专利名称：用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸的制作方法 ω-3长链多不饱和脂肪酸现在被公认为是与人类及动物健康相关的重要化合物。可以从饮食来源中直接获得这些脂肪酸，或者通过转化亚油酸(LA，ω-6)或α亚麻酸(ALA，ω-3)等脂肪酸可以获得这些脂肪酸，这两种脂肪酸都被认为是人类饮食中的必需脂肪酸。虽然人类和多种其他的脊椎动物都能将来自于植物来源的LA或ALA转化成LC-PUFA，但是它们只能以非常低的效率进行这种转化。此外，绝大多数现代社会都有着失衡的饮食，其中至少90％的多不饱和脂肪酸是由ω-6脂肪酸组成，而不是4∶1或更低的ω-6∶ω-3比例，该比例被认为是理想的比例(Trautwein，2001)。人类的LC-PUFA例如二十碳五烯酸(EPA，20∶5)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6)的直接饮食来源绝大多数都来自于鱼或鱼油。专业保健人员因此推荐在人体饮食中常规地包括含有非常高水平LC-PUFA的鱼。鱼类来源的LC-PUFA油越来越多地被组合到食品中并且被用于婴儿配方。但是，因为全球和全国渔业的衰退，需要这些有益的强化健康的油的其他来源。在人类饮食中包含ω-3 LC-PUFA例如EPA和DHA已经与许多种健康相关益处有关。这些益处包括预防或减少冠状动脉疾病、高血压、2型糖尿病、肾脏疾病、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎和慢性阻塞性肺病，以及有助于脑部发育和生长(Simopoulos，2000)。最近，多个研究也已经表明ω-3 PUFA可以有益于婴儿营养和发育，以及有益于抗各种精神病例如精神分裂症、注意力缺陷多动症和Alzheimer病。与动物相反，高等植物缺少合成链长大于18个碳的多不饱和脂肪酸的能力。具体地，农作物和园艺植物与其他的被子植物都不具有合成源自ALA的长链ω-3脂肪酸例如EPA、DPA和DHA所需的酶。植物生物技术学的一个重要目标因此是遗传工程化产大量LC-PUFA的农作物植物，特别是油籽农作物，据此提供了这些化合物的其他来源。LC-PUFA合成的途径通过如图1中图解所示的一系列交替的氧依赖性的去饱和反应和延长反应可以使得在生物体(例如微藻类、苔藓和真菌)体内发生从亚油酸和α亚麻酸脂肪酸向LC-PUFA的生物合成。在一种途径(图1，II)中，由Δ6、Δ5和Δ4去饱和酶催化去饱和反应，每种酶都给脂肪酸碳链增加一个额外双键，而每个Δ6和Δ5延长反应都添加一个二碳单位，以延长碳链。因此这些生物体中的ALA向DHA的转化要求三个去饱和反应和两个延长反应。已经从各种微生物和低等植物例如微藻类、苔藓和真菌中克隆出编码在该需氧途径中生产DHA所需的酶的基因。已经从脊椎动物包括哺乳动物中分离出编码其中一些酶(包括催化第五个步骤的酶，Δ5延长酶)的基因(Sayanova and Napier综述，2004)。但是，从人类细胞中分离到的Δ5延长酶并非特异于EPA到DPA的反应，其对脂肪酸底物具有广泛的特异性(Leonard et al.，2002)。在一些生物体中，已经显示出存在着ALA到DHA途径的两个部分的其他途径。在某些原生生物和破囊壶菌(thraustochytrids)中，通过Δ9延长酶和Δ8去饱和酶的组合(所谓的Δ8去饱和途径，见图1，IV)可以实现ALA向ETA的转化，如分离到编码这些酶的基因所证实的那样(Wallisand Browse，1999；Qi et al.，2002)。在哺乳动物中，所谓的“Sprecher”途径可以通过不依赖Δ4去饱和酶的三个反应将DPA转化成DHA(Sprecheret al.，1995)。除了这些去饱和酶/延长酶系统外，通过多种生物体例如Shewanella、Mortiella、和Schizhochytrium中的厌氧途径也可以合成EPA和DHA(Abbadi et al.，2001)。已经从一些细菌中克隆出编码这些聚酮化合物合酶(PKS)酶复合体的操纵子(Morita et al.，2000；Metz et al.，2001；Tanaka etal.，1999；Yazawa，1996；Yu et al.，2000；WO 00/42195)。已经在Synechococcus中表达从Shewanella spp中分离到的EPA PKS操纵子，以便容许其合成EPA(Takeyama et al.，1997)。编码这些酶的基因排列于相当大的操纵子上，还没有报道它们在转基因植物中的表达。因此，仍然需要研究厌氧的PKS样系统对于转基因合成LC-PUFA是否是更为经典的需氧的去饱和酶/延长酶的可能的替代系统。去饱和酶已经显示出参与LC-PUFA的去饱和酶都属于一组所谓的“前端”去饱和酶，它们的特点是在每种蛋白的N末端都具有细胞色素b5结构域。细胞色素b5可能作为去饱和作用所需的电子的受体(Napier et al.，1999；Sperling and Heinz，2001)。Δ5去饱和酶催化C20 LC-PUFA的更多的去饱和作用，导致产生了花生四烯酸(ARA，20:4ω6)和EPA(20:5ω3)。已经从多种生物体中分离出编码这个酶的基因，生物体包括藻类(破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)Qiuet al.，2001)、真菌(M.alpine、畸雌腐霉(Pythium irregulare)，Michaelsonet al.，1998；Hong et al.，2002)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和哺乳动物。也已经从斑马鱼中鉴定出编码双功能Δ5/Δ6去饱和酶的基因(Hasting et al.，2001)。编码这种酶的基因可能代表“前端去饱和酶”的祖先形式，之后其复制并进化出不同的功能。生产DHA的最后的去饱和步骤是由Δ4去饱和酶催化的，已经从淡水原生生物物种纤细眼虫(Euglenagracilis)和海洋物种破囊壶菌中分离出编码这个酶的基因(Qiu et al.，2001；Meyer et al.，2003)。
延长酶已经分离出一些编码PUFA延长酶的基因(Sayanova and Napier，2004)。该基因家族的成员与高等植物体内的涉及饱和和单不饱和脂肪酸的延长的延长酶基因(例如拟南芥属(Arabidopsis)的FAE1)无关。后者的实例是芸苔属(Brassicas)中的芥酸(22∶1)。在一些原始生物物种中，通过在用Δ8去饱和酶进行去饱和(图1，IV部分；“Δ8去饱和”途径)之前，用C2单位延长亚油酸或α亚麻酸可以合成LC-PUFA。在这些物种中没有检测到Δ6去饱和酶和Δ6延长酶活性。取而代之的是，在这些生物体中检测到了Δ9延长酶活性，支持这一点的是，最近已经从球等鞭金藻(Isochrysis galbana)中分离出了C18Δ9延长酶(Qi et al.，2002)。
LC-PUFA的遗传工程化生产已经提议将通过插入这些基因而被遗传工程化为生产主要LC-PUFA的转基因油籽作物作为营养重要的脂肪酸的恒定来源。但是，由于需要可能来自不同来源的基因所编码的五种新酶的协同表达及活性，这一直使得这个目标难以实现，该提议至今仍是一种推测。
通过共表达Δ6延长酶和Δ6及Δ5脂肪酸去饱和酶已经成功地在酵母中构建出产生EPA的LC-PUFA氧依赖性生物合成的途径(图1)，造成了由外源供应的亚油酸和α亚麻酸所产生的ARA及EPA的少量的但显著的蓄积(Beaudoin et al.，2000；Zank et al.，2000)。这表明从属于LC-PUFA合成途径的基因能在异种生物体中发挥作用。但是，产生EPA的效率是非常低的。例如，在酵母中表达了来自秀丽隐杆线虫、琉璃苣(Boragoofficinalis)和高山被孢霉(Mortierella alpina)的三种基因(Beaudoin et al.，2000)。当给转化酵母供应18:2ω-3(LA)或18:3ω-3(ALA)时，只产生了少量的20:4ω-6或20:5ω-3，转化效率分别是0.65％和0.3％。其他研究者通过在酵母中应用表达两种去饱和酶和一种延长酶的基因，同样获得了非常低效率的EPA的产生(Domergue et al.，2003a；Zank et al.，2002)。因此，仍需要提高在生物体例如酵母中产生EPA的效率，使得能单独地产生需要提供附加的酶步骤的C22 PUFA。
在探索将需氧的LC-PUFA生物合成途径引入到高等植物(包括油籽作物)内的研究中已经取得了一些进步(综述，Sayanova and Napier，2004；Drexler et al.，2003；Abbadi et al.，2001)。在转基因的烟草和拟南芥属中表达从琉璃苣中分离到的编码Δ6脂肪酸去饱和酶的基因，使得在转基因植物中产生了GLA(18:3ω6)和SDA(18:4ω3)，它们是LC-PUFA的直接前体(Sayanova et al.，1997；1999)。但是，这仅仅提供了单个第一步骤。
