专利名称：一种深冷冻酸奶发酵剂及其制备方法酸奶具有丰富的营养价值和良好的保健功能，易于消化吸收，含有活性乳酸菌，能够释放活性酶类和维生素B类等营养物质，具有增加体内维生素的含量，抑制有害菌生长， 调节肠道内微生态平衡，提高人体免疫能力的功能。酸奶产量每年以较高的速度递增，已经成为人们喜欢的第一大发酵乳制品。酸奶发酵剂是制作酸奶所用的微生物菌种。发酵剂在酸奶生产过程中的作用非常重要，是酸奶产酸、产粘和产香的基础，是决定酸奶品质的关键因素。传统的酸奶发酵技术是以乳制品为原料经保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等传代发酵，由于菌种在传代过程的比例失衡，菌种特性丢失以及污染菌扩增等原因，引起酸奶产品质量不稳定，直投式酸奶发酵剂有效的解决了上述问题。然而目前直投式酸奶发酵剂产品制备工艺繁琐、价格较贵，通过工艺控制和改进，开发低成本高活性的直投式酸奶发酵剂很有必要。
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷而提供一种酸奶发酵剂，该发酵剂发酵活性强，在生产酸奶或发酵乳制品时可以直接接种，无须中间的继代培养过程， 使用方便，发酵产品质量稳定；此外，本发明还要提供该发酵剂的制备方法。本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。—种深冷冻酸奶发酵剂，所述发酵剂中含有益生菌和保护剂，所述益生菌中含有德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的重量比为1 1 100。上述深冷冻酸奶发酵剂，所述益生菌中还含有动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌，其用量为德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌总重量的0.1 1倍。上述深冷冻酸奶发酵剂，所述保护剂由下列成分配比而成甘露醇0. 1%、 蔗糖2% 10%、海藻糖觊 5%、脱脂奶粉5 30%、吐温80 0. 1 % 2%、余量为水。上述深冷冻酸奶发酵剂，所述保护剂由下列成分配比而成甘露醇0.5%、蔗糖 2%、海藻糖5%、脱脂奶粉20%、吐温80 0. 3%、余量为水。上述深冷冻酸奶发酵剂，所述保护剂与益生菌的重量比为0. 1 30 1. 0 5. 0。一种制备所述深冷冻酸奶发酵剂的方法，它包括如下步骤a.配制培养基培养基中各组分配比为乳糖1 3%、蛋白胨0. 5 2%、水解酪蛋白 0. 1% 5%、酵母膏 5%、柠檬酸二铵0. 5 2%、K2HPO4 0.01 0.2%、无水乙酸钠 0. 1 0. 5%、余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH为6. 0 7. 0，配置好后备用；b.培养益生菌将益生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种按照5%的接种量接入步骤a所得培养基中，在温度30 40°C下培养10 30小时，再保持温度进行发酵培养10 30小时，然后在10 20°C放置2 6小时，得益生菌发酵液，备用；c.离心处理将步骤b所得益生菌发酵液在4 10°C，流量为2000ml 6000ml/分钟条件下，进行管道式离心，得益生菌菌泥，备用；一般菌泥得率为10 50g/L ；d.添加保护剂配制保护剂并将其在115°C灭菌15分钟并冷却至10°C，将保护剂与步骤c所得益生菌菌泥混合混勻，得乳化液，备用；e.菌株复配将同法制得的益生菌嗜热链球菌乳化液与益生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液以质量比为1 :1比例混合均勻，得组合乳化液；f.速冻成型将步骤d所得组合乳化液在速冻成粒机中以15-20kg/h的产量用-196°C 液氮速冻3 min成均勻的低温小颗粒，得深冷冻酸奶发酵剂。上述制备方法，所述益生菌中混配入动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌；混配时，将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌按照步骤a至d的步骤制备乳化液，将所得动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌乳化液与嗜热链球菌乳化液与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液混合均勻，得组合乳化液即可。上述制备方法，所述益生菌在培养基中培养时，接种量为39Γ5%，所得发酵液菌泥得率为为10 50g/L。本发明采用了深冷冻低温颗粒形式，发酵活性较冻干菌粉发酵剂强，在生产酸奶或发酵乳制品时可以直接接种，无须中间继代培养，使用方便，发酵产品质量稳定，生产成本低。本发明所述制备方法采用了可促进菌种高密度培养的培养基，实现了菌体的高密度收集，菌体纯度高，发酵活性高，4小时pH可以达到4. 5以下，活菌数达2^101° cfu/g以上； 本发明采用管道式离心处理方式，菌体收集率高，对菌体的损伤小，菌种活力高，性能稳定； 本发明通过速冻成型工艺，提高了乳酸菌存活力，进而提高发酵剂产品的发酵活性，并且缩短了发酵剂生产周期，大大降低了产品的生产能耗成本。产品发酵活性从4h达到pH4. 8提高到4h达到pH4. 4 4. 5 ；同时，提高了产品溶解性，用目测观察溶解时间，本发明在水中轻轻摇勻即可溶解。

