用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(BacillushaloduransXJU-1)乙醛脱氢酶.

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专利名称

用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(BacillushaloduransXJU-1)乙醛脱氢酶.
发明者

李永生, 王国庆, 赵绪光, 高秀峰
公开日

2011年1月12日
申请日期

2010年4月2日
优先权日

2010年4月2日
申请人

四川大学
文档编号

C12N15/70GK101942465SQ201010138550
关键字

嗜碱耐盐芽基因工程重组技术生产
权利要求

一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU 1)乙醛脱氢酶的方法，其特征包括如下步骤A.克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU 1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段；B.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU 1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+) aldA和pET30b(+) aldB重组载体；C.pET30b(+) aldA和pET30b(+) aldB重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌；D.表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液2.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶 aldA和aldB基因片段为克隆的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段长度分别是152 Ibp和1359bp3.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和 aldB基因片段分别与pET30b (+)表达载体重组，构成pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB 重组载体为A.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldA原始克隆的大小为1521bp，用Nde I和HindIII酶切，其酶切反应体系如下4.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB重组载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌为分别取经卡那霉素筛选，pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21 (DE3)在培养基中形成的单菌落，分别接种于含50 μ g/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37°C下振荡培养过夜；分别取Iml培养液，按OMEGA公司的质粒DNA少量提取试剂盒说明书进行操作提取质粒；.取5 μ 1质粒DNA，加入12 μ 1蒸馏水、1 μ 1缓冲液以及1 μ 1 Nde Ι、1μ1 HindIII酶混勻后置于37°C水浴中，保温2小时；同时取5μ 1质粒DNA，加入 12 μ 1蒸馏水、1 μ 1缓冲液以及1 μ 1 Nde Ι、1 μ 1 BamH I酶混勻后置于37°C水浴中，保温 2小时；将重组DNA和酶切后质粒DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源aldA和aldB基因片段，片段大小分别为1521bp和1359bp，初步确定该菌落为转化成功的工程菌；分别取卡那霉素筛选，pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21 (DE3)在培养基中形成的单菌落扩大培养后提取的质粒DNA送华大公司测序，进一步鉴定为该菌落为转化成功的工程菌5.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于表达乙醛脱氢酶的BL21 (DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液分别取pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB转化成功的工程菌1 2个菌落，接种到含50 μ g/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，于37°C，200rpmin振荡培养过夜，取200 μ 1 过夜培养物于含50 μ g/ml卡那霉素的200ml LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养2 3h，至A600约为0. 6 0. 8时，加IPTG至终浓度lmmol/L, 37°C，200rpm振荡培养，诱导表达6h ；取200ml经IPTG诱导表达的菌液，于4 °C，5，OOOg离心15min，弃液体，用0. Imol/ L pH7. 5的磷酸缓冲液洗涤细菌2 3次；加入细胞裂解缓冲液2ml及100ug/ml的溶菌酶50 μ 1，于4°C搅拌20min，使细菌悬浮，然后将细菌悬液置于冰浴中超声破碎；于4°C， 10，OOOg离心15min，收集上清液，SDS-PAGE电泳，鉴定乙醛脱氢酶adlA和aldB的表达量和亚基分子量，检测酶活性和温度、PH、金属离子的影响，测定乙醛脱氢酶adlA和aldB的Km 值；pET30b (+) -aldA转化成功的工程菌、BL21 (DE3)、转化pET30b (+)空质粒的BL21 (DE3) 活性分别是1550U/L、64U/L和82U/L，钾离子为激活剂；pET30b (+)-aldB转化成功的工程菌、BL21 (DE3)、转化 pET30b (+)空质粒的 BL21 (DE3)活性分别是 1458U/L、0U/L 和 0U/L,锌离子为激活剂；aldA和aldB的酶催化反应温度在15_40°C之间无明显变化；最适pH分别是 9. 0-9. 5和8. 0 ；乙醛脱氢酶aaldA在钾离子的条件下活性最高，而乙醛脱氢酶aldB在锌离子存在下活性最高；乙醛脱氢酶aldA和aldB的Km值分别是1. 64mmol/L和208. 23mmol/L
技术领域

本发明涉及一种用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，属于生物工程领域
背景技术

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说明书
法律状态

专利名称：用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶 ...的制作方法酒精对人体有害，尤其对肝脏最为严重，同时对胃肠道、胰腺、心脏、肾脏等也会造成不同程度的损害。世界卫生组织在一份报告中提出“酒精中毒是当今世界第一公害，其毒性可累及全身主要器官，对肝脏的影响最大。在西方国家，80%的肝硬变(liver cirrhosis)与酒精中毒有关。酒精中毒对病毒性肝炎、肝癌的发生、发展及预后都有重要影响。酒精在人体内的代谢主要靠体内的两种酶一种是乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase, ADH)；另一种是乙酸脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛，而后者则使乙醛转化为乙酸，乙酸可通过转化为乙酰辅酶A (CoA)而进入三羧酸循环，最终分解为二氧化碳和水。一般来说，人体中都存在前一种酶，而且数量基本是相等的，但缺少后一种酶的人就比较多。ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解为二氧化碳和水，而以乙醛的形式继续留在体内。目前，大量国内外的研究表明，乙醛在体内过度积累是肝损害的主要原因。因此利用上述乙醛脱氢酶的特性和功效开发有效的解酒药具有较高的应用价值和市场前景。乙醛脱氢酶可从一些动物的肝脏、胰腺等内脏进行提取，但提取过程较为复杂，成本高，不易规模化生产。
本发明的目的是开发一种利用基因工程技术生产嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，发明内容如下A.克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和 aldB基因片段；B.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b (+)表达载体重组，构成pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB重组载体；C. pET30b (+) -aldA和 pET30b (+) -aldB 重组载体转化大肠杆菌 BL21 (DE3)后，经卡那霉素筛选，获得表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌；D.表达乙醛脱氢酶的BL21 (DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液。本发明的各种特征如下1.利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1) 乙醛脱氢酶的方法，其特征在于克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段为克隆的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段长度分别是1521bp和 1359bp。2.利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1) 乙醛脱氢酶的方法，其特征在于嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b (+)表达载体重组，构成pET30b (+) -aldA和pET30b (+) -aldB重组载体方法为A.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldA原始克隆的大小为1521bp，用Nde I和HindIII酶切，其酶切反应体系如下本发明公开了一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus haloduransXJU-1)乙醛脱氢酶的方法，内容包括克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段；其基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构建pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体；重组载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，分别获得表达乙醛脱氢酶aldA和aldB的BL21(DE3)工程菌；表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液。

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