Domergue等(2003a)在酵母和转基因亚麻子中使用了三种编码Δ6-和Δ5-脂肪酸去饱和酶及Δ6-延长酶的基因的组合。去饱和酶基因来自于硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，以及延长酶基因来自于苔藓小立碗藓(Physcomitrella patens)。对于酵母细胞内源性产生的Δ6-脂肪酸，只获得了较低的延长产率(即组合第一个和第二个酶步骤)，所形成的主要C20 PUFA产物是20:2Δ11，14，代表着不需要的副反应。Domergue等(2003a)也声称(没有显示数据)在转基因亚麻中表达三种基因的组合，随后产生了ARA和EPA，但是生产是无效率的。他们认为在高等植物的种子中存在着如在酵母中观察到的相同问题，以及需要解决在油籽作物中产生LC-PUFA的“瓶颈”。
WO 2004/071467(DuPont)报道了各种去饱和酶和延长酶在大豆细胞中的表达，但是没有显示DHA在重组植物或种子中的合成。
Abbadi等(2004)描述了在转基因亚麻中表达去饱和酶和延长酶的组合的尝试，但是只获得了低水平的EPA的合成。
Abbadi等(2004)表明他们的低水平的EPA的产生也是因为未知的“瓶颈”。
Qi等(2004)在叶中实现了合成，但是没有报道在种子中的结果。这是一个重要的问题，因为LC-PUFA合成的性能在叶和种子之间可以有所不同。具体地，油籽种子在种子中所储存的脂质大多数都是TAG，而叶合成的脂质大多数都是磷脂酰脂。此外，Qi等(2004)只产生了AA和EPA。
因此，需要更多的在重组细胞中产生长链多不饱和脂肪酸(特别是EPA、DPA和DHA)的方法。


在第一方面，本发明提供了能合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的重组细胞，包括一种或多种编码至少两种酶的多核苷酸，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、Δ4去饱和酶、Δ9延长酶、或Δ8去饱和酶，其中所述一种或多种多核苷酸与能指导所述多核苷酸在细胞内表达的一种或多种启动子可操纵地连接，其中所述重组细胞衍生自不能合成所述LC-PUFA的细胞。
在第二个方面，本发明提供了相对于等基因非重组细胞具有增强的合成LC-PUFA的能力的重组细胞，包括一种或多种编码至少两种酶的多核苷酸，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、Δ4去饱和酶、Δ9延长酶、或Δ8去饱和酶，其中所述一种或多种多核苷酸与使得能在所述重组细胞内表达所述多核苷酸的一种或多种启动子可操纵地连接。
在一个实施方式中，至少一种酶是Δ5延长酶。
本发明者首次鉴定出具有比Δ6延长酶活性更高的Δ5延长酶活性的酶。因此，该酶提供了一种在重组细胞中产生DPA的有效方法，因为EPA的Δ5延长要优于SDA的Δ6延长。因此，在一种实施方式中，Δ5延长酶是相对特异的，即Δ5延长酶也具有Δ6延长酶活性，延长酶在从EPA合成DPA中比其在从SDA合成ETA中更为有效。
在另一个实施方式中，Δ5延长酶包括i)如SEQ ID NO2所提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO2具有至少50％、更优选的至少80％、甚至更优选的至少90％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
在另一个实施方式中，Δ5延长酶可纯化自藻类。
在另一个实施方式中，其中至少一种酶是Δ9延长酶。
本发明者首次鉴定出具有Δ9延长酶活性和Δ6延长酶活性的酶。当该酶在具有Δ6去饱和酶和Δ8去饱和酶的细胞内表达时，该酶利用两种可行途径从ALA产生ETA，从LA产生DGLA、或两者(见图1)，因此增加了ETA和/或DGLA产生的效率。因此，在一个实施方式中，Δ9延长酶也具有Δ6延长酶活性。优选地，Δ9延长酶在从ALA合成ETrA中比其在从SDA合成ETA中更为有效。此外，在另一个实施方式中，在酵母细胞中，Δ9延长酶能将SDA延长为ETA、将GLA延长为DGLA，或两者均可。
在另一个实施方式中，Δ9延长酶包括i)如SEQ ID NO3、SEQ ID NO85或SEQ ID NO86所提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO3、SEQ ID NO85或SEQ ID NO86具有至少50％、更优选的至少80％、甚至更优选的至少90％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
优选地，可以从藻类或真菌中纯化出Δ9延长酶。
本领域公知的是，生物体中的转基因的数目越多，损害生物体的至少一种适应性参数的可能性就越大，所述适应性参数是例如至少一种转基因的表达水平、生长速度、油籽产生、繁殖能力等。因此，需要将重组细胞中的转基因的数目最小化。至今为止，本发明者已经提出了多种在细胞中产生LC-PUFA的策略，这些策略避免了相关途径中的每一步骤都对应于一个基因的需要。
因此，在另一个实施方式中，至少其中一种酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶或Δ5/Δ6双功能延长酶。用淡水鱼种可以天然地产生Δ5/Δ6双功能去饱和酶。
在一个

中，Δ5/Δ6双功能去饱和酶包括i)如SEQ ID NO15所提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO15具有至少50％、更优选的至少80％、甚至更优选的至少90％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
优选地，用淡水鱼种可以天然地产生Δ5/Δ6双功能去饱和酶。
优选地，Δ5/Δ6双功能延长酶包括i)如SEQ ID NO2或SEQ ID NO14所提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO2或SEQ ID NO14具有至少50％、更优选的至少80％、甚至更优选的至少90％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
在另一个实施方式中，至少其中一种酶是Δ5去饱和酶。
在进一步的实施方式中，至少其中一种酶是Δ8去饱和酶。
在另一个实施方式中，LC-PUFA是二十二碳六烯酸(DHA)。
优选地，所引入的多核苷酸编码三种或四种酶，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、或Δ4去饱和酶。更优选地，所述酶是如下组合中的任一组合i)Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶和Δ4去饱和酶；
ii)Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶和Δ4去饱和酶；或iii)Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、和Δ4去饱和酶。
在另一个实施方式中，LC-PUFA是DHA，以及所引入的多核苷酸编码五种酶，其中酶是如下组合中的任一组合i)Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6延长酶；或ii)Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ5延长酶和Δ9延长酶。
在进一步的实施方式中，细胞是适合于发酵的生物体，酶是至少一种Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、和Δ4去饱和酶。
在另一个实施方式中，LC-PUFA是二十二碳五烯酸(DPA)。
优选地，所引入的多核苷酸编码两种或三种酶，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、或Δ6延长酶。更优选的，酶是如下组合中的任一组合i)Δ5/Δ6双功能去饱和酶和Δ5/Δ6双功能延长酶；ii) Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5延长酶、和Δ6延长酶；或iii)Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶。
在进一步的实施方式中，LC-PUFA是DPA，以及所引入的多核苷酸编码四种酶，其中酶是下面任一的组合i)Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6延长酶；或ii)Δ5去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ5延长酶和Δ9延长酶。
