一种用于预防猪口蹄疫的干扰素白油组合物的制作方法[0002]猪口蹄疫是由小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性和高度接触性的传染病。临诊上以猪口腔粘膜、鼻吻部、蹄部以及乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。猪口蹄疫的发病率很高、传染快、流行面大，对仔猪可引起大批死亡，造成严重的经济损失，世界各国对口蹄疫都十分重视防疫，此病已成为国际重点检疫对象。 [0003]猪口蹄疫的发生和流行同样离不开传染源、传播媒介、易感猪三者构成的链条。处于口蹄疫潜伏期和发病期的猪，几乎所有的组织、器官以及分泌物、排泄物等都含有口蹄疫病毒。病毒随同动物的乳汁、唾液、尿液、粪便、精液和呼出的空气等一起排放于外部环境，造成严重的污染，形成了该病的传染源。口蹄疫病毒的传播方式分为接触传播和空气传播，接触传播又可分为直接接触和间接接触。直接接触主要发生在同群动物之间，包括圈舍、牧场、集贸市场、展销会和运输车辆中动物的直接接触，通过发病动物和易感动物直接接触而传播。间接接触主要指媒介物机械性带毒所造成的传播，包括无生命的媒介物和有生命的媒介物,野生动物、鸟类、啮齿类、猫、狗、吸血蝙蝠、昆虫等均可传播此病,通过与病畜接触或者与病毒污染物接触，携带病毒机械地将病毒传给易感动物。口蹄疫病毒的气源传播方式，特别是对远距离传播更具流行病学意义，感染畜呼出的口蹄疫病毒形成很小的气溶胶粒子后，可以由风传播数千米，具有感染性的病毒能引起下风处易感动物发病。[0004]对于发生口蹄疫的猪或猪群体，采用的处理方式为扑杀，根据疫情发生情况确定扑杀范围，扑杀措施由宽到严的次序可为病畜一病畜的同群畜一疫区所有易感动物。[0005]干扰素是一种具有广谱抗病毒作用的蛋白质，它本身对病毒无直接杀灭作用，但可以抑制病毒复制。干扰素抗病毒的细胞机理:机体细胞内存在抗病毒蛋白的编码基因，正常情况下该基因处于抑制状态，当干扰素与细胞膜受体结合并进人细胞后，解除了该基因的抑制状态，机体细胞合成抗病毒蛋白质，从而使病毒核酸不能与宿主细胞的核糖核蛋白体结合，进而病毒无法复制。临床上，干扰素经常用于猪口蹄疫的预防。由于体内干扰素会被很快清除，所以临床上常常使用大剂量的干扰素来保证其效果。
[0006]本发明的目的是提供一种用于预防猪口蹄疫的干扰素白油组合物。[0007]本发明提供了一种用于预防猪口蹄疫的组合物，由序列表的序列I所示的猪α干扰素和白油组成；所述猪α干扰素与所述白油的配比为0.016mg-0.4mg:0.2mL。[0008]所述猪α干扰素与所述白油的配比具体可为0.016mg:0.2mL。
[0009]所述白油具体可为油包水型白油。所述油包水型白油具体可为如下产品=SEPPIC
S.A, MONTANIDE ISAllR VG。
[0010]本发明还要求保护以上任一所述组合物在制备用于预防猪口蹄疫的药物中的应用。
[0011]本发明还保护一种用于预防猪口蹄疫的药物，包括以上任一所述组合物。所述药物具体可由以上任一所述组合物和稀释液组成。所述稀释液具体可为PH7.2、10mM的PBS缓冲液。每4mL所述药物可含0.16mg-4mg所述猪α干扰素和2mL白油。每4mL所述药物具体可含0.16mg所述猪α干扰素和2mL白油。
[0012]所述药物的给药方式可为单次肌肉注射或单次皮下注射，优选单次肌肉注射。
[0013]所述药物的推荐给药剂量如下:0.016mg-0.4mg所述猪α干扰素/kg实验动物，
0.2mL所述白油/kg实验动物。所述药物最优选的给药剂量如下:0.016mg所述猪α干扰素/kg实验动物,0.2mL所述白油/kg实验动物。
[0014]所述猪具体可为长白猪。
[0015]对于猪口蹄疫的预防，目前主要依靠注射抗体疫苗，但抗体疫苗通常在注射7天后才能起到预防作用，该7天就成为了猪口蹄疫的危险期。目前主要通过注射猪α干扰素进行短期预防，但猪α干扰素通常只有3天左右的时效，还是不能解决预防7天的目的，为了尽可能增加预防时效，多数养殖者选择了高剂量注射，但高剂量注射还是很难将预防时效延长到7天，并且存在毒副作用大、增加病毒抗药性能问题。本发明的发明人通过大量实验研究发现，采用油包水型白油作为佐剂，将猪α干扰素与油包水型白油合理配比，可以在中等剂量给予动物的前提下实现7天的防效。本发明对于猪口蹄疫的防控具有重大的应用价值。



[0016]图1为猪α干扰素溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

[0017]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0018]载体pBV220:购自北京丁国昌盛生物技术有限责任公司，货号为MCV031。大肠杆菌DH5a:购自北京索莱宝科技有限公司，货号为C1100。疱疹性口炎病毒(VSV):中国兽医药品监察所。MDBK细胞:购自上海拜力生物科技有限公司，货号为NBL-1。实验动物为长白猪，购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平动物实验基地，约40日龄，每只体重为IOkg0油包水型白油:购自SEPPIC S.A，MONTANIDE ISAllR VG0水包油型白油:购自SEPPIC S.A, MONTANIDE ISA61VG。
