专利名称：一种兽用酵母葡聚糖注射液的制作方法一种兽用酵母葡聚糖注射液技术领域本发明属于兽用药物制剂技术领域，涉及水溶性酵母葡聚糖通过注射途径在畜禽 方面的应用，更具体地说是一种兽用酵母葡聚糖注射液及其制备与应用方法。技术背景在二十世纪四十年代，Pillemer博士首次发现并报道酵母细胞壁中有一种物质具 有提高免疫力的作用。之后，经过图伦大学Diluzio博士的进一步研究发现，酵母细胞壁中 提高免疫力的是一种葡聚糖的多糖类物质，主要为成分为β -1，3-D葡聚糖，因为它能增强 哺乳动物的免疫力，同时具有抗癌、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、降低胆固醇和血脂、 促进伤口愈合等功能，被誉为是生物效应应答剂。从酵母细胞壁提取得到的酵母葡聚糖是不溶于水的，通过饲料添加剂方式添加在 饲料中，能增强动物免疫力，改善动物健康状况，增加其抗应激能力，从而提高生产性能，增 加经济效益。Robertsen等试验表明，酵母聚糖能增强大西洋鲑对灭鲑气单胞菌、鳗弧菌 和鲁克氏耶尔森氏菌抗感染能力。陈昌福等研究表明酵母葡聚糖可提高鲫鱼血清总蛋白 的含量，并且其血清凝集抗体效价、溶菌酶的活性、白细胞的吞噬指数均显著高于空白对照 组。李志清等研究指出，肉仔鸡日粮中添加水不溶性酵母葡聚糖能显著提高肉鸡的日增量 和饲料转化率。潘树德等在免疫接种猪瘟疫苗的断奶仔猪日粮中添加水不溶性酵母葡聚 糖，结果表明其可明显提高断奶仔猪的猪瘟抗体水平。所以很久以来一些学者主要通过口 服和拌料的方式来研究酵母葡聚糖对动物免疫功能的影响，但口服途径中会造成一定的浪 费，酵母葡聚糖中的部分有效成分也会在动物体内被消化系统消化掉。由于水不溶性酵母 葡聚糖以注射途径用于动物可造成注射部位肿胀、化脓等炎症反应，如果能改变酵母葡聚 糖的水溶性，通过注射途径，来提高动物免疫力，可扩大酵母葡聚糖在动物临床生产实际中 的应用范围。近年来，通过有关专家的试验研究，通过硫酸化、羧甲基和乙酰化等化学修饰方 式，可将水不溶性酵母葡聚糖制成水溶性葡聚糖。由于水溶性酵母葡聚糖能更有效地提高 动物机体的免疫能力和促进动物生长，并具有用量少、纯天然、无残留且稳定性强等优点， 所以在动物上具有广阔的应用前景。目前已有羧甲基水溶性酵母葡聚糖产品的出售，主要 作为生物添加剂应用于化妆品的生产，但尚未见到有关将酵母葡聚糖制备成兽用酵母葡聚 糖注射液，通过注射途径应用于哺乳动物研究的文献报道。发明内容本发明人在参考国内外学者对水不溶性酵母葡聚糖修饰的基础上，用改良硫酸化 方法制备出硫酸化水溶性酵母葡聚糖。为了拓宽酵母葡聚糖应用范围和提高其生物活性利 用度，本发明人开展了硫酸化水溶性酵母葡聚糖(简称硫酸化葡聚糖)和羧甲基水溶性酵 母葡聚糖(简称羧甲基葡聚糖)对动物安全性、生物活性以及不同剂量对免疫功能的影响 等方面的试验研究，为制备兽用酵母葡聚糖注射液奠定了良好的基础。为实现上述目的，本发明的技术方案如下—种兽用酵母葡聚糖注射液，其特征在于它是由每IOOml注射液中含硫酸化水溶 性酵母葡聚糖2 8g或羧甲基水溶性酵母葡聚糖2 Mg，其余为注射用水组成。本发明所述的兽用酵母葡聚糖注射液，其中它是由2% 8%的羧甲基水溶性酵 母葡聚糖水溶液组成。本发明所述的兽用酵母葡聚糖注射液，其中它是由2% 的硫酸化水溶性酵 母葡聚糖水溶液组成。
本发明所述的兽用酵母葡聚糖注射液，其中的水为药用注射用水。
为了证明本发明兽用酵母葡聚糖注射液的安全性、生物活性及使用剂量，进行了 如下的研究
试验一、水溶性酵母葡聚糖最大耐受量试验