在另一个实施方式中，细胞是适合于发酵的生物体，且所述酶至少是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6延长酶。
在进一步的实施方式中，LC-PUFA是二十碳五烯酸(EPA)。
优选地，所引入的多核苷酸编码Δ5/Δ6双功能去饱和酶和Δ5/Δ6双功能延长酶。
在另一个实施方式中，所引入的多核苷酸编码三种酶，其中酶是如下组合中的任一组合i)Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶和Δ6延长酶；或ii)Δ5去饱和酶、Δ8去饱和酶和Δ9延长酶。
至今为止的事实表明在至少一些重组细胞(特别是酵母)中所表达的去饱和酶具有相当低的活性。但是，本发明者已经鉴定出酶活性可能是去饱和酶在LC-PUFA合成中利用脂酰辅酶A作为底物的能力的函数。对此，也已经确定出脊椎动物来源的去饱和酶对于在重组细胞例如植物细胞、种子、或酵母中产生LC-PUFA是特别有用的。因此，在另一个优选的实施方式中，重组细胞包括i)至少一种催化细胞内的EPA转化成DPA的Δ5延长酶；或ii)至少一种能作用于脂酰辅酶A底物的去饱和酶；或iii)至少一种来自脊椎动物的去饱和酶或其去饱和酶变体；或iv)i)、ii)或iii)的任一组合。
在一个具体的实施方式中，Δ5延长酶包括i)如SEQ ID NO2提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO2具有至少50％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
能作用于脂酰辅酶A底物或来自脊椎动物的去饱和酶可以是Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶或两者。在一个
中，去饱和酶包括i)如SEQ ID NO16、SEQ ID NO21或SEQ ID NO22提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO16、SEQ ID NO21或SEQ ID NO22具有至少50％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
优选地，至少一种去饱和酶是由脊椎动物天然产生的。
或者，当细胞是酵母细胞时，LC-PUFA是DHA，且所述酶至少是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、和Δ4去饱和酶。
或者，当细胞是酵母细胞时，LC-PUFA是DPA，且所述酶至少是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6延长酶。
尽管细胞可以是任一细胞类型，优选地，所述细胞能从内源性产生的亚油酸(LA)、α亚麻酸(ALA)或两者产生所述的LC-PUFA。更优选地，内源性产生的ALA与LA的比例至少是1∶1或至少是2∶1。
在一个实施方式中，细胞是植物细胞、被子植物的植物细胞、油籽种子植物细胞、或种子中的细胞。优选地，至少一种启动子是种子特异性启动子。
在另一个实施方式中，细胞是单细胞的微生物。优先地，单细胞的微生物适合于发酵。优选地，微生物是酵母。
在进一步的实施方式中，细胞是非人类动物细胞或体外的人体细胞。
在进一步的实施方式中，重组细胞产生了LC-PUFA，其整合于所述细胞的三酰甘油内。更优选地，在所述细胞中所产生的至少50％的LC-PUFA整合于三酰甘油内。
在另一个实施方式中，至少从藻类基因中获得了一种、两种或多种多核苷酸的蛋白编码区。优选地，藻类基因是来自于巴夫藻(Pavlova)属，例如来自Pavlova salina。
在另一个方面，本发明提供了能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、ARA、SDA、ETA、EPA、或它们的任一组合或混和物产生DHA的重组细胞，其中所述重组细胞衍生自不能合成DHA的细胞。
在进一步的方面，本发明提供了能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、ARA、SDA、ETA、EPA、或它们的任一组合或混和物产生DPA的重组细胞，其中所述重组细胞衍生自不能合成DPA的细胞。
仍在进一步的方面，本发明提供了能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、SDA、ETA、EPA、或它们的任一组合或混和物产生EPA的重组细胞，其中所述重组细胞衍生自不能合成EPA的细胞。
在另一个方面，本发明提供了能由ALA产生ETrA和由SDA产生ETA、以及能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、SDA、ETA、或它们的任一组合或混和物产生EPA的重组细胞，其中所述重组细胞衍生自不能合成ETrA、ETA或两者的细胞。
在进一步的方面，本发明提供了能用于发酵过程的生物体的重组细胞，其中所述细胞能由LA、ALA、花生四烯酸(ARA)、二十碳四烯酸(ETA)、或它们的任一组合或混和产生DPA，其中所述重组细胞衍生自不能合成DPA的细胞。
在另一个方面，本发明提供了能由LA、ALA、EPA、或它们的任一组合或混和产生DPA的重组植物细胞，其中植物细胞来自被子植物。
在一个实施方式中，植物细胞还能产生DHA。
仍在另一个方面中，本发明提供了能合成DGLA的重组细胞，包括编码下面的一种或两种多肽的多核苷酸a)一种多肽，其是Δ9延长酶，其中Δ9延长酶选自以下一组i)包括如SEQ ID NO3、SEQ ID NO85或SEQ ID NO86提供的氨基酸序列的多肽；ii)包括与SEQ ID NO3、SEQ ID NO85或SEQ ID NO86具有至少40％相同性的氨基酸序列的多肽；和iii)i)或ii)的生物学活性片段，和/或b)一种多肽，其是Δ8去饱和酶，其中Δ8去饱和酶选自以下一组i)包括如SEQ ID NO1提供的氨基酸序列的多肽；ii)包括与SEQ ID NO1具有至少40％相同性的氨基酸序列的多肽；和iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中多核苷酸与一种或多种能指导所述多核苷酸在细胞表达的启动子可操纵地连接，且其中所述重组细胞衍生自不能合成DGLA的细胞。
在一个实施方式中，细胞能将DGLA转化成ARA。
在另一个实施方式中，细胞还包括编码Δ5去饱和酶的多核苷酸，其中编码Δ5去饱和酶的多核苷酸与一种或多种能指导所述多核苷酸在细胞内表达的启动子可操纵地连接，且其中细胞能产生ARA。
在具体的实施方式中，细胞缺乏ω3去饱和酶活性，并且不能产生ALA。这些细胞可以是天然存在的，或者通过用本领域公知的技术降低细胞的ω3去饱和酶活性可以产生这些细胞。
优选地，细胞是植物细胞或者是适合于发酵的生物体的细胞。
在进一步的实施方式中，本发明的重组细胞具有实施将EPA转化成DHA的“Sprecher”途径所需的酶。这些酶可能是细胞天然具有的或者重组产生的。这些酶至少包括一种Δ7延长酶、Δ6去饱和酶和将二十四碳六烯酸过氧化物酶体β氧化产生DHA所需的酶。
本发明者已经鉴定出一组新的去饱和酶和延长酶。因此，本发明的进一步的方面涉及这些酶以及它们的同源物/变体/衍生物。
多肽可以是融合蛋白，其还包括至少一种其他的多肽序列。
所述的至少一种其他的多肽可以是增强本发明多肽的稳定性的多肽，或者是有助于纯化融合蛋白的多肽。
也提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的多肽。
在进一步的方面，本发明提供了包括或编码本发明的多核苷酸的载体。优选地，多核苷酸与种子特异性启动子可操纵地连接。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的分离的多核苷酸的重组细胞。
在进一步的方面，本发明提供了产生能合成一种或多种LC-PUFA的细胞的方法，所述方法包括将一种或多种编码至少两种酶的多核苷酸引入到细胞内，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、Δ4去饱和酶、Δ9延长酶、或Δ8去饱和酶，其中所述一种或多种多核苷酸与能指导所述多核苷酸在细胞内表达的启动子可操纵地连接。
在另一个方面，本发明提供了产生具有增强的合成一种或多种LC-PUFA的能力的重组细胞，方法包括将一种或多种编码至少两种酶的多核苷酸引入到第一细胞，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、Δ4去饱和酶、Δ9延长酶、或Δ8去饱和酶，其中所述一种或多种多核苷酸与一种或多种能指导所述多核苷酸在重组细胞内表达的启动子可操纵地连接，且其中所述重组细胞相对于所述的第一细胞具有增强的合成所述一种或多种LC-PUFA的能力。
