专利名称：Cav-1稳定低表达的SMMC-7721细胞系及其构建方法窖蛋白(Caveolin)是构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白，由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-I(Cav-I)基因是Caveolin基因家族的成员之一，是caveolae的主要结构成分，参与许多细胞过程调节，包括细胞信号传导的调控等。在乳腺癌中，Cav-I与ERa 36相互作用调节的膜起始雌激素信号通路可以控制乳腺细胞转化；在神经细胞中，Cav-I蛋白与动物发育和学习记忆密切相关，可能参与中枢可塑性的调节。Cav-I在一定时期分化的成纤维细胞，脂肪细胞，内皮细胞中高度表达。有证据证明Cav-I在成纤维细胞中扮演着肿瘤抑制器的角色。肿瘤的发生是一个长期的、分阶段的、多种基因参与的复杂过程。众多研究表明Cav-I在正常组织中高表达，而在乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌和结肠癌中表达明显下降，在甲状腺滤泡状癌中甚至无表达。但同时也有研究发现Cav-I在某些肿瘤组织中呈高表达，如Yang等研究发现在大鼠正常前列腺上皮细胞中Cav-I表达微弱；在原发性前列腺癌细胞中其表达加强。相关文献显示Cav-I是肝再生所必需的蛋白质，在脂滴和新生细胞膜的形成中发挥着重要作用。肝细胞中的Cav-I可能同样参与细胞的增殖调控及癌变过程。由此可见Cav-I与肿瘤的发生、发展、临床表现及治疗均有关系。但目前有关Cav-I在肝癌细胞中的作用及其机制尚未完全阐明。原因之一可能是肝癌细胞中内源性的Cav-I具有干扰作用。因此消除内源性的Cav-I的干扰将会为研究Cav-I在肝癌中的作用创造有利条件。已有文献报道的Cav-I低表达的肝癌细胞有两个来源。一种是通过构建人Cav-IRNA干扰慢病毒载体的方式转染人肝癌细胞株SMMC-7721，稳定转染SMMC-77215天后，对其Cav-ImRNA表达水平的敲除率达90%。另一种是通过脂质体介导的Cav-I反义寡核苷酸瞬时转染SMMC-7721细胞。但至今为止，在人肝癌细胞中尚未见到用siRNA干扰转染质粒的方法通过药物筛选使Cav-I基因沉默的报道。原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内发病率居所有恶性肿瘤第五位，死亡率居第三位，全世界每年新发肝癌中42%出现在我国大陆。因此更好地建立一系列人肝癌细胞系将会为肝癌发病机理的研究和临床治疗提供必要的基础。RNA干扰技术是近年来快速发展起来的一项基因沉默技术，RNA干扰也成转录后基因沉默，是由双链RNAWouble-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。它的出现为分析基因功能和信号传导通路以及基因治疗方面都提供了一种新的研究手段，与传统的反义核酸，基因剔除等技术相比，具有特异性强，针对性强，级联放大等优点。它将会成为攻克肿瘤、心血管病、传染性疾病等疑难顽症最锐利的武器。
本发明的目的旨在提供一种Cav-I低表达的SMMC-7721细胞系的构建方法。本发明采用Cav-ISiRNA干扰技术构建Cav-I稳定低表达的SMMC-7721细胞系，即SMMC-7721KD细胞系。SMMC-7721细胞购自于中国科学院上海细胞库，它来自于一位50岁男性肝癌患者，由第二军医大学董荣春等人建立，贴壁生长，属上皮细胞，具有致瘤性，该细胞的Cav-I表达很1 OCav-I是细胞膜上重要的信号转导因子，对膜上多种生长因子受体和信号通路起调节作用，参与细胞的生长、分化、增殖和肿瘤发生的生理和病理过程。构建Cav-ISiRNA的psiRNA-CAVl干扰质粒，并进行质粒转染SMMC-7721细胞，然后对转染后的细胞进行博莱霉素筛选，传代，建立稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系，沉默SMMC-7721细胞中Cav-I的表达80%左右，并且Cav-I稳定低表达。SMMC-7721KD细胞系可作为模型，进行Cav-I参与的一些肿瘤细胞的研究，Cav-I与肝癌的相关性及其机理研究。本发明通过下述技术方案实现本发明的一方面在于Cav-l稳定低表达的SMMC-7721细胞系的构建方法，包括如下步骤(a)设计对应Cav-I基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 ；(b)构建含有上述碱基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 psiRNA-hHlzeo G2重组质粒；(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC-7721得到的重组细胞株；(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过kocin筛选培养基培养，细胞M小时一次换液，四天传代1次，传至第七代时，Cav-I稳定低表达，第八代细胞扩大培养，并冻存细胞，获得阳性克隆细胞系；其中，上述Wkocin筛选培养基为RPMI-1640培养基加10%新生牛血清，再加 100ug/L Zeocin ；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性克隆细胞株利用Western Blotting方法和/或X射线照射联合平板克隆形成实验法检测。