专利名称：一种快速筛选耐热性β-葡聚糖酶生产菌的方法在啤酒工业中，国外一些国家已经采用￠-葡聚糖酶作为主要酶制剂之一。过量的葡聚糖是造成啤酒不稳定的重要原因，引起啤酒雾状浑浊和凝胶沉淀。从￠-葡聚糖酶的存在来源分析，它是降解淀粉胚乳细胞壁的主要参与者，与麦芽浸出率有关。麦芽糖化时加入￠-葡聚糖酶可分解其中的￠-葡聚糖凝胶，糖化麦芽汁，降低粘度，减少啤酒中凝胶状沉淀物，提高啤酒制造中麦汁的滤速及得率，从而有利于改善啤酒风味，提高啤酒质量。在以麦类为饲料原料的动物养殖中，P -葡聚糖在动物肠道中会形成粘稠物质影响动物对营养物质吸收，被称为抗营养因子。￠-葡聚糖酶通过降解￠-葡聚糖，降低其亲水性和粘性，即降低肠道内容物的粘度，有效改善胃肠道环境及动物对营养物质的吸收效率，提高饲料利用率，去除抗营养因子的作用。￠-葡聚糖酶可以与细菌细胞壁上的受体结合，从而阻止细菌与动物肠粘膜上的糖基结合，保护肠粘膜的结构和功能的完整性，具有抑制有害微生物和维护动物肠道微生态平衡的作用，并减少传统抗生素的使用量。可见在啤酒发酵工业和饲用酶制剂工业中3 -葡聚糖酶都具有重要经济价值，已被公认为有效的饲料添加剂、食品酶制剂。啤酒酿造糖化工艺的高温为70_80°C，饲料造粒的温度一般也在80°C左右。然而，绝大多数￠-葡聚糖酶不能耐此高温。因此，从产￠-葡聚糖酶菌种文库或诱变育种中筛选活性高并耐热性强的3-葡聚糖酶的菌种具有重要意义。对于热稳定性突变体的筛选，目前常用的为96孔板，平板筛选方法和超薄层琼脂板扩散法，但这些方法使用起来不仅费时费力，而且昂贵。由于葡聚糖酶在含有适量刚果红的平板上水解固相中的羧甲基纤维素后可以产生透明圈，因此可以用平板筛选策略。其原理是刚果红与3 -葡聚糖能偶联成红色化合物，30°C培养2-3天后，经由菌落产生的^ -葡聚糖酶分解后颜色变浅，平板上呈现透明圈，刚果红褪色的透明圈直径与酶活性的对数值成正比，从而可根据透明圈的大小及透明度来判断菌株产酶情况。然而，微生物菌种不能在高温下生存，因此要筛选出耐高温的葡聚糖酶来就必须对现有方法进行合理的改进，对筛选流程和条件进行优化。因此，随着0 -葡聚糖酶被越来越多地应用在各个领域中以及对其使用要求的提高，需要一种筛选高温下稳定的￠-葡聚糖酶菌种的方法，为￠-葡聚糖酶的筛选提供新的途经。
挑取单菌落经种子阶段的培养后，按I %接种量接种于装有IOOmL产酶培养基上(产酶培养基(w/V) :4%燕麦粉、1%蛋白胨、氯化钠0.5%，pH自然)的250mL三角瓶中，于28-37°C、150-200r/min培养24-48小时。将菌液经适当稀释后涂布于产酶培养基上，使产酶培养基上形成的菌落数在50个左右时，平板上各菌落的透明圈之间独立、大小适当、形状规则，但当菌落数超过50个以上时，则容易有部分菌落的透明圈连接在一起，这样对判断透明圈的大小易产生干扰。28-37°C继续培养适当时间，4°C放置l_2h，菌落用尼龙膜进行原位转印，原平板继续于培养，以便以后挑取目的菌。原位转印时要将无菌尼龙膜(标记面向下)铺于平板上，并与菌落接触，直至尼龙膜完全浸湿(应防止尼龙膜和琼脂板间产生气泡)，立即以平稳的一次性动作将尼龙膜从琼脂面上揭下(尼龙膜上应做好方位标记)，将尼龙膜的菌落面向上，置于一块新的产酶培养基上，28-37°C下培养适当时间。然后用细胞壁裂解液(25mmol/L Tris-HCl (p H8. 0)，内含 lmg/mL 溶菌酶和 lmmol/L EDTA (pH8. 0))、细胞膜裂解液(10mmol/L Tris-HCl (p H8. 0)，内含 0. 1% (w/v) Triton-X-100)和平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl (p H8. 0))分别浸泡3张滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止菌落被冲散，将尼龙膜正面向上按细胞壁裂解液、细胞膜裂解液、平衡缓冲液的顺序依次置于3张滤纸上，室温分别处理30min。然后将尼龙膜的菌落面向下铺于筛选平板上(筛选培养基的成分如下将15_25g琼脂粉、5g羧甲基纤维素钠和1L0. Imol/L咪唑-邻苯二钾酸氢钾缓冲液混匀并高压灭菌，加入2. 5mL氨苄青霉素后倒平板)。筛选时孵育温度为28-75°C、时间为l_3h。揭去尼龙膜，在平板上加入适量0. 1%刚果红显色15min,弃去刚果红,再向平板中加入适量lmol/LNaCl脱色15min,观察透明圈的情况。挑选透明圈与菌落比值较大的菌落作为耐热菌株来选择。从最终的效果来看，本文所建立的方法快捷、准确、可操作性强，可以适用于一般胞内耐热多糖水解酶产生菌的筛选。本发明公开了一种筛选β-葡聚糖酶生产菌的方法。所述方法是由于β-葡聚糖酶在含有适量刚果红的平板上水解固相中的羧甲基纤维素后可以产生透明圈。由于微生物菌种不能在高温下生存，菌落用尼龙膜进行原位转印，原平板继续培养，以便以后挑取目的菌。在筛选培养基上，带有不同菌落的尼龙膜可在较高温度下孵育，挑选透明圈与菌落比值较大的菌落作为耐热菌株来选择。本发明的方法可进行高通量筛选，结果准确易辨。