自然要明白，与本发明的重组细胞有关的在此所述的每个实施方式都功能等同地应用于产生所述细胞的方法。
在进一步的方面，本发明提供了本发明的方法所产生的细胞。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的至少一种重组细胞的转基因植物。
优选地，植物是被子植物。更优选地，植物是油籽植物。
在进一步的实施方式中，转基因植物或其包括转基因种子的部分不包括编码酶的转基因，所述酶优先地将ω6 LC-PUFA转化成ω-3LC-PUFA。
在仍进一步的实施方式中，转基因植物或其包括转基因种子的部分包括编码Δ8去饱和酶和/或Δ9延长酶的转基因。
在进一步的方面，本发明提供了产生油籽的方法，所述方法包括i)在合适的条件下生长本发明的转基因的油籽植物，和ii)收集植物的种子。
在进一步的方面，本发明提供了本发明的转基因植物的一部分，其中相对于等基因的非转化的植物的对应部分，所述部分在其脂肪酸中包含水平升高的LC-PUFA。
优选地，所述植物部分选自但不限于由种子、叶、茎、花、花粉、根或专门的储藏器官(例如块茎)构成的组。
先前还没有显示出可以在植物种子中产生LC-PUFA，这些LC-PUFA也不能被整合于植物油例如三酰甘油内。
因此，在另一个方面，本发明提供了包括LC-PUFA的转基因种子。
优选地，LC-PUFA选自i)EPA，ii)DPA，iii)DHA，iv)EPA和DPA，和v)EPA、DHA和DPA。
更优选地，LC-PUFA选自i)DPA，ii)DHA，或iii)DHA和DPA。
甚至更优选地，LC-PUFA是EPA、DHA、和DPA。
优选地，种子源自产LA和/或ALA的等基因非转基因种子。更优选地，等基因非转基因种子的脂肪酸包括比LA更高浓度的ALA。甚至更优选地，等基因非转基因种子的脂肪酸包括至少约13％ALA或至少约27％ALA或至少约50％ALA。
优选地，种子油中的总脂肪酸包括至少9％的C20脂肪酸。
优选地，种子源自油籽植物。更优选地，油籽植物是油籽油菜(Brassicanapus)、玉米(Zea mays)、向日葵(Helianthus annuus)、大豆(Glycine max)、高梁(Sorghum bicolor)、亚麻(Linum usitatissimum)、蔗糖(Saccharumofficinarum)、甜菜(Beta vulgaris)、棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachishypogaea)、罂粟(Papaver somniferum)、芥菜(Sinapis alba)、蓖麻(Ricinuscommunis)、芝麻(Sesamum indicum)、或红花(Carthamus tinctorius)。
优选的是种子具有与等基因非转基因种子基本相同的发芽率。
更优选的是种子的发芽时机与等基因非转基因种子的发芽时机基本相同。
优选地，至少25％、或至少50％、或至少75％的LC-PUFA构成了种子中的三酰甘油的部分。
出乎意料的是，本发明者已经发现利用本发明的方法所产的转基因种子具有与等基因非转基因种子基本相同的ALA和LA水平。因此，优选的是，转基因种子具有与等基因非转基因种子基本相同的ALA和LA水平。此外，出乎意料地发现，利用本发明的方法所产的转基因种子降低了单不饱和脂肪酸的水平。因此，在更优选的实施方式中，转基因种子比等基因非转基因种子具有降低了水平的单不饱和脂肪酸。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的转基因种子的方法，所述方法包括i)将一种或多种编码至少两种酶的多核苷酸引入到种子的祖细胞中，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、Δ4去饱和酶、Δ9延长酶、或Δ8去饱和酶，其中所述一种或多种多核苷酸与一种或多种能指导所述多核苷酸在细胞内表达的启动子可操纵地连接，据此产生重组的祖细胞；ii)培养所述的重组祖细胞，以便产生包括所述转基因种子的植物；和iii)从所产植物中收集种子。
在仍进一步的方面，本发明提供了生产转基因种子的方法，其包括培养产本发明的转基因种子的转基因植物，并从植物中采收所述的转基因种子。
在进一步的方面，本发明提供了本发明的转基因植物、或本发明的植物部分、或本发明的种子的提取物，其中相对于等基因非转化植物的相应提取物，所述提取物在其脂肪酸中包含水平升高的LC-PUFA。
优选地，提取物是基本上纯化的油，其包括至少50％三酰甘油。
在进一步的方面，本发明提供了非人类的转基因动物，其包括至少一种本发明的重组细胞。
也提供了产生LC-PUFA的方法，所述方法包括在合适的条件下培养本发明的重组细胞。
在一个实施方式中，细胞是适合于发酵的生物体的细胞，且所述方法还包括将细胞暴露于至少一种LC-PUFA前体。
优选地，LC-PUFA前体是至少一种亚油酸或α-亚麻酸。在一个具体的实施方式中，用植物油提供LC-PUFA前体。
在另一个实施方式中，细胞是藻类细胞，以及方法还包括在合适的条件下生长藻类细胞，以便产生所述的LC-PUFA。
在进一步的不服那，本发明提供了生产一种或多种LC-PUFA的方法，所述方法包括在合适的条件下培养本发明的转基因植物。
在另一个方面，本发明提供了生产包括至少一种LC-PUFA的油的方法，其包括获得本发明的转基因植物、或本发明的植物部分、或本发明的种子，以及从所述植物、植物部分或种子中提取出油。
优选地，通过压榨所述种子从种子中提取出所述的油。
在另一个方面，本发明提供了由EPA产生DPA的方法，所述方法包括在合适的条件下将EPA暴露于本发明的多肽和脂肪酸前体。
在一个实施方式中，可以在细胞内实现方法，其利用聚酮化合物样系统生产EPA。
在仍另一个方面，本发明提供了发酵过程，其包括步骤i)提供含有液体组合物的容器，所述液体组合物包括本发明的细胞以及发酵和脂肪酸生物合成所需的组分；和ii)提供有助于所述容器中所含的液体组合物的发酵的条件。
优选地，发酵和脂肪酸生物合成所需的组分是LA。
优选地，细胞是酵母细胞。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的细胞、或其提取物或其包括LC-PUFA的部分、以及合适载体的组合物。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的转基因植物、或本发明的植物部分、或本发明的种子、或其提取物或其包括LC-PUFA的部分、以及合适载体的组合物。
在仍另一个方面，本发明提供了包括本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、或本发明的发酵过程的产物、或本发明的组合物的饲料。
优选地，饲料至少包括DPA，其中用细胞内的重组酶进行至少一个DPA生产中的酶反应。
此外，优选的是饲料至少包括DHA，其中用细胞内的重组酶进行至少一个DPA生产中的酶反应。
在进一步的方面，本发明提供了制备饲料的方法，所述方法包括混和本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、本发明的发酵过程的产物、或本发明的组合物和合适的载体。
优选地，饲料是给哺乳动物或鱼食用的饲料。
在进一步的方面，本发明提供了增加生物体中的LC-PUFA水平的方法，所述方法包括给生物体施用本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、本发明的发酵过程的产物、或本发明的组合物、或本发明的饲料。
优选地，施用途径是口服。
优选地，生物体是脊椎动物。更优选地，脊椎动物是人、鱼、宠物或家畜动物。
在进一步的方面，本发明提供了治疗或预防可从LC-PUFA中获益的疾病的方法，所述方法包括给对象施用本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、本发明的发酵过程的产物、或本发明的组合物、或本发明的饲料。
优选地，疾病是心律不齐、血管成形术、炎症、哮喘、牛皮癣、骨质疏松症、肾结石、AIDS、多发性硬化、类风湿关节炎、Crohn病、精神分裂症、癌症、胎儿乙醇综合征、注意缺陷多动症、囊性纤维化、苯丙酮尿症、单相抑郁症、进攻性敌意(aggressive hostility)、脑白质肾上腺萎缩症、冠状动脉疾病、高血压、糖尿病、肥胖症、Alzheimer病、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血细胞聚集、胃肠道出血、子宫内膜异位症、经前综合征、肌痛性脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼部疾病。
