专利名称：一种具有创伤愈合作用的地龙提取物的制作方法现有研究多集中于不断体的地龙，即将冻结的蚯蚓或者鲜活蚯蚓勻浆、离心、弃去 沉淀，将上清液进行盐析后，离心得到蚯蚓粗蛋白，经分析分子量为57000、72000、87000、 18000等，通过蚯蚓组织成分对成纤维细胞增生作用的实验研究，探讨其对创伤愈合的作用 机制，以及应用其醇提物作用于NIH3T3细胞，表明其醇提液具有促进成纤维细胞生长的作 用。也有研究通过地龙对大白兔背部创伤伤口模型的收缩作用的实验，探讨地龙的促伤口 愈合作用；国外的文献报道，地龙提取液加入已受到过氧化氢伤害的成纤维细胞中，具有抗 氧化活性。但是从分子和基因水平对地龙创伤愈合作用机制的研究不多，尤其是对断体地 龙的研究未见报道。
本发明的目的在于提供一种具有创伤愈合作用的地龙提取物，本发明第二个目的 在于提供其制备方法，本发明的第三个目的在于提供其在制备具有创伤愈合作用的药物中 的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种地龙提取物，由活体地龙断体后1-20天提取得到；所述地龙提取物，优选由活体地龙断体后1-15天提取得到；所述地龙提取物，优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天后提取；所述地龙提取物，优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天后制成勻浆(镜检细 胞破碎)；所述地龙提取物，优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天后采用有机溶剂提 取；优选醇提取，进一步优选乙醇提取，乙醇浓度为为10-80% ；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天后采用三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐溶液提取；所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液PH = 7. 20-7. 26 ；其中地龙 2-6重量份，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液为4-8体积份0. 01mol/L ；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长1天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长2天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长3天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长4天后采用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长5天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长6天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长7天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长8天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长9天后采用三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长10天后采用三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长11天后采用三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长13天后采用三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长14天后采用三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐溶液提取；所述地龙提取物，最优选由活体地龙断体后在土里生长15天后采用三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐溶液提取；所述断体优选地龙近尾部切断；本发明提供一种地龙提取物的制备方法，该方法包括由活体地龙断体后1-20天 提取。所述地龙提取物的制备方法，优选由活体地龙断体后1-15天提取；所述地龙提取物的制备方法，优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天后提取；所述地龙提取物的制备方法，优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天后采用 有机溶剂提取；优选醇提取，进一步优选乙醇提取，乙醇浓度为10-80% ；所述地龙提取物的制备方法，最优选由活体地龙断体后在土里生长1-14天 后采用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液提取；所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液PH = 7. 20-7. 26 ；其中地龙2-6重量份，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液为4_8体积份0. 01mol/L ；其中，所述重量份与体积份为g/ml的关系。本发明地龙提取物，可以单独、组合或与其它任何中西药物按任意比例配伍，加入 常规辅料，按照常规工艺，制成外用制剂及口服制剂，包括胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服 液等药学上可接受的各种剂型。本发明通过实验研究了地龙断体后经过培养液养殖，采用SDS-PAGE凝胶电泳对 鲜地龙断体后不同时间点提取液进行比较分析，结果表明断体地龙提取液的蛋白条带与不 断体地龙提取液相比存在一定的差异，此外，断体地龙在修复期各个时间点提取液彼此间 的蛋白质条带也呈现一定的差异。