[0019]实施例中所用的口蹄疫病毒的毒株名称为緬甸98,为国内攻毒标准株,记载该毒株的文献:李百忠，鞠久林丁左梅，緬甸98株生猪口蹄疫O型疫苗免疫试验报告，中国畜牧，2012年第5期。
[0020]猪α干扰素的氨基酸序列如序列表的序列I所示，其编码基因如序列表的序列2所示。
[0021] 实施例1、猪α干扰素的制备[0022]一、制备重组菌
[0023]1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入载体pBV220的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒(重组质粒中，序列表的序列2所示的DNA分子由PLPR启动子启动表达，PLPR启动子为温敏性启动子、42°C启动)。
[0024]2、将步骤I得到的重组质粒导入大肠杆菌DH5 α，得到重组菌。
[0025]二、发酵
[0026]1、挑取5-10个重组菌单菌落于LB液体培养基并培养至0D600nm值为0.5，然后将3体积份菌液与I体积份50%甘油混合，-20°C保存。
[0027]2、取步骤I得到的菌液，以0.05%体积比的接种量接种于200ml2*YT培养液(溶剂为水，溶质及其浓度如下:蛋白胨16克/升、酵母粉10克/升、氯化钠5克/升)，30°C、220rpm培养12h，得到种子液。
[0028]3、发酵[0029]发酵培养基:蛋白胨5克/升、酵母粉5克/升、KH2P042克/升、K2HP044克/升、Na2HPO4.12H207 克 / 升、(NH4)2SO4L 2 克 / 升、NH4Cl0.2 克 / 升、MnSO4.5H200.001 克 / 升、CoCl2.6Η200.004 克 / 升、Na2MoO4.2Η200.002 克 / 升、ZnCl20.002 克 / 升、CuSO4 *5H200.001克 / 升、H3BO40.005 克 / 升、FeSO4.7Η200.02 克 / 升、CaCl.2Η200.02 克 / 升、MgSO4.7Η200.3克/升、消泡剂0.2克/升、氨苄青霉素0.lmg/ml，用水配制。
[0030]补料培养基:甘油150ml/L、蛋白胨 30g/L、酵母粉 30g/L、MgSO4.7H205.5mg/L，余量为水。
[0031]取步骤2得到的种子液，以5%体积比的接种量接种于发酵培养基，先35°C培养4小时，然后降温至30°C继续培养3小时，然后42°C继续培养7小时。培养过程中随着菌体的生长，发酵培养基中的碳源逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧回升，此时开始流加补料培养基，流加速度由溶氧(DO)控制(设定D0=30%，当DO大于30%，打开流加泵流加补料培养基，DO逐步下降，当DO下降到30%以下流加泵关闭)，大约每小时流加26-35ml补料培养基。培养过程中用3M NaOH和10%磷酸维持pH7.2。培养过程中，通气、200rpm搅拌。
[0032]三、蛋白的复性
[0033]取5L步骤3得到的发酵体系，5000g离心10分钟，收集菌体，用PBS缓冲液(NaC1137mmol/L, KC12.7mmol/L, Na2HP044.3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L，余量为水，ρΗ8.0)洗涤并重悬，超声(Φ 10探头，超声7秒，间隔5秒)30分钟使菌体破壁，4°C、1000Og离心10分钟，收集沉淀；取沉淀，用PBS缓冲液洗涤，然后用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，2mmol/LEDTA,50mmol/L Tris *HC1,10mmol/L DTT，余量为水，ρΗ8.5)溶解沉淀，4°C、1000Og 离心 10分钟，收集上清；取上清，缓慢加入到复性缓冲液(0.5moI/LL-Arg, 2mmol/L EDTA, 20%体积比甘油，0.9mmol/L GSSG，0.lmol/L Tris.HC1，余量为水，ρΗ8.0)中，4°C静置 48 小时，然后4°C、1000Og离心20分钟，收集上清液。
[0034]四、蛋白的纯化
[0035]1、取步骤三得到的上清液，用NaOH调节pH至7.4，然后进行如下阴离子交换层析(HiTrap Q FF, GE Healthcare):以0.3ml/分钟的速度加样，然后进行洗脱(洗脱过程:初始时刻的流动相为PH7.4的PBS缓冲液，终止时刻的流动相为IM NaCl水溶液，初始时刻和终止时刻之间的流动相由PH7.4的PBS缓冲液和IM NaCl水溶液组成，初始时刻至终止时刻流动相中PH7.4的PBS缓冲液的体积分数由100%线性下降到0%，流速为Iml/分钟，当流动相中PH7.4的PBS缓冲液的体积分数为70%时，目的蛋白被有效洗脱)，洗脱过程中用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集目标洗脱峰(目标峰对应的保留体积为5mL)。
[0036]2、将步骤 1 得到的溶液过脱盐柱(HiTrap Desalting columns, GE Healthcare),从而将溶剂替换为PH7.4的PBS缓冲液，即为猪α干扰素溶液。
[0037]3、猪α干扰素溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。从凝胶中回收目标带并进行N端15个氨基酸残基的测序，如序列表的序列I自N末端第I至15位所示。结果表明，猪α干扰素溶液中含有电泳纯的猪α干扰素。