本试验研究了硫酸化葡聚糖和羧甲基酵母葡聚糖对小白鼠的最大耐受量试验，以 了解二种葡聚糖安全应用的剂量范围，为其作为注射剂在动物临床上应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1 材料
1. 1. 1水溶性酵母葡聚糖硫酸化水溶性酵母葡聚糖葡聚糖含量为70%以上， 由本研究室制备(制备方法见实施例1)；羧甲基水溶性酵母葡聚糖葡聚糖含量为90%以 上，购于安琪酵母股份有限公司。
11.2试验动物清洁级昆明小白鼠(体重25 士 2g/只)，由天津医科大学试验动 物中心提供。
1.2 方法
1.2. 1试验分组和试验设计本试验共设7组，其中1 3组、4 6组分别为硫 酸化和羧甲基葡聚糖低、中、高三个剂量试验组(每组10只小白鼠)；第7组为空白对照组 (5只小白鼠)。试验组低、中、高三个剂量，分别为SOmg/只、160mg/只、240mg/只。
2. 2. 2酵母葡聚糖溶液的配制先将硫酸化酵母葡聚糖和羧甲基酵母葡聚糖进行 灭菌处理，然后将硫酸化酵母葡聚糖用无菌注射用水配制成8 %、16 %和M %的水溶液注 射剂备用；将羧甲基酵母葡聚糖配成8%水溶液注射剂备用。
2.2.3给药方法小白鼠给药前停食12h，正常饮水。1 3组和4 6组分别按 SOmg/只、160mg/只、240mg/只给小白鼠腹腔注射硫酸化或羧甲基葡聚糖溶液，每次Iml/ 只，羧甲基葡聚糖中、高剂量组在12h内分2 3次给药。
2. 2. 4临床观察小白鼠注射药物后，观察其外观体征、饮食、行为活动等情况临 床表现及动物死亡情况，并对死亡动物进行病理剖检，记录病变情况。连续观察7d。
2 结果
2.1 二种葡聚糖的溶解性 8% M%硫酸化葡聚糖的水溶液易溶解并溶解良 好，外观为乳白色半透明水溶液；8%羧甲基酵母葡聚糖不易溶解，外观为浅棕色的糊状溶 液。
2. 2 二种葡聚糖小白鼠耐受性试验
2. 2. 1小白鼠临床表现注射二种水溶性葡聚糖的三种剂量组，一周后观察小白 鼠均健活。除注射MOmg/只羧甲基葡聚糖组的小白鼠在注射头2d有的有一定的减食和被毛粗乱现象、3d后即恢复正常外，其他组小白鼠无明显临床症状。
2. 2. 2小白鼠眼观病变小白鼠注射1周后剖杀检查眼观病变，发现注射80mg/ 只、160mg/只硫酸化葡聚糖试验组和注射SOmg/只羧甲基葡聚糖试验组的小白鼠无明显眼 观病变；注射MOmg/只硫酸化葡聚糖试验组和注射160mg/只、240mg/只羧甲基葡聚糖试 验组的小白鼠，有部分小白鼠出现不同程度的脾脏肿大和肾脏、肝脏有出血点等病理变化， 其中注射MOmg/只羧甲基葡聚糖试验组的小白鼠病变程度稍重，个别小白鼠腹腔内还有 少量未吸收的葡聚糖，其他试验组的小白鼠病理变化轻微。二种水溶性葡聚糖比较，注射硫 酸化葡聚糖小白鼠的病变程度比注射羧甲基葡聚糖的小白鼠度轻得多，差异显著。试验结 果见表1-1。
表1-1 二种水溶性酵母葡聚糖最大耐受量试验结果
組别药量老鼠眼观病变#未吸收存活数致死率(mg/只)总数无轻微中等完全(只)(%)硫酸801010000100化葡160109]00100聚糖240108200100羧甲80109100100基葡160102710100聚糖L 240101453100空闩生理 盐水5500050
眼观病变#无无肉眼可见病变；轻微脾脏有一定肿大或不肿大，肾脏、肝脏有少 量出血点；中等脾脏肿大明显或有一定肿大，肾脏、肝脏有较多出血点。
3小结和讨论
3. 1因为羧甲基葡聚糖溶解性差，其水溶性液体为假塑性糊状物，最高能配成8% 溶液，故限制了其在小白鼠的用药浓度，本试验设计最高用药浓度MOmg/只，在Ia1内分三 次给小白鼠注射，每次Iml/只。
3. 2试验结果表明注射MOmg/只二种葡聚糖的小白鼠除有不同程度的眼观病变 外，但均未引起小白鼠的死亡。说明小白鼠对硫酸化葡聚糖和羧甲基葡聚糖最大耐受量至 少在MOmg/只以上，即注射剂量最大耐受量在9. 6g/kg以上。