a.配制培养基，培养基配比为乳糖2%，蛋白胨1 %，水解酪蛋白2 %，酵母膏1 %，柠檬酸二铵2%,K2HPO4 0. 05% (超出K2HPO4 0. 01 0. 2%的范围)，无水乙酸钠0. 5%、余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH6. 0 7. 0，备用；
b.培养益生菌将德氏乳杆菌保加利亚亚种按照5%的接种量接入步骤a所得培养基中、30°C培养10小时，再保持温度进行发酵培养10小时，然后10°C放置2小时，得德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵液，备用；
c.离心处理将步骤b所得德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵液在4°C，流量为2000ml/分钟条件下，进行管道式离心，得德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥，备用；
d.添加保护剂配制保护剂甘露醇0.1%，蔗糖3%，海藻糖5%，脱脂奶粉5%，吐温800. 1%，余量为水，将保护剂在115°C灭菌15分钟并冷却至10°C，按照德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥与保护剂重量比为1.0 10的比例混合混勻，得德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液 (IOOg/每升发酵液)，备用；
e.菌株复配将同法制得的嗜热链球菌乳化液(80g/每升发酵液)与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液以质量比为1:1比例混合均勻，得组合乳化液；
f.速冻成型将乳化液在速冻成粒机后以15-20kg/h的产量用-196°c液氮速冻成均勻的低温小颗粒，得深冷冻酸奶发酵剂，直径0. 2-1. 0 cm。实施例2
a.配制培养基培养基配比为乳糖1%，蛋白胨1.5%，水解酪蛋白1%，酵母膏 1.5%，柠檬酸二铵1.5%，K2HPO4 0.15%，无水乙酸钠0. 2%，余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH6. 0 7. 0，备用；
b.培养益生菌将德氏乳杆菌保加利亚亚种按照5%的接种量接入步骤a所得培养基中、40°C培养30小时，再保持温度进行发酵培养30小时，然后20°C放置6小时，得德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵液，备用；
c.离心处理将步骤b所得德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵液在10°C，流量为3000ml/ 分钟条件下，进行管道式离心，得德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥，备用；
d.添加保护剂配制保护剂甘露醇0. 2%，蔗糖1. 8%，海藻糖5%，脱脂奶粉8%，吐温80 0. 15%，余量为水，将保护剂在115°C灭菌15分钟并冷却至10°C，按照德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥与保护剂重量比为1.0 10的比例混合混勻，得德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液 (IOOg/每升发酵液)，备用；
e.菌株复配将同法制得的嗜热链球菌乳化液(85g/每升发酵液)与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液以质量比为100:1比例混合均勻，得组合乳化液；
f.速冻成型将乳化液在速冻成粒机后用液氮速冻成均勻的低温小颗粒，得深冷冻酸奶发酵剂，直径0.2-1.0 cm。实施例3
a.配制培养基，培养基配比为乳糖2.2%，蛋白胨0.8%，水解酪蛋白0.18% ,酵母膏1. 6%，柠檬酸二铵1. 6%,K2HPO4 0. 03%，无水乙酸钠0. 3%，余量蒸馏水，用NaOH溶液调节PH6.0 7.0，备用；
b.培养益生菌将德氏乳杆菌保加利亚亚种按照5%的接种量接入步骤a所得培养基中35°C培养20小时，再保持温度进行发酵培养20小时，然后15°C放置4小时，得德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵液，备用；
c.离心处理将步骤b所得德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵液在7°C，流量为4000ml/分钟条件下，进行管道式离心，得德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥，备用；
d.添加保护剂配制保护剂甘露醇0.3%，蔗糖2. 6%，海藻糖5%，脱脂奶粉8. 5%，吐温80 0. 5%，余量为水，将保护剂在115°C灭菌15分钟并冷却至10°C，按照德氏乳杆菌保加利亚亚种菌泥)与保护剂重量 比为1.0 50的比例混合混勻，得德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液(IOOg/每升发酵液)，备用；