在上述的构建方法中，步骤(b)所述的构建方法包括如下步骤(f)将转录模板核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2在80°C退火2min，自然冷却至35°C得到退火产物；(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与对质粒psiRNA-hHlzeo G2进行Bbs I酶切后的线性化载体在16°C连接，过夜；(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E. coli DH5a后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO :3。本发明的另一方面在于利用上述构建方法所获得的Cav-I稳定低表达的SMMC-7721 细胞系。图1 为载体psiRNA-CAVl的酶切图。其中A为psiRNA-CAVl电泳图，M代表DL2000marker ； 1代表psiRNA-CAVl质粒；B为质粒酶切之后的电泳图，1为环状质粒，2为使用I^st I产生的线性质S^^bp ;3为使用I^st I和EcoR V酶切之后产生的两个片段大约为 1265bp 和 1363bp。图2 为细胞转染后第3代，第5代，第6代，第7代，细胞中Cav-I表达下调的western blot结果图；其中上图为Cav-I和β -actin的western blot结果经X光医学胶片感光图，C代表SMMC-7721对照，3、5、6、7代表SMMC-7721KD传代的代数；下图为对胶片进行计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值(IOD)，反映样品的蛋白量。(β -Actin为内参)。图3 为瞬时转染Cav-IsiRNA质粒，SMMC-7721细胞中Cav-I的表达下降的western blot结果图；其中上图为SMMC-7721对照细胞和SMMC-7721KD细胞经westernblot，Cav-I和β-actin X光医学胶片感光图，下图为对胶片进行计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值(IOD)，反映样品的蛋白量。(β-Actin 为内参)。图4 为X射线照射之后SMMC-7721细胞和SMMC-7721KD两种细胞的平板克隆实验克隆集落数目图；其中0Gy，2Gy，4Gy，6Gy代表X射线不同辐射剂量的克隆集落，Gy为放射剂量单位。图5 为X射线照射之后SMMC-7721细胞和SMMC-7721KD两种细胞的平板克隆实验统计的细胞存活曲线图；其中纵坐标表示细胞存活率，横坐标表示X射线放射剂量Gy。无血清培养基即RPMI-1640培养基，购自于Gibco ，商品货号31800-014 ；配制方法一袋培养基(10. 4g)溶于IL双蒸水，加入碳酸氢钠2克，溶解，过滤，4度保存。双倍血清培养基RPMI_1640培养基加20%新生牛血清；正常血清培养基RPMI_1640培养基加10%新生牛血清；kocin筛选培养基RPMI_1640培养基加10%新生牛血清，再加kocin，使其工作浓度为100ug/L ；聚偏二氟乙烯膜PVDF膜；PS-9型半干式转移电泳仪大连竟迈生物科技有限公司；Cav-I—抗购自于 cell signaling，商品货号 3238 ；β -actin 一抗购自于武汉博士德生物工程有限公司，商品货号BM1453 ；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG:购自于北京中杉金桥生物技术有限公司，商品货号ZB2305 ；辣根酶标记山羊抗兔IgG:购自于北京中杉金桥生物技术有限公司，商品货号ZB2301 ；BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒，购自于上海碧云天生物技术有限公司，商品货号P0018 ；苯甲基磺酰氟(PMSF)购自于上海碧云天生物技术有限公司，商品货号ST506 ；RIPA 裂解液配制:5mol/L NaCl 终浓度 0. 15mol/L, TritonX-100 终浓度 1 %，Deoxycholic acid Sodium Salt 终浓度 1 %，SDS 终浓度 0. 10%, Tris-HCl (PH7. 4)终浓度10mmol/Lo 使用前加 PMSF。IOOmmol/L PMSF :0. 1742g PMSF 溶于 IOml 的异丙醇中，4°C保存。IXPBS 缓冲液称取 NaCl 8. 5g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 85g, KH2PO4O. 27g,溶于600ml ddH20中，调节pH至7. 2-7. 4后再加ddH20定容至1000ml，过滤除菌，4°C保存。PBST 缓冲液IXPBS 缓冲液加入 Tween-20，Tween-20 浓度为 0. 1%。实施例1细胞株的构建一 . Cav-I特异性shRNA转录模板的设计根据载体酶切位点的要求和hvivogen公司提供的网上设计软件，设计出1对小干扰RNA的转录模板。