专利名称：含有三桠乌药提取物作为有效成分的改善血液循环的组合物的制作方法人类具有治疗伤ロ部位及避免血液损失的活体系统,其由称作血小板和血浆的凝固、纤维素分解以及凝固抑制的复杂过程的调节和均衡形成。但是，由于各种因素这种平衡状态被打破时，血液的流动会受到阻碍，从而产生血栓疾病，组织功能产生障碍。 血栓形成(thrombosis)是指由于血管内侧产生块或血栓，从而堵塞血液流通。血管受到损伤时，血管会收缩，由于血小板会粘附在向伤ロ部位露出的胶原纤维(collagen gibrers)上，从而释放作为血管收缩物质的血清素(serotonin)、ニ磷酸腺式(adenosine diphospha te, ADP)以及血栓素(Thromboxane)A2。ADP 使更多的血小板粘附，血栓素A2的作用为使血小板凝集，从而使血管收缩。通过这样的一次性止血后，形成血液凝固作用(blood coagulation)。止血后产生的纤维蛋白(fibrin)通过纤维素溶解作用(fibrinolysis)而溶解,组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tissue-type plasminogenactivator, t_PA)和尿激酶(Urokinase,UK)起到将血纤维蛋白溶酶原(plasmi nogen)转换成血纤维蛋白溶酶(plasmin)并分解纤维蛋白的作用。在正常的情况下，这样的血液凝集(blood coagulation)和纤维素分解(fibrinolysis)保持均衡,但当这种均衡被打破的情况下，血管内会产生纤维素块沉积并产生由血液循环障碍而引起的血栓形成((蓝思汉M.，胸腔，2003 年 9 月;124 :33S_9S (Nesheim Μ.，Chest.，2003 Se p ; 124 :33S_9S))。血栓形成引起动脉血栓形成(atherothrombotic diseases)、静脉血栓形成(Phlebothbombosis)、门浄脉血栓形成(hepatic protal vein t hrombitis)、肺动脉栓塞(Pulmonary thromboembolism)、慢性浄脉缺血(chronic limb ischemia)、浄脉曲张(Varicose vein)、深浄脉血栓形成(deep vein thrombosis diseases)、心绞痛(anginapectoris)、脑梗塞(cerebral infarction)、脑出血(cerebral hemorrhage)等，还会引起感染或血管损伤、术后并发症以及凝固性疾病等。现今，在血栓疾病的预防与治疗中，正在使用的有抗血小板剂、抗凝固剂以及对形成的血栓进行治疗的血栓溶解剂等。具代表性的抗血小板剂阿司匹林虽然具有优异的效果，但已知其会引起胃肠道出血和消化性溃疡等副作用。并且，除此之外的用作抗凝固剂或高止血症治疗剂的药物大部分不能ロ服，并且对血栓的选择性低，如长期服用会出现溶血现象、免疫反应、发热、过敏等多种副作用。不但具有这些副作用，效果微乎其微，而且这些市售的治疗剂的价格非常昂贵，从而产生了患者使用困难的问题。因此，迫切需要开发出血小板的活化、抑制凝固以及血栓溶解活性等对于阻碍血栓生成具有很高的选择性，并且使副作用最小化的治疗剂。另一方面,三極乌药(Lindera obtusiloba)为樟树科的落叶灌木。高2_3m左右、开花期为3-4月，结果期为9月。果实榨油后，用作女土用的头油。摘下叶子或树枝会有生姜味道，因此称为生姜树，也被称为假冬柏或黄梅木。具有活血、疏筋、消肿等功效，已知可以治疗擦伤淤血肿痛，主要是捣碎后敷在伤ロ部位。主要用于腹痛，也用作退烧药与咳嗽药。在民间作为退烧药或咳嗽药，将叶子和苗像茶一样用热水泡开后饮用(大韩植物图鉴，李昌复1980 ;韩国民间药图鉴，朴忠熙2005，乡药大辞典)。