富勒烯赖氨酸衍生物及其制备方法和防辐射用途制作方法_崔建国专利（富勒烯,赖氨酸,衍生物）-早鸽网

富勒烯赖氨酸衍生物及其制备方法和防辐射用途制作方法

专利名称

富勒烯赖氨酸衍生物及其制备方法和防辐射用途制作方法
发明者

崔建国, 张超, 李百龙, 梅柯, 蔡建明, 高福, 黄越承
公开日

2012年9月26日
申请日期

2011年3月24日
优先权日

2011年3月24日
申请人

中国人民解放军第二军医大学
文档编号

A61P17/16GK102688225SQ20111007196
关键字

富勒烯赖氨酸衍生物
权利要求

1.富勒烯赖氨酸衍生物C6tl-Iys在制备辐射损伤防护药物中的应用，所说富勒烯赖氨酸衍生物分子式为 C60 (HNCH2CH2CH2CH2CH (NH2) COONa) 6 (H)60
技术领域

本发明涉及医药技术领域，是富勒烯赖氨酸衍生物(C6tl-Iys)及其制备方法和防辐射损伤用途
背景技术
具体实施例方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述实施例I制备富勒烯赖氨酸衍生物C6tl-Iys合成方程式H2N (CH2) 4CH (NH2) COOH+NaOH+C60 — C60 (HNCH2CH2CH2CH2CH (NH2) COONa) 6 (H) 6制备步骤I.制备富勒烯甲苯溶液将IlOmg富勒烯溶于70mL甲苯中，搅拌使其完全溶解，得富勒烯甲苯溶液，液体为紫罗兰色；2.制备赖氨酸溶液将5. 6g赖氨酸和I. 7gNa0H溶于6mL水中，加入40mL无水こ醇,搅拌使其完全溶解，得赖氨酸溶液；3.制备 C60-IysI)将富勒烯甲苯溶液慢慢滴加入赖氨酸溶液中，室温搅拌24h后静置分层，分层后上层有机相近无色，下层水醇混合相棕黑色，用分液漏斗分出水醇混合相；2)用甲苯分两次萃取以去除水醇混合相中的微量的C6tl ；3)用旋转蒸发仪减压浓缩，得黒色粘稠固体；4)加3mL水使黑色粘稠固体完全溶解，再加40mL无水こ醇，振荡得棕色沙状沉淀；5)过滤，沉淀用无水こ醇洗两遍，真空干燥得棕黑色固体粉末，即为C6(|-lyS实施例2 C60-Iys的NMR核磁波谱分析以氘代水D2O为溶剂，用Bruker Avance 600NMR谱仪测试C6tl-Iys衍生物的1H NMR谱(图I)从图I可见，2. 95ppm出现的多重峰为-CH2-(a)的吸收峰，I. 67ppm出现的多重峰为-CH2-(b)的吸收峰，I. 42ppm出现的多重峰为-CH2-(C)的吸收峰，I. 75ppm出现的多重峰为-CH2-(d)的吸收峰，3. 48ppm出现的多重峰为-CH2-(e)的吸收峰由于以D2O为溶剤，1H NMR谱中看不到O-H和N-H的核磁共振峰(0-H和N-H上氢与溶剂D2O交换速度非常快，观察不到信号)图2为该产物的碳谱，从图2可见，179. 87ppm为羰基碳的信号(-C00-)，56. 59ppm 为-CH- (e)的信号，40. 78ppm 为-CH2- (a)的信号，33. 22ppm 为-CH2- (d)的信号，28.28ppm为-CH2-(b)的信号，23. 