对应在Cav-I基因上的位置(GenBank BT007143)，其具体序列为SEQID NO :1和SEQ ID NO :2 (siRNA靶点GC百分比为38. 10%，位点为400)。并送至大连宝生物公司合成。二. Cav-1特异性s iRNA表达载体的构建将转录模板核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2在80°C退火2min，自然冷却至35°C得到退火产物；Bbs I (双酶切位点)对质粒psiRNA-hHlzeo G2进行双酶切，琼脂糖凝胶(琼脂糖浓度10g/L)电泳回收大片段(2905bp)；T4DNA连接酶连接回收片段和退火产物，16°C连接，过夜。将连接产物转化大肠杆菌GTl 16感受态细胞。用转化后菌体涂布具有kocin (100g/L)抗性的i^ast-Media 琼脂平板，37°C过夜培养。
挑取单克隆，在含kocin 100g/L的i^ist-Media TB液体培养基中扩增，并用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒。所得质粒用I^st I单酶切或I^st I和EcoRV双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度10g/L)，分别产生出大小为^^bp的线性质粒和大小约1265bp及1363bp的DNA片段，证明连接正确(图1A，1B)，进一步测序，测序结果如SEQ ID NO :3，证实序列完全正确。将鉴定正确的重组质粒命名为psiRNA-CAVl。图1 为载体psiRNA-CAVl的酶切图。其中A为psiRNA-CAVl电泳图，M代表DL2000marker ； 1代表psiRNA-CAVl质粒；B为质粒酶切之后的电泳图，1为环状质粒，2为使用I^st I产生的线性质S^^bp ;3为使用I^st I和EcoR V酶切之后产生的两个片段大约为 1265bp 和 1363bp。三.转染将质粒载体psiRNA-CAVl瞬时转染正常人肝癌细胞SMMC7721细胞，并筛选Cav-I稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系。(1)将生长状态良好的SMMC-7721细胞，0. 25%胰蛋白酶消化液消化，制成细胞悬液，接种至六孔板中，按5 X IO5个/孔，37°C，5 % CO2恒温培养箱中培养Mh，使其贴壁，待细胞生长融合至80 % 90 %，备用。(2)取两个1. 5ml离心管，分别标记为1号管和2号管，其中1号管按每孔250ul的Opti-MEM，再加入^g/孔的质粒psiRNA-CAVl，2号管按每孔250ul的Opti-MEM，再加入IOul的lifpofectamine^OOO，静置5min。将2管中的混合液加入1管中混合，静置20min。(3)转染孔的细胞换无血清培养基anl，将1、2混合液添加到六孔板的转染孔中。37°C,5% CO2恒温培养箱中培养4h，转染孔加入双倍血清培养基anl。37°C,5% CO2恒温培养箱中培养培养48h，加入kocin终浓度为100Ug/L的kocin筛选培养基进行筛选用Zeocin筛选培养基，细胞M小时一次换液，四天一次传代，每次传代收集细胞，直至传至第七代时，Cav-I的低表达基本稳定，第八代细胞扩大培养，并冻存细胞，将该细胞系命名为SMMC-7721KD。如图2 细胞转染后第3代，第5代，第6代，第7代，细胞中Cav-I表达下调的western blot结果图；其中上图为Cav-I和β -actin的western blot结果经X光医学胶片感光图，C代表SMMC-7721对照，3、5、6、7代表SMMC-7721KD传代的代数；下图为对胶片进行计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值(IOD)，反映样品的蛋白量。(β -Actin为内参)。结果表明在转染后第3代，细胞中Cav-I的表达开始略微下降，在传至5代、6代时，Cav-I的表达明显下降，并且在第7代时Cav-I的低表达趋于稳定。实施例2细胞株的鉴定四.siRNA干扰效率检测Western Blot检测Cav-1的表达SMMC_7721KD每次传代收集的细胞(第3代，5代，6代，7代)用RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，用Bradford法(BradfordM AnaL. Biochem,1976,72 :248 254)对蛋白进行定量后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳分离的蛋白质电转移到至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的PBST溶液在室温摇床上封闭lh。与相应第一抗体结合(Cav-Ι—抗购自于cell signaling，商品货号3238，