3. 3由于酵母葡聚糖腹腔注射无法测出其半数致死量(LD5tl)，根据卫生部《新药审 批办法》及其补充规定“因浓度或给药体积过大，无法测出LD5tl时，可给予动物能够接受的 最大浓度下最大体积进行测定”，进行酵母葡聚糖最大耐受性的测定，同时参照石玲等壳聚 糖急性毒性试验的用量，计算出羧甲基葡聚糖小白鼠腹腔注射的最大给药量至少为MOmg， 相当于人临床用药量的360倍，提示该药无毒。
试验二、水溶性酵母葡聚糖对牛源金葡菌、停乳链球菌和大肠埃希菌的体外抑菌 试验
本试验研究了硫酸化和羧甲基葡聚糖对牛源性金葡菌、停乳链球菌和大肠埃希菌 的体外抑菌效果，为二种葡聚糖作为注射剂在动物临床上应用提供科学依据。
1材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1水溶性酵母葡聚糖硫酸化葡聚糖，本研究室自制(制备方法见实施例1)； 羧甲基葡聚糖，购于安琪酵母股份有限公司；氨苄青霉素药敏片，购于杭州微生物试剂有限 公司。
1. 1.2供试菌株牛源金黄色葡萄球菌(简称金葡菌C56010)、停乳链球菌 (C55935)和大肠埃希菌(C83919)，购自于中国兽药监察所菌种保藏管理中心。
1. 1. 3培养基普通肉汤，普通琼脂、血液琼脂、M-H培养基等。
1. 2 方法
1. 2. 1抑菌纸片的制备用无菌蒸馏水将二种葡聚糖分别配成80mg/mL(硫酸化 葡聚糖)或40mg/mL (羧甲基葡聚糖)的水溶液，再用二倍稀释法得到40mg/mL、20mg/mL、 10mg/mL、5mg/mL、2. 5mg/ml、l. 25mg/ml 5 6个系列浓度的稀释液，按常规方法制成药敏片备用。
1. 2. 2菌液的制备将牛源金葡菌、停乳链球菌和大肠埃希菌分别先接种在普通 琼脂或血液琼脂平板上，于37°C培养Mh，挑选三种菌的典型菌落分别接种于肉汤中，经 37°C培养1 左右，然后用麦氏比浊法分别进行计数，最后将菌液稀释至IO7 IO8CFU备用。
1. 2. 3药敏试验采用纸片扩散法，二种葡聚糖的体外抑菌试验按如下方法分别 进行
1. 2. 3. 1细菌接种用灭菌的拭子分别沾取已稀释好的三种细菌的菌液，在管壁 上挤压去多余液体，在M-H琼脂平板上向一个方向均勻涂布，然后将平皿转动600角，再涂 布一次，共三次，最后沿平板边缘涂布一周。每种菌接种2个平板，分别做二种葡聚糖的抑 菌试验。
1. 2. 3. 2药敏片的放置接种M-H琼脂平板加盖后放置5分钟，待平皿面稍干，用 镊子将不同浓度葡聚糖制备的药敏片平放在M-H琼脂平板上，并轻压使其紧贴在平板表 面，金葡菌同时用抗革兰氏阳性菌的氨苄青霉素药敏片作为对照。贴好纸片的平板置于 37°C培养12 16h，观察结果。
1. 2. 4抑菌效果的观察三种菌在M-H琼脂平板上培养12 16h，用卡尺量取药敏 试验的抑菌圈直径，并记录。
2 结果
抑菌试验结果表明二种水溶性葡聚糖在体外能抑制金葡菌的生长，其抑菌浓度 为2. 5mg/ml 40mg/ml ；但二种水溶性葡聚糖无论哪个浓度对停乳链球菌和大肠埃希菌均 无抑菌作用(见表2-1)。
表2-1 二种水溶性葡聚糖的抑菌结果(mm)


本发明公开了一种兽用酵母葡聚糖注射液，旨在提供一种动物用免疫增强剂，它是由酵母葡聚糖经化学修饰法制备而成，是一种纯天然绿色兽药产品。每100ml注射液含硫酸化或羧甲基水溶性酵母葡聚糖2～24g，其余为注射用水。使用本发明的注射液可非特异性增强兔、猪、羊、奶牛等动物的免疫功能，提高动物的抗感染力。本发明的制剂为注射液，无任何毒副作用、无残留、使用方便，符合当前“绿色产品”发展要求等优点。