23ppm为-CH2-(c)的信号C6tl-Iys衍生物的氢谱和碳谱与赖氨酸的氢谱和碳谱相比对，均出现一定程度的变化，提示赖氨酸与C6tl发生反应，且氢谱显示无明显干扰信号，所得产物纯度较高实施例3 C60-Iys的FTIR分析(傅里叶变换红外光谱)分析采用Bruker Vector 22型FTIR红外光谱仪对产物进行了分析Fig. 6为赖氨酸的红外吸收光谱图3412. 9cm-l处对应于N-H伸缩振动吸收峰，2999. 9cm_l附近峰为O-H拉伸振动峰，1583. 9cm-1处出现吸收峰为C = O伸缩振动峰，1400. 2cm_l、1101. 3cm-1等处为C-N的伸缩振动峰、899. Ocm-I、849. 5cm_l等处为伯胺(-NH2)吸收峰图3为C6与赖氨酸直接反应所得产物的红外吸收光谱图3352. Ocm-I处对应于伯胺N-H伸展振动吸收峰，2925. 8cm-l处对应于仲胺N-H伸展振动吸收峰，2853. 9cm-1处为C-H伸展振动峰， 1577. 3cm-l处为离子化羧基-C00-振动峰，1454. 7cm_l、638. Icm-I等处为C60的特征吸收峰，1118. 8cm-l处为非共轭C-N伸展振动峰，864. 7cm_l、825. 3cm_l等处为伯胺吸收峰556. 6cm-l吸收峰是取代C6tl的标志实施例4 C60-Iys对AHH-I的细胞毒性实验取对数生长期的AHH-I细胞，种于96孔板，每孔体积100 μ 1，加富勒烯赖氨酸衍生物C6tl-Iys至终浓度分别0、200、400、800、1200、16001^/し孵育48h用CCK-8检测，并计算细胞存活率从图4可以看出，在0-1200mg/L范围内，各给药组AHH-I细胞存活率均无显著差别(P > O. 05)当C6tl-Iys浓度为1600mg/L吋，AHH-I细胞存活率均明显下降，为80. 4% (P < O. 01)实施例5 C60-Iys对AHH-I细胞的辐射防护实验取对数生长期的AHH-I细胞，种于24孔板，每孔体积1ml，AHH-I细胞照射剂量为4Gy,照前Ih加入C6tl-Iys,终浓度分别0、50、100、200、400、800mg/L，照后转移到96孔板中，每孔100μ 1，孵育24h用CCK-8检测，并计算细胞存活率从图5可以看出，在0-800mg/L范围内，随着药物浓度的増加AHH-I细胞存活率均有所上升，与单纯照射组相比有显著的差异(P < O. 05)C6tl-Iys对AHH-I的最佳辐射防护剂量为800mg/L实施例6使用800mg/LC6(|-lys处理AHH-I细胞后用不同剂量照，其存活率变化分别取对数生长期的AHH-I细胞，种于24孔板，每孔体积1ml，照后转移到96孔板中，每孔100 μ 1，按照实验要求设立各个单纯照射组，不同照射剂量给药组，孵育24h用CCK-8检测，并计算细胞存活率从图6中可以看出，AHH-I细胞存活率均随照射剂量增加而下降，照射剂量为4Gy吋，AHH-I细胞存活率为58. 5%照射剂量为40Gy时，从图中还可以看出，照前加入C6tl-Iys,终浓度为800mg/L的AHH-I细胞，随着照射剂量的増加，细胞存活率也都依次下降但照射给药组细胞存活率都明显高于单纯照射组细胞存活率，有统计学差异(P < O. 01)，说明富C6tl-Iys对AHH-I细胞有一定辐射防护作用

