专利名称：脉管损伤部位聚集性载体的制作方法 从具有堵塞伤口、阻止出血的作用看，血栓形成在生物体内是不可缺少的功能。然而，从具有减小血管径、阻碍血流的性质看，血栓形成也是循环系统疾病的主要原因。例如，血管的外壁遭受损伤后，血栓形成作为为了维持血液循环所必需灌流压的生物防御功能而发挥作用。另一方面，由于过氧化反应等导致的血管内皮细胞伤害而发生动脉硬化，如果动脉硬化发展显著则会诱发血栓形成。接着，因血栓导致血管狭窄，作为其结果产生的缺血成为疾病率和死亡率的主要原因。另一方面，因血栓形成导致的止血反应，被伴随着癌治疗药的使用或白血病等血液疾病的血小板减少症、或者伴随着肝脏疾病的血液凝固因子降低所破坏，招致从血管内皮细胞间隙的漏出性出血，在这种状况下脑血管等中的出血引起致死性变化。为了临床上有效地使用具有防止血管狭窄效果的药物，需要使得该药物以足以抑制平滑肌细胞增殖的浓度到达血管内皮伤害部位。但是，在将该药物静脉内给药或口服给药来进行全身给药时，限于该药物在全身不引起副作用的给药量，此时，往往不能获得希望的效果。另一方面，为了控制出血趋势，由于同样的理由，必须向红细胞容易漏出的损伤血管内皮细胞局部选择性地输送药物。一直以来人们都希望开发出在血管内皮损伤部位上能够使药物特异而且足够浓度地聚集的药物载体，即在血管内皮损伤部位中的特异性聚集度高，具有高药物含有力的药物载体。对于在血管内皮损伤部位中的聚集，已知将脂质体的表面阳离子化，则聚集在血管内皮受到伤害的部分(日本特开平7-89874号公报)。但是，从在血液内凝固、与血小板结块而分布来看，表面带有正电荷的脂质体难以作为用于实现有效的药物输送的药物载体使用。近年，对于血栓形成中的血小板功能、白血球粘附、血液凝固及纤维素溶解的研究不断发展，在体外不断阐明它们的过程。然而，体内实验时，由于没有直接的观察方法，所以得不到在上述体外实验中所发现的过程。因此，开发出使用了用于对小鼠微循环中的血栓形成进行实时摄像的高速共聚焦显微镜的系统(Falati，S.et al.，NatureMed.，8(10)，1175-1180(2002)，Celi，A.et al.，J.Thromb.Haemost.，1，60-68(2003))。该系统可以多色且实时地观察血管内，可以通过明视野的途径同时获得多个荧光探针和数据的图像。此外，通过上述系统，还可以在显微镜下形成用激光造成的血管损伤。因此，对于血栓形成过程中的血小板凝聚、组织因子及血纤蛋白的活动等，使用因激光造成的血管内皮损伤模型，用荧光及明视野显微镜的体内研究不断发展。
本发明的目的在于提供聚集于损伤的组织而作为血小板控制药发挥作用的表面非阳离子性载体、使用了所述载体的药物输送方法以及含有所述载体的医药组合物。进而，使用高速共聚焦显微镜，多色且实时地观察载体在生物体内活动，提供直接证明在所谓的药物转运系统的生物体局部中的药物输送的方法。为了解决上述课题，本发明人进行了精心研究，结果成功地实时观察到载体在血管内的活动，发现载体特异性地聚集在血管损伤部位，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)一种载体，其表面为非阳离子性，能够粘附、聚集在组织的损伤部位，和/或填充损伤部位的载体。
作为上述载体，例如，可以举出表面由膜构成的载体。
作为上述组织，例如，可以举出血管等脉管。
作为上述载体，可以举出能够扩散到脉管外部的载体。
此外，上述损伤如涉及内皮细胞的损伤，作为这样的损伤，可以举出由激光、炎症(例如浮肿(脑积水等)、发热、发红等)、缺血性疾病(例如缺血性脑疾病等)、缺血-再灌流损伤(例如缺血-再灌流性脏器损伤等)、弥散性血管内凝固综合症、败血病、细菌毒素、氧化应激、肿瘤或血栓形成、或者出血导致的损伤。
(2)药物运输体，其由上述(1)所述的载体构成。
(3)医药组合物，其是在上述(2)所述的药物运输体中内包或担载药物而成的。
上述医药组合物可以是用于作为血小板的功能控制药而发挥作用的物质，作为血小板的功能控制，例如，可以举出止血、抗血栓形成、血栓溶解或抗动脉硬化作用。由于上述(1)所述的载体具有脉管损伤部位填充效果，因此在以止血为目的时还可以将载体自身作为医药品使用。