同时，通过制备小鼠背部皮肤创伤模型，以及生理切片观察各断体地龙提取液对小鼠实验性创伤的修复作用，结果表明，断体地龙提取液能够加速 小鼠伤口愈合，其修复作用强于不断体地龙。尤其是在培养液中以断体后Mh，自然养殖下 以0-14天抽提所得的提取物效果最显著。实验例1 断体地龙的凝胶电泳分析不同时间点断体地龙提取液的制备鲜地龙用去离子水洗净后，滤纸吸干其表面水分，各称取4g左右，分别放入盛有 6mL 0. 01mol/LpH7. 2三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的培养皿中，编号0号为未断体地 龙样品，其他在冰浴条件下用刀片于地龙近尾部1/3处切断，将已断体的各份地龙重新放 回土里分别让其自由生长1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14天，编号分别为1号、2号、 3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号，10号，11号，12号，13号14号，取出各地龙样品，洗净 后称重，按质量体积比1 3(m/V)加入含0.01mol/LpH7.2三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液， 冰浴下勻浆，4°C抽提Mh，然后于4°C，10000r/min离心30min，取上清液分装于EppendafT 管中，冰箱-20°C保存。实验方法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用不连续垂直板凝胶电泳，电泳槽安装 参照文献方法。制胶用15%的分离胶，注胶高约为玻璃板高的2/3，水封，待胶凝，倒出水层。用 5 %的浓缩胶注胶至玻璃板顶部，插入样品梳，待胶凝。加样待测蛋白质样品均为6μ 1/孔(各地龙提取液取:3ul，2X上样缓冲液:3ul)， 而标准蛋白质样品则直接取6ul。所有样品离心后均于95°C水浴加热5min，冷却后离心再 上样。其中,Ml，M2，M3分别代表三种Marker (标准蛋白质)，Ml为proteinRulerllI，购自北 京全式金生物技术有限公司，它包括6种蛋白，分子量分别为25KDa，30KDa, 50KDa, 65KDa, IOOKDa, 120KDa ；M2为中分子量蛋白Marker，购自上海生工生物工程技术服务有限公司，它 包括6种蛋白，分子量分别为14. 4KDa，20KDa，31KDa，45KDa，66. 2KDa，98KDa ；M3为预染蛋 白 Marker，购自 NEW ENGLANDBiolabs (NEB 北京)，它的分子量分别为 7KDa，17KDa, 23KDa, 30KDa,46KDa,58KDa,80KDa,175KDa。电泳电泳槽中加入电极缓冲液，接通电源。浓缩胶以80V恒压电泳，待指示剂完 全进入分离胶时将电压调至120V。当指示剂前沿跑到底部时停止电泳。染色和脱色电泳结束后取出凝胶，考马斯亮蓝R-250染色液染色25min，再用脱 色液脱色直至背景清楚，在图像处理系统下将脱色的凝胶摄像。结果如图1、图2所示。由图1、图2可见，M2分离效果较好，结果表明断体地龙提取液的蛋白条带与不断 体地龙提取液相比存在一定的差异，此外，断体地龙在修复期各个时间点提取液彼此间的 蛋白质条带也呈现一定的差异。实验例2 断体地龙提取液药效学实验1创伤模型的制备小鼠为ICR小鼠，购自维通利华实验动物技术有限公司，雄性，体重规格20_22g， 自由饲养5天后试验，其体重大约在范围。小鼠用10%的水合氯醛按0. 003mL/g剂量麻醉后，脱去背部2cmX km的体毛，生 理盐水清洗干净，再用75 %酒精消毒，然后在小鼠背部脊柱两侧旁开2cm处，切除直径为 Icm的圆形全层皮肤，深度至皮下(皮肤到肌层)，但不要伤及脊柱旁或腹部肌肉上的脂肪和筋膜，小鼠脊柱左右两侧各一个伤口。术后伤口用75%酒精消毒，无菌纱布覆盖。2动物分组和伤口处理因前期实验已得出地龙提取物的溶媒0. OlM PH7. 2三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲 液与空白组比较对创伤愈合的影响无显著性差异，表明溶媒没有治疗作用，故本次试验不 再设计该组实验。小鼠造模后随机分为4组，每组6只，每组小鼠左侧伤口均滴入0.2ml的 溶媒(0.01M PH7. 2三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)作为对照，右侧伤口分别给予0号未 断体地龙样品、3号、5号、13号断体地龙样品各0. anl，几分钟后待伤口内滴入的液体吸收、 干燥后用无菌纱布包扎好，置于清洁笼内分笼饲养，给与清洁饮水，自由取食，每天换药。3检测指标(1)记录创面愈合时间。(2)记录创面愈合率于用药后1，3，5，7，10，14d后对比观察小鼠左右两侧伤 口愈合情况，测量创面面积大小，计算愈合率。愈合率=(1-现伤口面积+原伤口面 积)X100%o(3)HE染色观察创面组织另取小鼠48只，随机分为4组，每组12只，伤口模型制 备和伤口处理同上，于创伤后第3、5、7、10天，各组处死小鼠3只，将创面皮肤取下置于10% 甲醛溶液中固定，石蜡包埋，HE染色。将正常小鼠皮肤同法处理，观察比较。4结果见表1、表2，图3、4、5、6(低倍镜(物镜X 20))。表1各组创伤小鼠的创面愈合时间(5 士s，天)分组愈合时间(天)给药组对照组0号样品组
3号样品组
5号样品组 13号样品组
14.67±1.03 11.67±1.03 12.67 土 0.82 14.17 士 0.98
15.83 士 0.75 15.33 士 1.03 15.50 土 0.55 15.50±0.84由表1可见，0号、3号、5号、13号样品组的创面愈合时间均低于其自身对照组，平 均缩短1. 16 3. 66天，差异具有统计学意义(P < 0. 05或P < 0. 01)。尤其以3号样品组 比其对照组愈合时间缩短最为显著(P < 0. 01)。表2各组创伤小鼠不同时间的创面愈合率( 士s，％ )


本发明公开一种具有创伤愈合作用的地龙提取物，由活体地龙断体后提取得到，本发明地龙提取物，可以单独、组合或与其它任何中西药物按任意比例配伍，加入常规辅料，按照常规工艺，制成外用制剂及口服制剂，包括胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液等药学上可接受的各种剂型，本发明地龙提取液能够加速小鼠伤口愈合，其修复作用强于不断体地龙。