在三桠乌药成分的研究中，权学哲等(配药学研究档案，22，第417-422页，1999 (Archives of Pharmacal Research,22, ρ· 417-422,1999))分离了阿提福林(actifolin)、新木脂体柄果脂素(pluviatilol) >5,6- ニ氢罗汉松树脂酹(5,6-dihydromatairesinol)、(+)- 丁香脂素((+)-syringaresinol)、反式麦鉄-ニ甲氧基落叶松树脂醇(9-0-trans-feruloy 1-5, 5-dimethoxylariciresinol)等。报导有分离的成分具有杀死癌细胞的作用、抗炎作用等功效(药用植物，69，610-616，2003 ;配药学研究档案，22,第 417-422 页，1999 (Planta Medica,69,610-616, 2003 ；Archives of PharmacalResearch,22, p.417-422,1999))。 在上述文献中，对于三桠乌药提取物的阻碍血小板凝集、阻碍血栓生成、以及治疗及预防效果没有任何的公开或教示。
要解决的技术问题本发明人以多个植物提取物作为对象，对血液循环改善剂进行研究后发现三桠乌药提取物具有非常优异的阻碍血小板凝集、阻碍活体内血栓生成、以及预防功效，从而完成了本发明。本发明是基于上述发现而获得，其目的在于，提供含有三桠乌药提取物作为有效成分,并且通过改善血液循环来用于预防及治疗血栓疾病的药物组合物。本发明的再一目的在于，提供含有三桠乌药提取物作为有效成分的用于预防及治疗血栓疾病的健康功能食品。技术方案为了实现上述目的，本发明的通过改善血液循环的用于预防及治疗血栓的组合物的特征为，含有三桠乌药提取物作为有效成分。并且，所述三桠乌药提取物优选提取自树枝、叶子或它们的混合物。并且，所述三桠乌药提取物优选使用选自水、C1至C5的低级醇及它们的混合物中的溶剂进行提取。并且，所述C1至C5的低级醇优选为甲醇、こ醇或丁醇。并且，所述三桠乌药提取物优选使用30至95重量％的こ醇水溶液进行提取。并且，所述三桠乌药粗提物优选在30至95°C下提取。并且，优选地，所述三桠乌药提取物使用选自水、C1至C3的低级醇及它们的混合物中的溶剂进行提取后，用丁醇进行再次提取。并且，优选地，所述三桠乌药提取物为使用选自水、C1至C3的低级醇及它们的混合物中的溶剂进行提取及浓缩并获得粗提物后，将所述粗提物悬浮于水中，然后按照己烷、こ酸こ酯及丁醇的顺序进行再次提取。并且，优选地，所述粗提物和水按照I : 5 25的体积比进行混合悬浮。此外，所述三桠乌药提取物的特征为，其具有阻碍血小板凝集作用。此外，所述三桠乌药提取物的特征为，其具有阻碍活体内血栓生成的活性。此外，所述血栓疾病选自动脉血栓形成、静脉血栓形成、门静脉血栓形成、肺动脉栓塞、慢性静脉缺血、静脉曲张、深静脉血栓形成、心绞痛、脑梗塞、脑出血、术后血管并发症及凝固性疾病。另ー方面，本发明的通过改善血液循环来用于预防血栓疾病的健康功能食品的特征为，含有三桠乌药提取物作为有效成分。 如上所述，本发明的三桠乌药提取物不仅对试管内通过多种的凝集诱导而诱导的血小板凝集具有优异的阻碍效果，而且对活体内急剧的血栓生成具有优异的阻碍效果，因此，可有效地用于预防和治疗血液循环障碍引起的疾病，如血栓栓塞等。图I为使用胶原蛋白作为血小板凝集诱导剂的情况下，对本发明一个实施例的提取物的血小板凝集阻碍效果进行比较的图。图2为使用ADP作为血小板凝集诱导剂的情况下，对本发明一个实施例的提取物的血小板凝集阻碍效果进行比较的图。图3为对三桠乌药提取物的细胞毒性程度进行測定的图。

本发明的含有三桠乌药提取物的组合物还可以包含制备组合物时通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。本发明提取物的医药学给药形态可以使用药学上允许的盐的形态，或者可以单独或与其它药学活性化合物进行结合或以集合形态使用。含有本发明的提取物的药物组合物可以使用通常的方法制剂化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆、气溶胶等经ロ给药剂型、外用药、栓剂及灭菌注射溶液。