虽然给对象提供任一量的LC-PUFA都将有益于对象，但是优选地施用治疗疾病的有效量。
在另一个方面，本发明提供了本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明的方法的产物、本发明的发酵过程的产物、或本发明的组合物、或本发明的饲料在制备用于治疗或预防可从LC-PUFA中获益的疾病的药物中的用途。
先前已经在酵母中表达秀丽隐杆线虫Δ6延长酶，其已经显示出能将十八碳四烯酸转化成二十碳四烯酸。但是，本发明者已经出乎意料地发现该酶也具有Δ5延长酶活性，能将二十碳五烯酸转化成二十二碳五烯酸。
在进一步的实施方式中，本发明提供了生产包括22个碳原子的不分支的LC-PUFA的方法，所述方法包括将不分支的20个碳原子的LC-PUFA与多肽一起温育，所述多肽选自以下一组i)包括如SEQ ID NO2或SEQ ID NO14提供的氨基酸序列的多肽；ii)包括与SEQ ID NO2或SEQ ID NO14具有至少50％相同性的氨基酸序列的多肽，和iii)i)或ii)的生物学活性片段，其中多肽也具有Δ6延长酶活性。
优选地，包括22个碳原子的不分支的LC-PUFA是DPA，以及不分支的20个碳原子的LC-PUFA是EPA。
优选地，在重组细胞内实施生产多肽和EPA的方法。
在仍进一步的方面，本发明提供了基本上纯化的抗体、或其片段，所述抗体或其片段与本发明的多肽特异性结合。
在另一个方面，本发明提供了鉴定出能合成一种或多种LC-PUFA的重组细胞、组织或生物体的方法，所述方法包括检测在所述细胞、组织或生物体中是否存在一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少两种酶，所述酶是Δ5/Δ6双功能去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5/Δ6双功能延长酶、Δ5延长酶、Δ6延长酶、Δ4去饱和酶、Δ9延长酶、或Δ8去饱和酶，其中所述一种或多种多核苷酸与一种或多种能指导所述多核苷酸在细胞、组织或生物体内表达的启动子可操纵地连接。
优选地，方法包括核酸扩增步骤、核酸杂交步骤、检测细胞、组织或生物体内是否存在转基因的步骤、或确定出细胞、组织或生物体内的脂肪酸含量或组成的步骤。
优选地，生物体是动物、植物、被子植物或微生物。
在另一个方面，本发明提供了由EPA产生DPA的方法，所述方法包括在合适的条件下将EPA暴露于本发明的Δ5延长酶和脂肪酸前体。
优选地，在细胞内实现利用聚酮化合物样系统产生EPA的方法。
包括在此所提供的新的多核苷酸的重组(转基因)细胞、植物、非人类动物也可以天然地产生其他的延长酶和/或去饱和酶，例如在此所定义的延长酶和/或去饱和酶。
显而易见的是，本发明的一个方面的优选的特点和特征都可应用于本发明的许多其他的部分。
在本说明书全文中，词语“包括”或“包含”都被理解为包含给定的元件、整体或步骤、或元件、整体或步骤的组，但不排除任何其他的元件、整体或步骤、或元件、整体或步骤的组。
此后通过下面的非限制性实施例并参照附图描述本发明。


图1ω3和ω6 LC-PUFA合成的可能途径。标记为I、II、III和IV的部分分别对应于ω6(Δ6)、ω3(Δ6)、ω6(Δ8)、和ω3(Δ)途径。I和II部分中的化合物是ω6化合物，而II和IV部分中的那些化合物是ω3化合物。“Des”表示途径中的经所示的去饱和酶催化的去饱和酶步骤，而“Elo”表示经所示的延长酶催化的延长酶步骤。虚线箭头代表在哺乳动物细胞内进行的用于由DPA产生DHA的“Sprecher”途径中的步骤。
图2LC-PUFA在微藻类纲中的分布。绿藻纲和Prasinophyceae被描述为“绿藻”；Eustigmatophyceae为“黄绿藻”；红藻纲为“红藻”、以及Bacillariophyceae和Prymnesiophyceae为硅藻和金褐藻。
图3用于在细胞内表达LC-PUFA生物合成途径的遗传构建体。
图4去饱和酶的PILEUP。d8-atg-Pavlova salinaΔ8去饱和酶、眼虫属(euglena)-AAD45877(Δ8去饱和酶，纤细眼虫)、根霉属(rhizopus)-AAP83964(Δ6去饱和酶、根霉属NK030037)、毛霉菌属(mucor)-BAB69055(Δ6去饱和酶，Mucor circinelloides)、mortierella-AAL73948(Δ6去饱和酶，Mortierella isabellina)、malpina-BAA85588(Δ6去饱和酶，高山被孢霉)、physcomitrella-CAA11032(Δ6酰基脂去饱和酶，小立碗藓)、ceratadon-CAB94992(Δ6脂肪乙炔酶，角齿藓(Ceratodon purpureus))。
图5PCR产物与Elo1或Elo2探针杂交的Southern印迹。
图6延长酶的PILEUP。
图7用于在拟南芥属中表达编码LC-PUFA生物合成酶的基因的转基因构建体。“EPA构建体”pSSP-5/6D.6E(在实施例5中也称作pZebdesatCeloPWvec8)(图7A)含有斑马鱼的双功能的Δ5/Δ6去饱和酶(D5/D6Des)和线虫的Δ6延长酶(D6Elo)，两者都受截断的napin启动子(Fp1)驱动，以及受CaMV-35S(35SP)启动子驱动的潮霉素耐药性选择标记物基因(hph)。“DHA构建体”pXZP355(图7B)包括都受截断的napin启动子(Fp11)驱动的Pavlova salina的Δ4去饱和酶(D4Des)和Δ5延长酶(D5Elo)基因、以及受胭脂氨酸(nopaline)合酶启动子(NosP)驱动的卡那霉素耐药性选择标记物基因(nptII)。所有基因的3’端侧翼都是胭脂氨酸合酶终止子(NosT)。
图8A显示携带EPA和DHA基因构建体的拟南芥(Arabidopsisthaliana)株DO11的脂肪酸谱的气相色谱(GLC)。B从拟南芥株DO11中获得的EPA和DHA的质谱。
图9如实施例12所示的，在低严格性或高严格性的条件下，用由如右侧所示的P.salina基因编码区构成的放射性标记探针与上方所示的各种微藻类物种的DNA所进行的点印迹杂交的放射自显像图。
图10高等植物的Δ6和Δ8去饱和酶的氨基酸序列排列。用PILEUP(GCG，Wisconsin，USA)排列来自E.plantagineum(Ep1D6Des)(SEQ IDNO64)、E.gentianoides(EgeD6Des，登录号AY055117)(SEQ ID NO65)、E.pitardii(EpiD6Des，AY055118)(SEQ ID NO66)、琉璃苣(BofD6Des，U79010)(SEQ ID NO67)Δ6去饱和酶以及来自琉璃苣(BofD8Des，AF133728)(SEQ ID NO68)、向日葵(Helianthus annus)(HanD8Des，S68358)(SEQ ID NO69)、和拟南芥(AtD8DesA、AAC62885.1；和AtD8DesB、CAB71088.1)(分别是SEQ ID NO70和SEQ ID NO71)的Δ8去饱和酶的氨基酸序列。HBI、HBII、HBIII是三个保守的组氨酸框。F1和R1是用于扩增cDNA的简并引物EpD6Des-F1和EpD6Des-R1的对应区域。也显示了具有保守的HPGG基序的N末端的细胞色素b5结构域。
图11所分离到的变体Ep1D6Des酶以及代表性的酶活性。具有细胞色素b5、组氨酸框I、II和III的Ep1D6Des分别被显示为b5、HBI、HBII、和HBIII。在A组中以下面的格式显示了所分离到的变体野生型氨基酸-位点编号-变体氨基酸。空心菱形表示显著降低酶活性的突变，而实心菱形表示对酶活性没有显著影响的变体。B组显示了两种变体的转基因烟草叶子中的GLA及SDA产量与野生型酶的比较。
图12由ALA(18∶3)合成ω3 LC-PUFA SDA(18∶4)、EPA(20∶5)和DHA(22∶6)的其他途径。分别用实心箭头、空心箭头和虚线显示出了去饱和酶、延长酶和酰基转移酶。仅仅在脂酰辅酶A底物上出现链的延长，而去饱和作用可以出现于酰基PC(A&B)或脂酰辅酶A底物。还没有确定出最终的Δ4去饱和酶步骤在酰基PC或脂酰辅酶A之间的底物偏向性。涉及酰基PC去饱和酶的途径需要酰基转移酶介导的PC和辅酶A底物之间的酰基的穿梭变位。组A和B分别显示了酰基PC去饱和酶途径的“Δ6途径”以及“Δ8途径”。组C显示了在本研究中所表达的途径，其中斑马鱼Δ6/Δ5双功能去饱和酶编码脂酰辅酶AΔ6和Δ5去饱和酶活性。通过相同组的反应可以合成ω6 LC-PUFA例如ARA(20∶4)，只是开始时用LA(18∶2)作为初始底物。
图13Synechococcus 7002在22℃、25℃、30℃的生长率。
图14不同生长温度下的Synechococcus 7002的亚油酸和亚麻酸水平。