作为内包或担载于上述载体中的药物，例如，可以举出选自通过可见光或紫外光等的光、温度、pH的变化、超声波、因炎症细胞导致的吞噬或因酶导致的分解等引起活化的物质，止血剂，抗血栓药，血栓溶解剂，抗肿瘤剂及抗动脉硬化剂中的至少1种。作为上述炎症细胞，例如淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞或血小板。
(4)药物输送方法，其特征为，使上述(3)所述的医药组合物聚集在组织的损伤部位；或者，药物控制方法，其特征为，使上述(3)所述的医药组合物聚集在组织的损伤部位，使药物作用于该损伤部位。
上述药物的作用可以由载体的聚集、载体的扩散或载体的活化所控制。
上述组织可例举出脉管，脉管可例举出血管。
(5)载体的功能评价方法，其特征为，在高速共聚焦广视野显微镜下观察载体在组织内的活动。
还包括多色且实时地进行组织内活动的观察的上述方法。
作为上述载体，例如，可以举出表面为非阳离子性的载体，进而可以举出表面由膜构成的载体。
上述组织可以例举出脉管，脉管可以例举出血管。


图1是表示灰度级的测定部位的图。
图2是表示小动脉烧蚀后的Rh-lipo活动的图。
图3是表示小动脉烧蚀后的Rh-lipo活动的图。
图4是表示在小动脉损伤部位中的脂质体聚集的解析例的图。
图5是表示在小动脉损伤部位中的脂质体聚集的解析结果的图。
图6是表示小动脉和小静脉中的因组胺导致的损伤部位中的脂质体活动的图。左上图给与脂质体后，组胺表面灌流前(A小动脉，V小静脉)；右上图给与脂质体后，组胺表面灌流开始2分钟后。将小静脉在中心处以竹节状打开成大孔(large pore)，填充经若丹明标记的脂质体，中央下图给与组胺后引起白细胞浸润，但在给与脂质体后通过翻滚和粘附浸润停止，白细胞留在血管内。
图7是表示脑积水模型等中的血浆相对漏出量的图。
图8是表示脑积水模型等中的血浆漏出量的图。
图9是表示脑积水模型中的血浆漏出量的图。

下面，详细说明本发明。
1.概要通过使用局限性激光束照射使血管内皮损伤来获得血栓形成模型，使用高速共聚焦显微镜多色且实时地观察该模型，通过此技术完成本发明。由此，可以研究与血小板等血栓形成相关的构成物及载体在血管损伤部位中的活动。
以往认为控制载体的血管内动态是非常困难的，但是通过将上述技术应用于表面为非阳离子性的(优选该表面由膜构成)载体(在本说明书中称为“表面非阳离子性载体”)，可以得到关于载体的血管内动态的新知识。即，可知表面非阳离子性载体不聚集在血管非损伤部位，从特异性地聚集在血管损伤部位看，显示出与血小板相同的活动。此外，从与血小板设置分界而聚集的方面可确认，表面非阳离子性载体显示出与血小板相独立地聚集、填充于损伤部位的举动。其结果可以将表面非阳离子性载体作为血小板功能控制药使用，可以作为以止血为目的的血小板代用品使用。另外，通过在载体中导入药物，还可以作为抗血小板药、抗肿瘤药等运输体使用。进而，将被温度、pH等活化的药物导入到载体中，用激光使药物目标部位损伤，则载体聚集在目标部位，在该阶段如果使温度、pH等变化则药物在该部位被活化，可以更特异性地将药物运输到目标部位。
与血小板不扩散到血管损伤部位的外侧相对，对于本发明的载体而言，聚集在损伤部位的一部分载体扩散到血管外侧。因此，本发明的载体可以作为药物运输体将药物输送到脉管损伤部位的外侧。
2.载体在本发明中，载体是指脂质体、乳液、脂质内质网等。下面特别以脂质体为例进行说明。
(1)载体的制作表面非阳离子性脂质体是指表面由非阳离子性膜构成的脂质体，是指将脂质单独分散于水性介质中，或者与胆固醇或其他双亲性分子混合而分散于水性介质中，由此得到的分子集合物，(i)具有通过疏水部之间的疏水性相互作用而形成的膜，(ii)具有分子填充状态高等性质。如果形成稳定的脂质体，则可以使内水相中内包水溶性药物，或者可以使膜表面担载标识部位，由此本发明的脂质体可以用于药物输送系统中。