含有提取物的组合物中可以包含的载体、赋形剂及稀释剂例如有，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸氢钙、磷酸ニ氢钙、磷酸氢钠、磷酸ニ氢钠、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚こ烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酷、羟苯丙酷、滑石、硬脂酸镁及矿物油。在制剂化的情况下，使用通常使用的填充剂、増量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制备。用于经ロ给药的固体制剂中包括片剂、丸剂、散剤、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂至少混合ー种以上的如淀粉、碳酸I丐(calciu m carbonate)、鹿糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶、微晶纤维素等赋形剂来制备。此外，除了单纯的赋形剂之外，也可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剤。作为经ロ给药的液体制剂有悬浮液、内溶液剂、乳剤、糖浆剂等，可以含有通常使用的单纯稀释剂水、流动石蜡外，还可以含有如润湿剂、甜味剂、芳香剤、防腐剂等赋形剂。用于非经ロ给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剤、悬浮剂、乳剤、冷冻干燥制剂及栓剂。非水溶剂、悬浮剂可以使用如丙ニ醇(P ropylene glycol)、聚こニ醇、橄榄油等植物性油、油酸こ酯等可以注射的酷等。栓剂的基质可以使用饱和脂肪酸混合物的甘油酉旨(ffiteps ol)、聚乙ニ酉享(macrogol)、吐温(tween)类、可可脂、水石梓(la urinum)、甘油明月父等。本发明的提取物的优选给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药路径及期间而不同，但本领域技术人员可以适当地选择。但是，为了获得优选效果，本发明的提取物的优选给药量为I日0. 0001 100mg/kg，更有选为0. 001 100mg/kg。给药可以一天给药一次，也可以分多次给药。上述给药量在任何方面都不会限定本发明的范围。本发明提供含有对血栓疾病起到预防效果的所述提取物及食品学上允许使用的食品辅助添加剂的健康功能食品。
可添加所述三桠乌药提取物的健康功能食品例如有各种一般食品类、饮料、ロ香糖、茶叶、维生素复合剂等。此外，以预防血栓生成为目的，所述三桠乌药提取物可加入到食品或饮料中。此时，食品或饮料中的所述提取物的加入量可以为食品总重量的O. 01 15重量％，以IOOg健康饮料组合物为基准，可以按照O. 02 5g的比例加入,优选以O. 3 Ig的比例加入。本发明的健康功能性饮料组合物除了按照所指示的比例含有作为必需成分的上述提取物外，对于其它的成分没有特别限制，可以同通常的饮料一祥含有各种香味剂或天然碳水化合物等附加成分。上述天然碳水化合物的例子有如葡萄糖、果糖等单糖；如麦芽糖、蔗糖等ニ糖；以及多糖，如糊精、环糊精等一般的糖以及木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇。除了上述之外，作为香味剂还可以有利地加入作为天然香味剂的奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物，例如甜菊糖A、甘草甜素等；以及合成香味剂，例如糖精、阿斯巴甜等。上述天然碳水化合物的比例为每IOOg本发明的组合物中约为I 20g，优选地，约为5 12g。 