序列列表SEQ ID NO1-Pavlova salina的Δ8去饱和酶；SEQ ID NO2-Pavlova salina的Δ5延长酶；SEQ ID NO3-Pavlova salina的Δ9延长酶；SEQ ID NO4-Pavlova salina的Δ4去饱和酶；SEQ ID NO5-编码Pavlova salina的Δ8去饱和酶的开放读框的cDNA；SEQ ID NO6-编码Pavlova salina的Δ8去饱和酶的全长cDNA；SEQ ID NO7-编码Pavlova salina的Δ5延长酶的开放读框的cDNA；SEQ ID NO8-编码Pavlova salina的Δ5延长酶的全长cDNA；SEQ ID NO9-编码Pavlova salina的Δ9延长酶的开放读框的cDNA；SEQ ID NO10-编码Pavlova salina的Δ9延长酶的全长cDNA；SEQ ID NO11-编码Pavlova salina的Δ4去饱和酶的N末端部分的部分cDNA；SEQ ID NO12-编码Pavlova salina的Δ4去饱和酶的开放读框的cDNA；SEQ ID NO13-编码Pavlova salina的Δ4去饱和酶的全长cDNA；SEQ ID NO14-秀丽隐杆线虫的Δ5/Δ6双功能延长酶；SEQ ID NO15-斑马鱼(Danio rerio)的Δ5/Δ6双功能去饱和酶；SEQ ID NO16-人类的Δ5去饱和酶(Genbank登录号NoAAF29378)；SEQ ID NO17-畸雌腐霉的Δ5去饱和酶(Genbank登录号NoAAL13311)；SEQ ID NO18-破囊壶菌的Δ5去饱和酶(Genbank登录号NoAAM09687)；SEQ ID NO19-高山被孢霉的Δ5去饱和酶(Genbank登录号NoO74212)；SEQ ID NO20-秀丽隐杆线虫的Δ5去饱和酶(Genbank登录号NoT43319)；SEQ ID NO21-人类的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAAD20018)；SEQ ID NO22-小鼠的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoNP_062673)；SEQ ID NO23-畸雌腐霉的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAAL13310)；SEQ ID NO24-琉璃苣的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAAD01410)；SEQ ID NO25-Anemone leveillei的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAAQ10731)；SEQ ID NO26-角齿藓的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoCAB94993)；SEQ ID NO27-小立碗藓的Δ6去饱和酶 (Genbank登录号NoCAA11033)；SEQ ID NO28-高山被孢霉的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoBAC82361)；SEQ ID NO29-秀丽隐杆线虫的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAAC15586)；SEQ ID NO30-人类的Δ5延长酶(Genbank登录号NoNP 068586)；SEQ ID NO31-小立碗藓的Δ6延长酶(Genbank登录号NoAAL84174)；SEQ ID NO32-高山被孢霉的Δ6延长酶(Genbank登录号NoAAF70417)；SEQ ID NO33-破囊壶菌的Δ4去饱和酶(Genbank登录号NoAAM09688)；SEQ ID NO34-纤细眼虫的Δ4去饱和酶(Genbank登录号NoAAQ19605)；SEQ ID NO35-球等鞭金藻的Δ9延长酶(Genbank登录号NoAAL37626)；SEQ ID NO36-纤细眼虫的Δ8去饱和酶(Genbank登录号NoAAD45877)；SEQ ID NO37-编码秀丽隐杆线虫的Δ5/Δ6双功能延长酶的cDNA；SEQ ID NO38-编码斑马鱼(Danio rerio)的Δ5/Δ6双功能去饱和酶的cDNA；SEQ ID NO39至42、46、47、50、51、53、54、56、57、81、82、83、84和87-寡核苷酸引物；SEQ ID NO43至45、48、49和52-各种去饱和酶/延长酶的保守基序；SEQ ID NO55-编码Pavlova salina FAE样延长酶的部分cDNA；SEQ ID NO58-编码Pavlova salina的Δ5去饱和酶的全长cDNA；SEQ ID NO59-编码Pavlova salina的Δ5去饱和酶的开放读框的cDNA；SEQ ID NO60-Pavlova salina的Δ5去饱和酶；SEQ ID NO61和62-Echium pitardii的Δ6去饱和酶的片段；SEQ ID NO63-编码Echium plantagineum的Δ6去饱和酶的开放读框的cDNA；SEQ ID NO64-Echium plantagineum的Δ6去饱和酶；
SEQID NO65-Echium gentianoides的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAY055117)；SEQ ID NO66-Echium pitardii的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoAY055118)；SEQ ID NO67-琉璃苣的Δ6去饱和酶(Genbank登录号NoU79010)；SEQ ID NO68-琉璃苣的Δ8去饱和酶(Genbank登录号NoAF133728)；SEQ ID NO69-向日葵的Δ8去饱和酶(Genbank登录号NoS68358)；SEQ ID NO70-拟南芥的Δ8去饱和酶A(Genbank登录号NoAAC62885.1)；SEQ ID NO71-拟南芥的Δ8去饱和酶B(Genbank登录号NoCAB71088.1)；SEQ ID NO72和73-Δ6-和Δ8-去饱和酶的保守基序；SEQ ID NO74-破囊壶菌的Δ6延长酶(Genbank登录号NoAX951565)；SEQ ID NO75-斑马鱼的Δ9延长酶(Genbank登录号NoNM～199532)；SEQ ID NO76-Pavlova lutheri的Δ9延长酶；SEQ ID NO77-斑马鱼的Δ5延长酶(Genbank登录号NoAF532782)；SEQ ID NO78-Pavlova lutheri的Δ5延长酶；SEQ ID NO79-编码延长酶的Heterocapsa niei的部分基因序列；SEQ ID NO80-由SEQ ID NO79编码的蛋白，终止密码子的存在说明SEQ ID NO79内存在一个内含子；SEQ ID NO85-Pavlova salina的Δ9延长酶，由SEQ ID NO9的位点31上的替代起始密码子编码；SEQ ID NO86-Pavlova salina的Δ9延长酶，由SEQ ID NO9的位点85上的替代起始密码子编码；SEQ ID NO88-直链藻属(Melosira sp.)的部分延长酶氨基酸序列；SEQ ID NO89-编码直链藻属的部分延长酶的cDNA序列。
发明详述一般技术和定义除非有特殊的不同定义，在此所用的所有技术和科学术语都应当具有如本领域(例如细胞培养、植物生物学、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学、脂肪酸合成、和生物化学)的一般人员通常所理解的相同的含义。
除非另有说明，本发明所用的重组核酸、重组蛋白、细胞培养和免疫学技术都是本领域技术人员公知的标准方法。在文献中已经充分地描述和解释了这些技术，例如J.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(editor)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，Volumes1 and 2，IRL Press(1991)；D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNACloningA Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1 995 and 1996)；和F.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括最近的所有更新)；EdHarlow and David Lane(editors)AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory，(1988)；和J.E.Coligan etal.(editors)CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括最近的所有更新)，并通过引用将其并入本申请。