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专利名称：富勒烯赖氨酸衍生物及其制备方法和防辐射用途的制作方法富勒烯(fullerene, C60),又名球烯，它是由Kroto等1985年在研究激光蒸发石墨的过程中首先发现的。1990年克拉希姆(W. Kratschmer)等发明了合成克量级C6tl的方法以来，使宏观量制备C6tl成为可能。由于C6tl独特的结构，赋予了其独特的物理化学性质。已有研究发现其在清除自由基、光动力学治疗、抑制HIV病毒、抗菌、神经保护和作为药物载体等方面有着独特的作用。迄今为止，C6tl的研究已经涉及到物理、化学、材料科学以及生命科学等众多学科及相关应用领域，并显示出越来越大的潜力。但是由于C6tl水溶性很低，阻碍了其在生物学上的应用。富勒烯赖氨酸衍生物(C6tl-Iys)是ー种主要含有C6tl的化合物，其水溶性较好，同时具备有C6tl的一系列结构特点和生物活性，已有文献报道C6tl-Iys在免疫调节(Hsu H, ChiangL, Chen J, et al, Water-Soluble Hexasulfobutyl Fullereneinhibits PiasmaLipid Peroxidation by Direct Association with Lipoproteins.Journal ofCardiovascular Pharmacology. 2000,36(4) :423-427)、肿瘤治疗(Hu Z，Guan W, Wang W, et al, Synthesis of b—alanine C60 derivative and itsprotectiveeffect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in ratpheochromocytoma cells，Cell Biology International. 2007，31 :798-804)、抗感染(Mashino T，Shimotohno K，Ikegami N，et al. Human immunodeficiency virus-reverse transcriptase inhioitionand hepatitis Cvirus RNA—dependent RNA polymerase inhibition activities offulIerenederivatives,Bioorg Med Chem Lett. 2005,15 (4) :1107-1109)等方面得到了应用。但至今未见有关C6crIys在辐射损伤防护方面的应用报道。所以我们将合成C6crIys,并对其表征进行初步鉴定后，将C6crIys应用于辐射防护中研究。
本发明的目的在于提供C6tl-Iys的防辐射效应的新用途。C6tl-Iys分子式如下Ceo(HNCH2CH2OH^CH^CHrNH2)COONa)6(H)6 I I I I !本发明人在实验中发现C6tl与赖氨酸直接反应后，通过萃取、层析等方法提纯，等到水溶性很高的C6(l-lys。通过对C6tl-Iys的细胞毒性进行研究，发现C6tl-Iys在浓度低于1200mg/L时对人淋巴瘤母细胞(AHH-I)基本没有毒性。而在浓度为1600mg/L时，细胞毒性増加，能降低细胞存活率；但在安全浓度范围内，其对细胞具有辐射防护效应，其中800mg/L为C6tl-Iys辐射防护的最佳剂量，其能最大限度地提高照射后AHH-I细胞的存活率，减少细胞的凋亡，对细胞起辐射防护作用。此外，C60-Iys能降低辐射引起的AHH-I细胞的G2/M期阻滞，能减少辐射对AHH-I细胞的DNA损伤。本发明C6tl-Iys合成方法简单，可以进行大規模エ业化生产，制备辐射损伤防护药物。图IC6tl-Iys 在 D2O 频率 ^OOMHz)的 1H-NMR 谱。图2C6(|-lys 在 D2O 频率(600MHz)的 13C-NMR 谱。图3C6Q-lys的红外光谱。图4细胞毒性试验用C6tl-Iys处理后AHH-I细胞存活率曲线图。图5用不同浓度C6tl-Iys处理AHH-I细胞暴露于4Gy24h后存活率。图6用800mg/L的C6tl-Iys处理AHH-I细胞给予不同剂量照射，照后24h通过CCK8检测其存活率。

本发明涉及医药技术领域，是富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys及其制备方法和防辐射损伤用途。富勒烯赖氨酸衍生物分子式为C60(HNCH2CH2CH2CH2CH(NH2)COONa)6(H)6。经C60-lys对AHH-1的细胞毒性实验和辐射防护实验，其在浓度低于1200mg/L时对人淋巴瘤母细胞AHH-1基本没有毒性，在安全浓度范围内，其对细胞具有辐射防护效应，其中800mg/L为C60-lys辐射防护的最佳剂量，因此，C60-lys可用于制备辐射损伤防护药物。本发明C60-lys合成方法简单，可以通过进行大规模工业化生产来制备辐射损伤防护药物。

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