e.菌株复配将同法制得的嗜热链球菌乳化液(85g/每升发酵液)与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液以质量比为100:1比例混合均勻，得组合乳化液；同法制得动物双歧杆菌乳化液(1 50g/每升发酵液)，备用； 同法制得嗜酸乳杆菌乳化液(85g/每升发酵液)，备用； 同法制得干酪乳杆菌乳化液(170g/每升发酵液)，备用； f.菌株复配及速冻成型
(1)将动物双歧杆菌乳化液与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液、嗜热链球菌乳化液混合均勻，得组合乳化液，动物双歧杆菌乳化液质量为德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液和嗜热链球菌乳化液总质量的0. 1倍；
将组合乳化液经过速冻成粒机后以15-20kg/h的产量用-196°C液氮速冻成均勻的低温小颗粒，得深冷冻酸奶发酵剂，直径0. 2-1. 0 cm。(2)将嗜酸乳杆菌乳化液与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液、嗜热链球菌乳化液混合均勻，得组合乳化液，嗜酸乳杆菌乳化液质量为德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液和嗜热链球菌乳化液总质量的1倍；
将组合乳化液经过速冻成粒机后以15-20kg/h的产量用-196°C液氮速冻成均勻的低温小颗粒，得深冷冻酸奶发酵剂，直径0. 2-1. 0 cm。(3)将干酪乳杆菌乳化液与德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液、嗜热链球菌乳化液混合均勻，得组合乳化液，干酪乳杆菌乳化液质量为德氏乳杆菌保加利亚亚种乳化液和嗜热链球菌乳化液总质量的0. 5倍；
将组合乳化液经过速冻成粒机后以15-20kg/h的产量用-196°C液氮速冻成均勻的低温小颗粒，得深冷冻酸奶发酵剂，直径0. 2-1. 0 cm。实施例4
a.制备全脂复原乳将120g全脂奶粉加入到820ml水中水合均勻，与60g蔗糖混合后溶解，并升温至60°C，在20MPa下均质，然后在95°C下灭菌5min，后冷却至42°C，得到杀菌全脂复原乳，并用PH计测定杀菌全脂复原乳初始PH值。b.接种与发酵活力检测准确称量实施例1中所制备的深冷冻酸奶发酵剂0. 15g， 加入到步骤a所得的42°C杀菌全脂复原乳中，搅拌均勻后在42°C下发酵4h后得到发酵酸奶。随后用搅拌器将发酵酸奶迅速用搅拌均勻，并用PH计测定发酵酸奶pH值。经测定，所制备的发酵酸奶在发酵4h时pH值从初始的6. 61降低至4. 46，发酵活力优良。实施例5
a.配制MRS计数培养基培养基配比为葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，牛肉粉0.5%， 酵母粉0.4%，吐温-80 0.1%，柠檬酸三铵0.2%，K2HPO4 0.2%，无水乙酸钠0.5%， MgSO4 · 7H20 0. 02%, MnSO4 · 4H20 0. 0005%，琼脂粉 1. 5%，余量为蒸馏水，用 NaOH 溶液调节 ρΗ6· 2 6. 4，121°C 灭菌 15min，备用；
b.深冷冻酸奶发酵剂样品的稀释在超净台中准确称量实施例1中所制备的深冷冻酸奶发酵剂5g至盛有45mL灭菌生理盐水的无菌三角瓶内，振荡器振荡均勻，制成1:10的样品勻液。用ImL无菌吸管吸取1 10样品勻液lmL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，用振荡器振荡均勻，制成1:100的样品勻液。另取ImL无菌吸管，按上述操作顺序， 做10倍递增样品勻液，每递增稀释一次，即换用1次ImL灭菌吸管。c.混菌计数选择适宜的2 3个稀释度的样品勻液，分别吸取ImL于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，吸取ImL空白稀释液加入3个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL 20mL冷却至50°C 士5°C的MRS计数培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均勻。d.菌体培养待琼脂凝固后，将平板倒置，用封口膜将平皿周围密封，36°C 士 1°C 厌氧培养48h。

e.菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量，每个稀释度的菌落数采用3个平板的平均数。经测定，实施例5所制得的深冷冻酸奶发酵剂样品的活菌数为3. 19X 101(lCfU/g。


一种深冷冻酸奶发酵剂及其制备方法，所述发酵剂中含有益生菌和保护剂，所述益生菌中含有德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌，其重量比为1∶1～100。本发明还给出了发酵剂的制备方法。它采用深冷冻颗粒形式，能够大大降低产品成本，具有发酵活性强，在生产酸奶或发酵乳制品时可以直接接种，无须中间继代培养的过程，使用方便，发酵产品质量稳定等特点。