术语“长链多不饱和脂肪酸”、“LC-PUFA”或“C20+多不饱和脂肪酸”指的是其碳链上包括至少20个碳原子以及至少三个碳-碳双键的脂肪酸。术语“超长链多不饱和脂肪酸”、“VLC-PUFA”或“C22+多不饱和脂肪酸”在此指的是其碳链上包括至少22个碳原子以及至少三个碳-碳双键的脂肪酸。脂肪酸碳链上的碳原子的数目一般指的都是非分支的碳链。如果碳链有分支，那么碳原子的数目要除外侧向基团上的那些碳原子数目。在一个实施方式中，长链多不饱和脂肪酸是ω3脂肪酸，即在脂肪酸的甲基末端起的第三个碳-碳键中具有不饱和性(碳-碳双键)的脂肪酸。在另一个实施方式中，长链多不饱和脂肪酸是ω6脂肪酸，即在脂肪酸的甲基末端起的第6个碳-碳键中具有不饱和性(碳-碳双键)的脂肪酸。在进一步的实施方式中，长链多不饱和脂肪酸选自由花生四烯酸(ARA，20:4Δ5，8，11，14；ω6)、二十碳四烯酸(ETA，20:4Δ8，11，14，17；ω3)、二十碳五烯酸(EPA，20:5Δ5，8，11，14，1 7；ω3)、二十二碳五烯酸(DPA，22:5Δ7，10，13，16，19；ω3)、或二十二碳六烯酸(DHA，22:6Δ4，7，10，13，16，19；ω3)构成的组。LC-PUFA也可以是dihomo-γ-亚油酸(DGLA)或二十碳三烯酸(ETrA，20:3Δ11，14，17；ω3)。显而易见的是，本发明所生产的LC-PUFA可以是上面的任一或所有脂肪酸的混和物，或者可以包括其他的LC-PUFA或任一这些LC-PUFA的衍生物。在优选的实施方式中，ω3脂肪酸是EPA、DPA或DHA，甚至更优选地是DPA或DHA。
此外，术语“长链多不饱和脂肪酸”或“超长链多不饱和脂肪酸”在此指的是游离状态的脂肪酸或者是酯化形式的脂肪酸，例如作为甘油三酯、甘油双酯、甘油单酯、结合脂酰辅酶A的形式或其他的结合形式。脂肪酸可以被酯化成磷脂，例如磷酸卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、或双磷脂酰甘油形式。因此，LC-PUFA可以表现为细胞内脂质形式的混和物或纯化的油或从细胞、组织或生物体中提取到的脂质。在优选的实施方式中，本发明提供了包括至少75％或85％甘油三酯的油，剩余的部分表现为其他形式的脂质，例如那些上面所提及的脂质，以及至少所述的甘油三酯包括LC-PUFA。可以进一步地纯化或处理油，例如用强碱水解，以便释放出游离的脂肪酸，或通过分镏、蒸镏等。
缩写“LC-PUFA”和“VLC-PUFA”在此可以表示单一类型的脂肪酸或者多种类型的脂肪酸。例如，产生LC-PUFA的本发明的转基因植物可以产生EPA、DPA和DHA。
可以用于本发明的去饱和酶和延长酶蛋白以及编码所述蛋白的基因是本领域已知的任一蛋白和基因或者它们的同源物或衍生物。在表1中罗列了这些基因以及所编码的蛋白的实例。已经显示出参与LC-PUFA生物合成的去饱和酶都属于所谓的“前端”去饱和酶组，其特点是在每个蛋白的N末端都具有细胞色素b5样结构域。细胞色素b5样结构域可能作为去饱和作用所需的电子的受体(Napier et al.，1999；Sperling and Heinz，2001)。
表1所克隆的参与LC-PUFA生物合成的基因。



*http://www.ncbi.nlm.nih.gov/**功能未证实/未探明通过在细胞例如酵母细胞或植物细胞内表达编码酶的基因，以及确定出细胞是否比未表达酶的对照细胞具有了增强的产生LC-PUFA的能力，可以测试本发明所用的任一延长酶或去饱和酶的活性。
除非有不同的说明，本发明的涉及细胞、植物、种子等以及生产所述细胞、植物、种子等的方法、并提到在此所提供的列表中的“两种酶”(或至少“三种酶”等)的那些实施方式，表示其中所述多核苷酸编码至少两种列表中所提供的“不同的”酶，而不是基本上编码同一种酶的两个相同的(或者非常相似的，只有很小的差异，以致基本上不会改变所编码的酶的活性)开放读框。
除非有不同的说明，术语“基本上相同”或其变异在此表示所分析的两个来自不同来源的样品例如两种种子是基本上相同的，只要它们在所研究的性状上只有约+/-10％的差异。
术语“优先地将ω6 LC-PUFA转化成ω3 LC-PUFA的酶”在此表示酶能比其在图1的途径II或III中所列出的去饱和反应中所实施的效率更高的效率实施所述转化。
虽然某些酶在此被特异地描述为“双功能的”，但是缺少该术语的缺乏并非一定表示特殊的酶不具有所特异定义的活性以外的其他活性。
去饱和酶“Δ5/Δ6双功能去饱和酶”或“Δ5/Δ6去饱和酶”在此至少能i)将α亚麻酸转化成十八碳四烯酸，和ii)将二十碳四烯酸转化成二十碳五烯酸。即，Δ5/Δ6双功能酶是Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶，以及Δ5/Δ6双功能去饱和酶可以被认为是它们每种的一种亚型。已经从斑马鱼中鉴定出编码Δ5/Δ6去饱和酶的基因(Hasting et al.，2001)。编码该酶的基因可能代表着“前端去饱和酶”的祖先形式，其后来复制以及拷贝进化成不同的Δ5和Δ6去饱和酶功能。在一个实施方式中，Δ5/Δ6用淡水鱼种天然地产生Δ5/Δ6双功能去饱和酶。在一个具体的实施方式中，Δ5/Δ6双功能去饱和酶包括i)如SEQ ID NO15提供的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO15具有至少50％相同性的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的生物学活性片段。
“Δ5去饱和酶”在此至少能将二十碳四烯酸转化成二十碳五烯酸。在一个实施方式中，酶Δ5去饱和酶催化C20 LC-PUFA的去饱和作用，将DGLA转化成花生四烯酸(ARA，20:4 ω6)以及将ETA转化成EPA(20:5ω3)。已经从多种生物体中分离出编码该酶的基因，所述生物体包括藻类(破囊壶菌，Qiu et al，2001)、真菌(M.alpine、畸雌腐霉、三角褐指藻、Dictyostelium)、秀丽隐杆线虫和哺乳动物(表1)。在另一个实施方式中，Δ5去饱和酶包括(i)如SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20或SEQ ID NO60提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQID NO20或SEQ ID NO60中的任一序列具有至少50％相同性的氨基酸序列；或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，Δ5去饱和酶包括(i)如SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQID NO20或SEQ ID NO60提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20或SEQ ID NO60中的任一序列具有至少90％相同性的氨基酸序列；或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，由表1所列的其中一种Δ5去饱和酶基因或与之基本相同的基因的蛋白编码区编码Δ5去饱和酶。
“Δ6去饱和酶”在此至少能将α亚麻酸转化成十八碳四烯酸。在一个实施方式中，酶Δ6去饱和酶催化C18 LC-PUFA的去饱和作用，将LA转化成GLA以及将ALA转化成SDA。在另一个实施方式中，Δ6去饱和酶包括(i)如SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ IDNO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65、SEQ ID NO66或SEQ IDNO67提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65、SEQ IDNO66或SEQ ID NO67中的任一序列具有至少50％相同性的氨基酸序列；(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，Δ6去饱和酶包括与SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ IDNO29、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65、SEQ ID NO66或SEQ ID NO67中的任一序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，由表1所列的其中一种Δ6去饱和酶基因或与之基本相同的基因的蛋白编码区编码Δ6去饱和酶。