如上，在本发明中，脂质体的膜为非阳离子性。在这种情况下，本发明的脂质体的膜构成脂质只要脂质体表面不带阳离子性即可，可以单独使用磷脂、或者使用磷脂和胆固醇或和脂肪酸的混合脂质。制备脂质体的方法，可以采用例如旋涡法、超声波照射法、高压吐出法、高压挤出法、强制搅拌(均化器)法、解冻法、有机溶剂注入法、表面活性剂除去法、反相蒸发法、微流化法等一般方法。
只要脂质体的表面不带阳离子性，则由非阳离子性膜构成的脂质体的构成成分可以是饱和磷脂、不饱和磷脂的任意一种(第2936109号专利)。例如，可以举出氢化卵黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂等天然磷脂及其衍生物、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷酸脂胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等。这些磷脂选自具有聚合性基团的聚合性磷脂。这种聚合性磷脂可以举出1，2-二(十八-反-2，反-4-二烯酰基)磷脂酰胆碱、1，2-二(十八-2，4-二烯酰基)磷脂酸、1，2-二桐酰磷酸脂胆碱等。此时，聚合性磷脂可以具有非聚合性的长链，非聚合性长链可以举出碳原子数为2～24的直链或支链的烷基、酰基、非聚合性烯基、非聚合性烷酰基等。脂肪酸可以使用碳数为12～20的饱和或不饱和脂肪酸。例如，肉豆蔻酸、棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、十八-2，4-二烯酸等。
此外，脂质体的膜构成脂质可以含有负电荷脂质，例如，可以优选使用二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰肌醇、二酰基磷脂酰丝氨酸、脂肪酸等。此时，负电荷脂质的含量没有特别的限定，优选为1～50摩尔％，更优选5～20摩尔％。
进而，作为脂质体的膜构成脂质而使用的其它成分可以添加稳定剂。这样的稳定剂优选甾醇，具体而言，可以举出四氢麦角甾醇、胆甾烯醇等，优选为胆甾烯醇。胆甾烯醇的含量没有特别的限定，为了有效地稳定脂质体膜，优选设为10～50摩尔％。
稳定剂还可以使用通常使用的被称为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPG)或棕榈酸(PA)的稳定剂。DPPG和PA的化学式如下所示。
进而，稳定剂还可以使用不具有磷酸基的羧酸型脂质。这种含有羧酸型脂质的稳定剂，在含有于脂质体中时，具有如下特征中的至少一种特征(i)脂质体在生物体内没有血小板活化作用，(ii)脂质体在生物体内的给药不使循环血液中的血小板数减少，(iii)脂质体在生物体内不引起血小板的一过性粘附反应，以及(iv)脂质体在生物体内没有白细胞粘附活化作用。本发明含有这样的稳定剂。上述羧酸型脂质，例如，可以优选举出用下述通式(1)表示的脂质。
(式(1)中，R1、R2及R3中的任意一个是用通式(1’)表示的基团，其它二个是烃基(例如链状烃基)；A1、A2及A3分别独立，可以相同也可以不同，是选自C(O)O、CONH或NHCO的基团；n是表示亚甲基链长的1～3的整数。
(式(1’)中，M是氢原子或一价的阳离子，m是表示亚甲基链长的1～5的整数。)作为上述链状烃基，例如，只要是碳数2～20的、直链状或支链状的非环式饱和烃基或非环式不饱和烃基(还包括非环式萜烯)即可，没有特别的限定，例如，可以举出分类为烷基、烯基、炔基、二烯烃基、亚烷基、次烷基等各种烃基。
应说明的是，在通式(1)中，R1、R2及R3的结合部位优选为赖氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等三官能性氨基酸。其中，特别优选具有一个反应性官能团和二个相同的反应性官能团的三官能性氨基酸，即，具有一个末端氨基酸和二个末端羧基的天冬氨酸或谷氨酸等，或者具有一个末端羧基和二个末端氨基的赖氨酸、天冬酰胺、谷酰胺等。特别优选天冬氨酸或谷氨酸，还可以是高半胱氨酸或谷胱甘肽等。