[0038]五、将载体pBV220导入大肠杆菌DH5 α，得到对照菌，用对照菌代替重组菌依次进行步骤二、步骤三和步骤四，紫外检测的过程中，没有任何洗脱峰出现。
[0039]实施例2、动物分组及干扰素活性检测
[0040]实施例中所用的稀释液均为ρΗ7.2、IOmM的PBS缓冲液。
[0041]一、将实验动物分成19组，每组13只，分别处理如下:
[0042]第一组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物I (组合物I由猪α干扰素、油包水型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.4mg/kg实验动物，油包水型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物I ;
[0043]第二组:通过肌肉注射给予组合物I (组合物I由猪α干扰素、油包水型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.4mg/kg实验动物，油包水型白油的注射剂量为
0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物I ;
[0044]第三组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物II (组合物II由猪α干扰素、水包油型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.4mg/kg实验动物，水包油型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物II ；
[0045]第四组:通过肌肉注射给予组合物II (组合物II由猪α干扰素、水包油型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.4mg/kg实验动物，水包油型白油的注射剂量为
0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物II ；
[0046]第五组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物IIK组合物III由猪α干扰素、油包水型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.016mg/kg实验动物，油包水型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物III ；
[0047]第六组:通过肌肉注射给予组合物IIK组合物III由猪α干扰素、油包水型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.016mg/kg实验动物，油包水型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物III ；
[0048]第七组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物IV (组合物IV由猪α干扰素、水包油型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.016mg/kg实验动物，水包油型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物IV ；
[0049]第八组:通过肌肉注射给予组合物IV (组合物IV由猪α干扰素、水包油型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.016mg/kg实验动物，水包油型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物IV ；
[0050]第九组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物V (组合物V由猪α干扰素、油包水型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.0016mg/kg实验动物，油包水型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物V ；
[0051]第十组:通过肌肉注射给予组合物V (组合物V由猪α干扰素、油包水型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.0016mg/kg实验动物，油包水型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物V ；
[0052]第^^一组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物VK组合物VI由猪α干扰素、水包油型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.0016mg/kg实验动物，水包油型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物VI ；
