骤三、生产阶段将所述木霉菌种种子液接种于与所述预生产发酵培养基组分及组分含量完全相同的生产发酵培养基中，调节初始PH值也相同，开始进行发酵，发酵过程中，对所述生产发酵培养基的PH值进行分段调节，调节方法如下(1)发酵开始至所述拐点时间T为第一时段，对所述生产发酵培养基的PH值不加控制，(2)从所述拐点时间T至发酵结束为第二时段，控制所述生产发酵培养基的pH值在4. 0 5. 3所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，其中，按质量百分比计，所述预生产发酵培养基还包括微晶纤维素3% 7%，有机氮源2 4%，无机氮源0.3 0.6%，无机盐0.6 1.3%，甘油0. 15 0.4%，以及溶剂水所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤二中， 调节所述预生产发酵培养基的初始pH值在4. 5 5. 5所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤三中， 发酵过程中，从时间拐点T至发酵结束的第二时段，控制所述生产发酵培养基的pH值在 4. 7 5. 1所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤三中， 在所述发酵过程中，发酵20h至80h，控制所述生产发酵培养基的中的溶解氧的体积百分比在30% 40%，发酵80h至发酵结束，控制所述生产发酵培养基的溶解氧的体积百分比在 20% 30%所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，步骤二中，微晶纤维素占所述预生产发酵培养基的总质量的5%所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤二和步骤三中，发酵过程中的温度控制在25 30°C所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤二中， 所述预生产发酵培养基的体积为0. IL ；所述步骤三中，所述生产发酵培养基的体积为3L所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤二和步骤三中，发酵过程是在250 350r/min恒温摇床上震荡培养所述的提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法中，所述步骤一中， 制备木霉菌种种子液的方法是，将木霉菌种孢子悬浮液接入活化培养基中，在观 30°C， 170 200r/min恒温摇床上震荡培养M 3 得到菌种种子液，其中，所述活化培养基包括微晶纤维素1 4%，玉米浆1 2%，以及溶剂水，调节初始pH值4. 0 5. 0实验材料本实验中，分别以里氏木霉Rut C-30 (Trichoderma reesei Rut C-30，保藏号为 CICC13052，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心)、绿色木霉(Trichoderma viride, 保藏号为CGMCC3.四41，购买于中国科学院微生物研究所普通菌种保藏中心)两种为供试菌株活化培养基包括微晶纤维素1 4%，玉米浆1 2%，以及溶剂水，调节初始pH 值 4. 0 5. 0本发明的发酵培养基包括预生产发酵培养基和生产发酵培养基发酵培养基以微晶纤维素作为碳源，玉米浆作为有机氮源，(NH4)2SO4作为无机氮源，甘油作为菌种发酵初期的直接碳源，KH2PO4, CaCO3> MgSO4作为无机盐成分，其中，KH2PO4, CaCO3可缓冲溶液，MgSO4 可促进酶合成因此，所确定出的发酵培养基包括微晶纤维素3 7%，玉米浆2 4%， (NH4) 2S040. 3 0. 6 %，KH2PO4 0. 4 0. 8 %，甘油 0. 15 0. 4 %，CaCO3 0. 15 0. 4 %， MgSO4O. 06 0. 14%，以及溶剂水，调节初始pH值4. 5 5. 5其中，有机氮源还可以是蛋白冻，以及其他本领域内常用的有机氮源；无机氮源还可以是NH4Cl以及本领域内常用的无机氮源以下实施例中，纤维素酶活力的检测方法采用国际理论与应用化学联合会 (IUPAC)推荐的国际标准方法，通过测定滤纸酶活用于表征纤维素酶的活力水平实施例一实验发现，纤维素底物作为碳源，其浓度会对微生物的发酵过程产生很大的影响， 尤其会影响微生物的发酵过程中的PH值本发明中以微晶纤维素作为碳源，考察在预生产发酵培养基或者生产预发酵培养基中碳源浓度对微生物发酵所得的纤维素酶的产量的影响微晶纤维素浓度在2% 7%之间变化(其他成分均不变)，得到随着微晶纤维素浓度的变化滤纸酶活的变化规律结合生产成本和经济效益等因素，微晶纤维素质量百分比在5%时，为最佳的生产条件，滤纸酶活相对较高上述结论同时适用于发酵培养基规模较小和较大的情况考察木霉菌种发酵过程中pH值的变化规律(见图1)发酵过程中，pH值的变化存在拐点并且，上述拐点的出现位置，随着碳源浓度的不同也会不同碳源浓度越大，时间拐点出现越晚在菌种的发酵过程中，发酵培养初期(发酵开始至时间拐点T的第一时段)，菌丝体吸收消耗发酵培养基中营养成分，发酵培养基内发酵液PH值上升，随着营养物质的减少以及产酸，发酵液PH值上升减缓并稍有回落上述发酵过程发酵液pH值有变化， 但幅度有限，很难也不必在此期间对PH值做过于严密的控制微生物进入对数生长后期或者稳定期产酶(时间拐点T至发酵结束)，pH值从时间拐点T开始出现持续上升，且上升幅度较大，此时控制好发酵液PH值至关重要pH值过低或过高会引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变，对菌丝稳定性有不利影响，而且影响纤维素酶蛋白的活性对于里氏木霉，时间拐点T出现的位置在16 20h，绿色木霉时间拐点T出现的位置则在23 26h实施例二由实施例一可知，调节发酵过程的pH值可同时满足提高发酵产量和后续提取纯化工艺的需求活化培养基包括微晶纤维素4%，玉米浆2%，以及溶剂水，调节初始pH值5. 0预生产发酵培养基包括微晶纤维素7%，玉米浆4%，(NH4)2SO4 0.6%, KH2PO4 0.8%，甘油 0.4%，CaCO3 0.4%, MgSO4 0. 14%，以及溶剂水，调节初始 pH 值 5. 5将菌种孢子悬浮液(IO7 IO8个/ml)接入活化培养基，在30°C、200r/min摇床上培养36h，得到种子液种子液按5%接种量接种至新鲜预生产发酵培养基在30°C，350r/ min恒温摇床上震荡培养，间歇培养，发酵生产纤维素酶发酵总时间为13 ！预生产阶段对发酵过程不进行pH值的控制，得到pH值相对时间变化的拐点(时间拐点T)分别为里氏木霉18h，绿色木霉25h预生产发酵培养基的体积为0. IL(置于 250ml摇瓶内)生产阶段发酵过程中，对生产发酵培养基的pH值进行分段调节，调节方法如下 (1)第一时段，对生产发酵培养基的PH值不加控制，(2)第二时段，通过向生产发酵培养基中流加硫酸或者氨水调节PH值，控制生产发酵培养基的pH值在4. 7 5. 1其中，生产发酵培养基的体积为3L (置于5L发酵罐)，其他条件与预生产阶段相同此外，还进行对比实验，在生产阶段的发酵过程中除进行pH值调节，进行溶解氧含量的分段调节，(1)在发酵20至80h期间，通过调节摇床转速和通风量，控制生产发酵培养基中溶解氧的体积百分比维持在30 40%; ( 发酵80h至发酵结束溶解氧的体积百分比维持在20 30%空白实验为生产阶段中对发酵过程不进行控制的情况表1两种木霉菌种在生产阶段三种发酵条件下的滤纸酶活对比(微晶纤维素浓度为7%，三种发酵条件为发酵过程pH值分段控制、发酵过程pH值分段控制+溶解氧分段控制以及发酵过程PH值不加控制)