专利名称：一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用的制作方法癌症是一种非常古老的疾病，伴随着整个人类发展的历史，严重威胁着人类的健康与生命。棘霉素(Echinomycin)自1998年以来就一直作为一种抗肿瘤药物在进行II期临床试验。棘霉素是一个DNA双插入试剂，能够与肿瘤细胞的DNA发生相互作用从而抑制其复制和转录。棘霉素还涉及对细胞凋亡的促进作用。除了抗肿瘤作用外，棘霉素对许多病原微生物也具有显著的抑制作用，如结核分枝杆菌、炭疽杆菌等。除了长期被作为一种抗肿瘤抗生素进行研究外，近年来，棘霉素的抗微生物活性和发色团的荧光性质也逐渐引起人们的关注，利用其喹喔啉环发色团在插入双链DNA后能引起电信号发生变化的性质，可用来研制电化学DNA传感器，用于鉴别单链和双链DNA。另外，棘霉素还有望作为一种高灵敏度和专一性的DNA荧光探针，用于与核酸分子成像有关的研究。
本发明的目的是提供一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用。本发明提供的链霉菌(Sti^ptomyces sp. )LS462，已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. M53。本发明还保护所述链霉菌LS462在生产棘霉素中的应用。本发明还保护一种种子培养基，是通过如下方法制备得到的培养基将20_30g可溶性淀粉、0. 2-0. 6gL-天冬酰胺、0. 5-1. Og ΚΝ03、0· 2-0. 6g K2HPO4 · H20,0. 2-0. 6gNaCl 和 0.2-1. Og MgSO4 ·7Η20用水定容至1L。所述种子培养基的pH可为7. 0_7. 5。所述种子培养基具体可通过如下方法制备得到将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KN03、0.4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 用水定容至 IL0本发明还保护一种发酵培养基，是通过如下方法制备得到的培养基将5_15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3_(N_吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。所述发酵培养基的PH可为7. 0-7. 5。所述发酵培养基培养基具体可通过如下方法制备得到 将IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。本发明还保护一种制备棘霉素的方法，是发酵所述链霉菌LS462，得到棘霉素。所述发酵的条件具体可为25-30°C、140-200rpm、6-15天。所述发酵的条件具体可为^°C、 180rpm、10 天。所述方法具体可包括如下步骤将所述链霉菌LS462的种子液接种至所述发酵培养基中发酵并收获发酵液。所述方法中，可将5ml所述种子液接种至IOOml所述发酵培养基中。所述种子液具体可通过如下方法制备将所述链霉菌LS462接种于所述种子培养基中，25-30°C (如 280C )、140-200rpm(如180rpm)培养2-6天(如96小时)，得到种子液。所述方法还可包括如下步骤(1)将所述发酵液离心(离心参数具体可为4°C、8000转/min、15min)，分别收集上清液和沉淀；(2)将步骤(1)获得的沉淀用丙酮浸提(可室温静置10小时)，离心(离心参数具体可为4°C、8000转/min、15min)并收集上清液；(3)将步骤(1)的上清液和步骤( 的上清液合并，即为棘霉素粗提液(菌株粗提液)；(4)将所述棘霉素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为40% 和60%的丙酮水溶液洗脱(各一升)，收集用60%丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液；(5)将步骤(4)收集的过柱后洗脱液蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相 HPLC ；反相HPLC参数采用 Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；流动相为体积百分比为70%的甲醇水溶液，流速为2. Oml/min ；收集保留时间为26. 3-27. 2min的过柱后洗脱液，蒸干后得到棘霉素。本发明提供的链霉菌LS462在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其棘霉素的产量可达61. 8aiig/l，高于目前已见报道的棘霉素生产菌株的产量。本发明所提供的生产棘霉素的方法是发酵链霉菌LS462，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。图1为菌株LS462在斜面培养基上培养20天的照片。图2为菌株LS462在扫描电镜(Quanta 200) 10000X下观察的照片。图3为菌株粗提液的HPLC分析图。图4为活性组分的ESI-MS质谱图。图5为活性组份的紫外光谱图。