[0053]第十二组:通过肌肉注射给予组合物VK组合物VI由猪α干扰素、水包油型白油和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.0016mg/kg实验动物，水包油型白油的注射剂量为0.2mL/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物VI ；
[0054]第十三组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物νπ(组合物Vn由猪α干扰素和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.4mg/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物YD ;
[0055]第十四组:通过肌肉注射给予组合物νπ(组合物Vn由猪α干扰素和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.4mg/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物YD ；
[0056]第十五组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物VDK组合物VDI由猪α干扰素和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量 为0.016mg/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物VDI ；
[0057]第十六组:通过肌肉注射给予组合物VDK组合物VDI由猪α干扰素和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.016mg/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物珊；
[0058]第十七组:通过颈部背侧皮下注射给予组合物IX (组合物IX由猪α干扰素和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.0016mg/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物IX；
[0059]第十八组:通过肌肉注射给予组合物IX (组合物IX由猪α干扰素和稀释液组成)，猪α干扰素的注射剂量为0.0016mg/kg实验动物，每头实验动物注射4mL组合物IX;
[0060]第十九组:通过颈部背侧皮下注射给予生理盐水，每头实验动物注射4mL生理盐水。
[0061]分别于注射后第6小时、第12小时、第24小时、第36小时、第48小时、第60小时、第72小时，每组随机取3只实验动物，心脏取血，4°C过夜，然后4°C、3000rpm离心10min，取血清，-20°C保存。
[0062]二、细胞病变抑制法检测血清中干扰素活性
[0063]1、细胞铺板
[0064]取生长良好的MDBK细胞，消化，然后用含10000U/mL青霉素、10000U/mL链霉素和10% (体积比)FBS的DMEM培养基悬浮，得到细胞浓度为I X IO5个/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入96孔细胞培养板(100 μ I/孔)，然后置于37°C、含5%C02的培养箱中静置培养8h(成为单层细胞)。
[0065]2、取步骤一得到的血清，用含10% (体积比)FBS的DMEM培养基稀释至25倍体积、250倍体积、2500倍体积或25000倍体积，得到各个血清稀释液。
[0066]3、取完成步骤I的细胞培养板，弃上清；试验孔，加入步骤2得到的血清稀释液(100 μ I/孔)，每个稀释度设置3个复孔；设置3个阳性对照孔和3个阴性对照孔，加入含10% (体积比)FBS的DMEM培养基(100 μ I/孔);然后将细胞培养板置于37°C、含5%C02的培养箱中静置培养12h。
[0067]4、取VSV，用含10000U/mL青霉素、10000U/mL链霉素的DMEM培养基稀释，得到1000TCID50/mL 的病毒液(TCID5tl 针对 MDBK 细胞)。
[0068]5、取完成步骤3的细胞培养板，弃上清，用PBS洗一遍；试验孔和阳性对照孔，加入步骤4得到的病毒液(100 μ I/孔);阴性对照孔，加入含10000U/mL青霉素、10000U/mL链霉素的DMEM培养基(100 μ I/孔)；然后置于37°C、含5%C02的培养箱中静置培养24h。
[0069]6、取完成步骤5的细胞培养板，弃上清，用PBS洗一遍，进行结晶紫染色(每孔加入100 μ I结晶紫染色液,室温放置30min)和脱色(加入100 μ I脱色液,室温放置IOmin)后，用酶标仪(Thermo MULTISKAN FC)测定0D570值并记录。
[0070]7、数据处理，以能抑制50%细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算干扰素效价，即能抑制50%细胞病变的稀释倍数，方法见表1。
[0071]表1运用Reed-Muench法计算干扰素效价
[0072]