除了上述之外，本发明的提取物还可以含有各种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成及天然风味剂、着色剂及填充剂(奶酪、巧克カ等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质增粘齐 、PH调节齐IJ、稳定齐 、防腐齐 、甘油、醇、用于碳酸饮料中的碳酸化剂等。除此之外，本发明的提取物还可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。可以对这些成分进行单独或组合使用。此时，添加剂的比例虽然不是很重要，但一般优选为每IOOg本发明的提取物中约为O. 01 20重量份。下面，通过实施例及试验例对本发明进行更加具体的说明。实施例实施例I :三桠乌药耜提物的制备将在江原道地区采摘的三桠乌药树枝和叶子用水清洗，以去除异物和盐分，然后干燥后粉碎，在提取容器中分别加入25g的树枝和25g叶子，然后加入总量为500mL的70重量％的こ醇水溶液，进行回流冷却并在70°C下进行3小时，进行加热提取，重复3次。然后用滤纸过滤，将该滤液在40°C的水浴中进行减压浓缩及冷冻干燥，从而获得6. 4g的三桠乌药残枝粗提物及7. Og的三桠乌药叶子粗提物。实施例2 :三桠乌药耜提物的流分物的制备将实施例I中获得的三桠乌药5g叶子与5g树枝各自的粗提物悬浮于50mL的精制水中，然后按照顺序加入50mL的己烷、こ酸こ酯及正丁醇，进行溶剂分流，各实施3次溶剂分流后，获得了各个溶剂流分，将其进行减压浓縮，从而获得三桠乌药的己烷、こ酸こ酯及正丁醇流分物。试验例I :三桠乌药提取物的阻碍血小板凝集的效果测定1-1.准备实验动物及清洗的血小板(washed platelet)将大鼠(rat)用こ醚(ethyl ether)麻酔，用含有O. 15M的朽1檬酸钠(sodiumcitrate)的注射器从腹动脉进行采血，使柠檬酸钠与血液的比例为I : 9 (v/v)。富血小板血衆(Platelet rich plasma, PRP)是在200xg下进行10分钟离心分离获得上清液的PRP,继续在800xg下进行15分钟的离心分离,然后用清洗缓冲液(清洗缓冲液(w ashingbuffer), 137mM NaCl、2. 9mM KClUmM MgCl2、5mM葡萄糖、12mM NaHC03、0. 34mM Na2HPO4UmMEDTA、20mM H EPES、0. 25% BSA, pH7. 4)对沉淀的血损清洗2次，然后在悬浮缓冲液(悬浮缓冲液，137mM NaCl、2. 9mM KClUmM MgCl2,5m M葡萄糖、12mM NaHC03、0. 34mM Na2HPO4,20mMHEPES、0. 25%BSA、pH 7.4)中悬浮后，准备了清洗的血小板。使用用于测定血小板凝集阻碍能力的清洗血小板细胞计数器(细胞计数器，He ma-vet HV950FS, Drew scientific公司，美国)对血小板计数，用缓冲液稀释，调整血小板为3xl08血小板/mL。由于血小板在低温下凝集，因此上述实验是在常温下进行的。1-2.血小板凝集程度测定大鼠的血小板凝集阻碍能力是使用凝集计(Chixmo-Log有限责任公司，哈弗敦，宾夕法尼亚州，美国)，采用浊度測定法进行測定的。将清洗的血小板在37°C下培养3分钟后，按照浓度用试样进行处理，2分钟后，用诱导血小板凝集的物质ADP (22 μ Μ)和胶原蛋白(20yg/mL)诱导凝集，測定10分钟后，计算了阻碍程度。将没有用试样进行处理的作为对照组，用下述方法求得。表I三桠乌药提取物的血小板凝集阻碍效果



本发明涉及含有三桠乌药提取物作为有效成分的改善血液循环的组合物，更详细地，涉及含有三桠乌药提取物作为有效成分的通过改善血液循环来预防及治疗血栓疾病的药物组合物及保健食品。本发明的三桠乌药提取物及粗纯化物(crude purified product)可以使用水、乙醇、甲醇、丁醇等多种溶剂进行提取而获得。提取物及粗纯化物不仅对试管内通过多种凝集诱导而诱导的血小板凝集具有优异的阻碍效果，而且对活体内急剧的血栓生成具有优异的阻碍效果，因此，可有效地用于预防和治疗血液循环障碍引起的疾病，如血栓栓塞等。