7β -actin 一抗购自于武汉博士德生物工程有限公司，商品货号BM1453)，4°C孵育过夜；次日用PBST漂洗3次洗去一抗，再与对应的辣根过氧化物酶标记的第二抗体(Cav-Ι抗兔，用辣根酶标记山羊抗兔IgG ； β -actin抗鼠，用辣根酶标记山羊抗鼠IgG)于室温摇床中孵育池；PBST漂洗3次，PBS 1次，洗去二抗；ECL显色后，在暗室中进行胶片感光；室温显影3min，定影aiiin，计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值，如图3 为瞬时转染Cav-IsiRNA质粒，SMMC-7721细胞中Cav-I的表达下降的western blot结果图；其中上图为SMMC-7721对照细胞和SMMC-7721KD细胞经westernblot，Cav-I和β-actin X光医学胶片感光图，下图为对胶片进行计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值(IOD)，反映样品的蛋白量。(β-Actin 为内参)。结果表明建立Cav-I稳定地表达的SMMC-7721细胞后，检测细胞中Cav-I的表达。与对照人正常肝癌细胞SMMC7721细胞相比，SMMC-7721KD中psiRNA_CAVl的干扰效率为80%左右。五.SMMC-7721KD功能检测——克隆形成率检测放射之后细胞的增殖能力平板克隆形成实验指数生长期的SMMC-7721细胞和SMMC-7721KD细胞，用0. 25%胰蛋白酶消化液消化、制成细胞悬液、台盼蓝染色计数后梯度稀释至所需浓度，以200个/皿的密度接种细胞于直径6cm培养皿中，待细胞贴壁后照射。使照射后每孔的克隆形成数在50到200个之间。细胞辐射处理X射线能量为8MeV，剂量率为3Gy/min。源皮距为100cm (即SSD =100cm)。照射野随所选用的细胞培养板大小而调整。每个剂量点设3个重复样品。细胞贴壁后按067、167、267、367、467、667，7个剂量给予照射，然后置于371、5(%CO2培养箱中培养10 14天。培养7天以后每日进行观察，待发现有较大细胞克隆集落时，将培养皿取出，倒掉培养液，加入PBS液轻洗细胞后再弃去。用甲醇固定细胞5min，加0.4%结晶紫染液染色10-15min，弃去染液，用双蒸水轻轻冲洗培养皿3次，自然风干，如图4 为X射线照射之后SMMC-7721细胞和SMMC-7721KD两种细胞的平板克隆实验克隆集落数目图；其中0Gy，2Gy，4Gy，6Gy代表X射线不同辐射剂量的克隆集落，Gy为放射剂量单位。显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数。按以下公式计算各剂量的存活分数，并绘制细胞存活曲线，如图5，即X射线照射之后SMMC-7721细胞和SMMC-7721KD两种细胞的平板克隆实验统计的细胞存活曲线图；其中纵坐标表示细胞存活率，横坐标表示X射线放射剂量Gy。存活曲线最具特征的部位在2Gy，直接反映放射敏感性。对两种细胞在2Gy照射剂量时的存活分数SF2进行统计学分析，差异有统计学意义(配对t检验，P < 0. 05)。结果表明随着照射剂量的增加，两种细胞的存活率都逐渐下降，其中SMMC-7721KD细胞的存活率下降的较SMMC-7721细胞更为明显。这提示我们Cav-I的低表
达能够增强细胞的放射敏感性。
细胞存活分数=胃齐翻勺鋪誦
-X 100%
某剂量下种植的细胞数X OGy组集落形成率结果表明经过X射线照射之后两种细胞的克隆形成率随着照射剂量的增加逐渐下降，并且SMMC-7721KD细胞的克隆形成率明显低于正常的SMMC-7721细胞。依据本发明所述方法构建的Cav-I稳定低表达的SMMC-7721细胞系SMMC-7721KD，经过psiRNA-CAVl干扰人正常的肝癌细胞SMMC-7721，Western Blot检测其对SMMC-7721细胞中Cav-I的干扰效率可达80%左右；经过X射线照射之后，细胞的克隆形成率降低，凋亡细胞数增加。这提示我们Cav-I基因沉默可以抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长。经文献检索，这是第一个Cav-I基因沉默的人肝癌SMMC-7721细胞，其用途如下研究Cav-I在人类肝癌细胞发生和发展过程中的影响和其作用机制可以以正常的SMMC-7721细胞为对照，以SMMC-7721KD细胞为实验组，探讨Cav-I在肝癌细胞生长，增殖及分化过程中的作用和相关机理。研究Cav-I在肝癌细胞放射后，对肝癌细胞DNA损伤饥细胞周期和增殖能力的影响作用机制研究人肝癌的发病机理和治疗探讨Cav-I基因沉默导致肝癌细胞凋亡的信号通路；探讨Cav-I在在肝癌细胞中的生物学功能，为临床肝癌的治疗寻找新的方法。


本发明公开一种Cav-1低表达的SMMC-7721KD细胞系的构建方法。具体采用Cav-1SiRNA干扰技术构建Cav-1稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系。经过设计引物、扩增目的片段，构建Cav-1SiRNA重组质粒，进行质粒转染，然后对转染后的细胞进行博莱霉素筛选，传代，建立稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系，最终获得阳性重组细胞系，能够沉默SMMC-7721细胞中Cav-1的表达80％左右，并且Cav-1稳定低表达。Cav-1稳定低表达的SMMC-7721细胞系可作为模型，进行Cav-1参与的一些肿瘤细胞的研究，Cav-1与肝癌的相关性及其机理研究。