菌株分离培养基的组成如下(以下均为质量百分比)淀粉2%、L-天冬素 0. 05%,KNO3 0.1%,K2HPO4 · H2O 0. 05%,NaCl 0. 05%,MgSO4 · 7H20 0. 05%,CaCO3 0.1%, 琼月旨1.8%和吐0 ；pH值为7.5。取1. Og 土样(采自中国江西瑶里原始森林的泥土样品)，放入装有9. Oml无菌水的50ml离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声2min ；取1. Oml悬浊液，放入装有 9. Oml无菌水的50ml离心管中，混勻；取1. Oml悬浊液，放入装有9. Oml无菌水的50ml离心管中，混勻；系列稀释10_3和10_4 ；盖紧管盖，于100°C保温lh，取0. 2ml涂板。获得了一株菌，将其命名为菌株LS462。菌株LS462的保藏方法于25%甘油冻存管_80°C保藏。二、链霉菌LS462的鉴定菌株LS462在斜面培养基上培养20天的照片见图1。菌株LS462在扫描电镜 (Quanta 200) 10000X下观察的照片见图2。在斜面培养基上培养20天产生卵圆形孢子， 表面刺状，大小均勻(0. 5-0. 7μπιΧ1. 1-1.3μπι)。气生菌丝呈棕色，表面光滑，基内菌丝呈棕色，有棕色色素产生。根据菌落形态特征，将菌株LS462鉴定为链霉菌。链霉菌(Sti^ptomyces sp. )LS462已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. M53。实施例2、应用链霉菌LS462生产棘霉素斜面培养基的制备方法如下(pH7. 0)将2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl,0. 6g MgS04 · 7H20 和 18g 琼脂溶于水并用水定容至 IL0种子培养基的制备方法如下(pH7. 5)将2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 溶于水并用水定容至 IL0发酵培养基的制备方法如下(pH7. 0)将IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和 20g MOPS溶于水并用水定容至1L。一、菌株发酵1、种子培养(1)将链霉菌LS462的孢子接种于斜面培养基，28°C培养8天(到气生菌丝丰满)， 即得到斜面菌种。(2)在500ml玻璃瓶中装入IOOml种子培养基。(3)从步骤(1)的斜面挖块接种至步骤O)的培养基，280C、ISOrpm培养96小时， 得到种子液。2、发酵培养(1)在500ml的三角瓶中装IOOml发酵培养基。(2)在步骤(1)的培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，、ISOrpm培养10 天，收获发酵液(发酵液为容器内的所有物质)。二、有效成分的分离纯化1、将1升步骤一得到的发酵液4°C条件下离心15min(8000转/min)，分别收集上清液和沉淀(菌体)。
2、将步骤1获得的菌体用350mL丙酮室温条件下浸泡过夜(约10小时)，4°C条件下离心15min (8000转/min)，收集上清液。3、将步骤1的上清液和步骤2的上清液合并，即为棘霉素粗提液(菌株粗提液)。4、将50ml棘霉素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，用100%丙酮洗脱，浓缩洗脱液，并进行HPLC分析。HPLC 参数Agilent Zorbax XDB C_8column(5 μ m，4. 6X 150mm)；体积百分比为 70%的甲醇水溶液为流动相，流速为1. Oml/min ；检测波长为2Mnm。HPLC图谱见图3。主要活性成分的保留时间约为7. 32min。5、将步骤3得到的菌株粗提液(约1300ml)上样于300ml HP-20大孔吸附树脂， 先用800ml水洗脱，然后依次用体积百分比为40%、60%和80%的丙酮水溶液(各1升) 洗脱，收集用60%丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液(约1升)。6、将步骤5收集的过柱后洗脱液通过旋转蒸发仪除去丙酮并蒸干，用5mL丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC。反相HPLC参数Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；体积百分比为70%的甲醇水溶液为流动相，流速为2. Oml/min ；检测波长为2Mnm。收集保留时间为26. 3-27. 2min的过柱后洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分(每升步骤一得到的发酵液中含有61. 82mg活性组分)。三、有效成分的鉴定1、外观白色粉末。2、溶解性易溶于氯仿、DMS0,微溶于丙酮、甲醇，不溶于水。3、质谱ESI-MS质谱见图4，检测其分子离子峰[M+H]+为1101. 3，_a]+为1123. 3。与文献报道棘霉素的结果一致。4、紫外光谱紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304 instrument。
活性组份的紫外光谱图见图5，在204nm、M3. Onm和323nm处有最大吸收峰。与文献报道棘霉素紫外特征一致。5.核磁图谱碳信号归属核磁图谱测试仪器为Varian Inova 600MHz，所用溶剂为DMS0_d6。活性组分碳々 号归属如表1所示。与文献报道一致。表1活性组份的碳谱核磁信号归属
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本发明公开了一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用。本发明提供的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)LS462，它的保藏编号为CGMCC No.5453。本发明提供的链霉菌LS462在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其棘霉素的产量可达61.82mg/l，高于目前已见报道的棘霉素生产菌株的产量。本发明所提供的生产棘霉素的方法是发酵链霉菌LS462，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。