“Δ4去饱和酶”在此至少能将二十二碳五烯酸转化成二十二碳六烯酸。在非哺乳动物的生物体中，Δ4去饱和酶催化由DPA产生DHA的去饱和步骤，已经从淡水原生动物物种纤细眼虫和海洋物种破囊壶菌中分离到了编码该酶的基因(Qiu et al.，2001；Meyer et al.，2003)。在一个实施方式中，Δ4去饱和酶包括(i)如SEQ ID NO4、SEQ ID NO33或SEQ IDNO34提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO4、SEQ ID NO33或SEQ IDNO34具有至少50％相同性的氨基酸序列；(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，由表1所列的其中一种Δ4去饱和酶基因或与之基本相同的基因的蛋白编码区编码Δ4去饱和酶。
“Δ8去饱和酶”在此至少能将20:3Δ11，14，17ω3转化成二十碳四烯酸。在一个实施方式中，Δ8去饱和酶相对特异于Δ8底物。即，它在去饱和Δ8底物上具有比其他底物更高的活性，特别是对于Δ6去饱和的底物。在一个优选的实施方式中，当在酵母细胞内表达时，Δ8去饱和酶只有很小的或没有Δ6去饱和酶活性。在另一个实施方式中，Δ8去饱和酶包括(i)如SEQ ID NO1、SEQ ID NO36、SEQ ID NO68、SFQ ID NO69、SEQ IDNO70或SEQ ID NO71提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO1、SEQ IDNO36、SEQ ID NO68、SEQ ID NO69、SEQ ID NO70或SEQ ID NO71具有至少50％相同性的氨基酸序列；或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，Δ8去饱和酶包括(i)如SEQ ID NO1提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO1具有至少90％相同性的氨基酸序列；(iii)i)或ii)的生物学活性片段。
“Δ3去饱和酶”在此至少能将LA转化成ALA和/或将GLA转化成SDA和/或将ARA转化成EPA。Δ3去饱和酶的实例包括如Pereira et al.(2004)、Horiguchi et al.(1998)、Berberich et al.(1998)和Spychalla et al.(1997)所述的那些Δ3去饱和酶。在一个实施方式中，本发明的细胞是缺乏Δ3去饱和酶活性的植物细胞。利用本领域公知的基因敲除技术可以产生这些细胞。这些细胞可以被用于特异地产生大量的ω6 LC-PUFA例如DGLA。
延长酶生物化学证据说明脂肪酸延长由4个步骤组成缩合、还原、脱水和第二次还原。在本发明的上下文中，“延长酶”指的是在合适的生理条件下，在存在延长复合物的其他成分时，催化缩合步骤的多肽。已经显示，只有延长蛋白复合物的缩合组分(“延长酶”)在细胞内的异源或同源表达对于相应脂酰链的延长是必需的。因此，所引用的延长酶能成功地恢复转基因宿主的还原和脱水活性，以便实现成功的脂酰延长。认为延长反应相对于脂肪酸底物的链长以及去饱和程度的特异性存在于缩合组分内。该组分也被认为是延长反应中的速度限制性的组分。
至今已经鉴定出两组缩合酶。第一组涉及饱和和单不饱和脂肪酸(C18-22)的延长，例如拟南芥的FAE1基因。在芸苔中所形成的产物的实例是芥酸(22∶1)。该组被称为FAE样酶，并且在LC-PUFA生物合成中没有表现出作用。其他被鉴定出的脂肪酸延长酶的组被称作延长酶的ELO家族，按ELO基因命名，其活性对于在酵母中合成神经鞘脂的超长链脂肪酸是必需的。从合成LC-PUFA的生物体如藻类、苔藓、真菌和线虫中分离出的ELO型延长酶的表观形似物已经显示出涉及LC-PUFA的延长和合成。也已经分离出一些编码这些PUFA延长酶的基因(表1)。这些基因在核苷酸或氨基酸序列上与高等植物中的FAE样延长酶基因无关。
“Δ5/Δ6双功能延长酶”或“Δ5/Δ6延长酶”在此至少能i)将十八碳四烯酸转化成二十碳四烯酸；和ii)将二十碳五烯酸转化成二十二碳五烯酸。即，Δ5/Δ6双功能延长酶是Δ5延长酶和Δ6延长酶，以及Δ5/Δ6双功能延长酶可以被认为是每种酶的一种亚型。在一个实施方式中，当给植物提供EPA来源时，Δ5/Δ6双功能延长酶能催化植物细胞(例如高等植物细胞)内的EPA延长产生DPA。可以外源地或优选地内源地提供EPA。已经从无脊椎动物秀丽隐杆线虫中分离出编码这样一种延长酶的基因(Beaudoin et al.，2000)，尽管之前并不知道它能催化Δ5延长步骤。在一个实施方式中，Δ5/Δ6双功能延长酶包括(i)如SEQ ID NO2或SEQ IDNO14提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO2或SEQ ID NO14具有至少50％相同性的氨基酸序列；或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。
“Δ5延长酶”在此至少能将二十碳五烯酸转化成二十二碳五烯酸。在一个实施方式中，Δ5延长酶来自无脊椎动物来源例如藻类或真菌来源。在所实现的延长反应的特异性方面，这些延长酶具有优势(例如SEQ IDNO2提供的Δ5延长酶)。在一个优选的实施方式中，Δ5延长酶相对地特异于C20底物，而不是C22底物。例如，当在酵母细胞内表达时，其对C22底物的活性(延长为C24脂肪酸)比其对相应的C20底物的活性至少低10倍。优选的是，当使用C20 A5去饱和底物时，其活性是高的，例如当在酵母细胞内表达时，其提供了20:5ω3向22:5ω3的至少7％的转化率。在另一个实施方式中，Δ5延长酶相对特异于Δ5去饱和底物，而不是Δ6去饱和底物。例如，当在酵母细胞内表达时，其对Δ6去饱和C18底物的活性比对Δ5去饱和C20底物的活性至少低10倍。在进一步的实施方式中，Δ5延长酶包括(i)如SEQ ID NO2、SEQ ID NO30、SEQ IDNO77或SEQ ID NO78提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO2、SEQ IDNO30、SEQ ID NO77或SEQ ID NO78具有至少50％相同性的氨基酸序列；或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在另一个实施方式中，Δ5延长酶包括(i)如SEQ ID NO2提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO2具有至少90％相同性的氨基酸序列；或(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，由表1所列的其中一种Δ5延长酶基因或与之基本相同的基因的蛋白编码区编码Δ5延长酶。
“Δ6延长酶”在此至少能将十八碳四烯酸转化成二十碳四烯酸。在一个实施方式中，Δ6延长酶包括(i)如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO74、SEQ ID NO85、SEQ IDNO86或SEQ ID NO88提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO74、SEQ ID NO85、SEQ ID NO86或SEQ ID NO88具有至少50％相同性的氨基酸序列；(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在另一个实施方式中，Δ6延长酶包括(i)如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO32、SEQ ID NO85、SEQ IDNO86或SEQ ID NO88提供的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO2、SEQ IDNO3或SEQ ID NO32、SEQ ID NO85、SEQ ID NO86或SEQ ID NO88具有至少90％相同性的氨基酸序列；(iii)i)或ii)的生物学活性片段。在进一步的实施方式中，由表1所列的其中一种Δ6延长酶基因或与之基本相同的基因的蛋白编码区编码Δ6延长酶。
在一些原生生物物种中，通过在用Δ8去饱和酶去饱和之前，用C2单位延长亚油酸或α亚麻酸合成LC-PUFA(图1IV部分；“Δ8去饱和作用”途径)。在这些生物体中没有检测到Δ6去饱和酶和Δ6延长酶。取而代之的是，在这些