用通式(1)表示的羧酸型脂质，可以优选例举出用下述式表示的DPEA(二棕榈酰基-L-谷氨酸-N-琥珀酸；1，5-二棕榈酰基-L-谷氨酸酯-N-琥珀酸(或也称为DHSG(1，5-O-二(十六烷基)-N-丁二酰-L-谷氨酸酯))。
水性介质可以举出纯水、水溶液、缓冲溶液等。水性介质可以根据脂质体的用途适当选择，注射用水或生理食盐水在生物体内安全性高而优选。水性介质的pH只要是具有生理的pH、特别是没有稳定性低下或集合形态变化等损伤，就没有限制。生理pH范围是指生物体内、血液内等的pH范围，例如pH4～11，优选为pH6～9。
本发明脂质体的粒径为0.02～250μm，特别优选0.1～1.0μm的大小。可以在混合脂质粉末中添加水溶性物质和水性介质后进行水合作用，使其膨润，通过静置水合法、旋涡混合器、强制搅拌机、超声波照射器、均化器、微流化器、高压挤出机(压出机)、解冻等控制脂质体的粒径。特别是通过将解冻和高压挤出机组合，由于显著提高滤器的透过性，因此处理时间缩短，收率提高。没有被内包的水溶性物质可以通过凝胶过滤或离心分离或超临界膜处理与内包脂质体进行分离。本发明所用的水溶性物质可以举出血红蛋白及清蛋白等水溶性蛋白质、肽、核酸、水溶性药物等。
(2)表面修饰在本发明中，可以在上述脂质体膜中添加适当的修饰物质中来修饰该膜。用于修饰膜的物质，例如，可以举出唾液酸或多糖结合的脂肪酸及脂肪、以及聚氧乙烯结合的磷脂、脂肪酸及胆固醇等，优选用聚氧乙烯(聚乙二醇)进行修饰。通过用聚乙二醇进行表面修饰，还确认了血中的血流动态得到改善(Sakai et al.，BioconjugateChemistry，Vo.8，20-23，1997)。聚乙二醇链在使干燥脂质体分散于水性溶液中之后的工序中高效地抑制脂质体的粒径变化，此外，由于抑制凝聚，因此在最终工序中进行挤出法时，能够防止因脂质体凝聚导致的过滤器透过性降低或堵塞，因而优选。聚乙二醇型脂质的含量优选混合脂质的0.01～1摩尔％，进一步优选0.1～0.3摩尔％。进而，聚乙二醇的分子量为2,000～12,000，优选4,000～10,000左右。
3.组织损伤(1)损伤本发明中的组织损伤不被其要因限定，而认为是外因性的损伤和内因性损伤。此外，认为该损伤包括伤害内皮细胞的全部损伤，这种损伤部位引起炎症。该炎症包括因物理刺激、化学刺激产生的炎症。物理刺激可以举出因激光、放射线、刀具等引起的刺激，化学刺激可以举出组胺、白细胞三烯、凝血酶、激肽、活性酶、氧化应激、重金属、细菌毒素、细胞因子等。这些炎症还包括浮肿(例如脑积水)、发热、发痛、发红等。外因性的损伤，例如，可以举出因受伤导致的血管损伤、在疾病预防或治疗的目的中使用的激光所导致的损伤等。内因性的损伤可以举出缺血性疾病(例如缺血性脑疾病等)、缺血-再灌流损伤(例如缺血-再灌流性器官损伤等)、弥散性血管内凝固综合症、败血病、肿瘤、血栓形成等。此外，由高血压、高血脂、肥胖、糖尿病、吸烟的动脉硬化的危险因子诱导的各种血管坏死因子引起的过氧化反应等导致的内皮细胞的伤害以及其结果形成的动脉硬化病灶也包括在内因性损伤中。
(2)在组织中的聚集使本发明的载体聚集的组织只要是含有内皮细胞的组织就没有特别的限定。具有内皮细胞的脉管具有含一层内皮细胞的管腔结构，这样的组织可以举出血管及淋巴管，从容易地将载体注入血液中考虑，优选血管。血管无论是动脉、静脉还是毛细血管都可以。下面，为了方便起见，举例说明血管。
本发明的载体具有不聚集在没有损伤的血管上，而特异性地聚集在上述损伤导致的内皮细胞损伤部位上的特征。载体在损伤部分中的聚集活动显示与血小板几乎相同的活动，单层或多层地聚集，使得覆盖损伤部分，从血管内皮细胞损伤部位侵入到内皮下腔中，将其部位特异性地填充。另一方面，本发明的载体的特征为，在聚集部分中不与血液中原来流动的血小板相互作用，而是与血小板的聚集区域设置分界，独立地聚集。
(3)部分扩散内皮细胞损伤伴随有血管基底膜的损伤时，载体不仅从血管内聚集到损伤部位，而且其一部分还从损伤部位向血管外部扩散。因此，内包或担载药物的载体在损伤程度大时，可以不停留在血管壁内部而扩散到达血管外。其结果为，可以将药物高效地输送到损伤部位，可以期待更好的治疗效果。即使是不含有药物的载体，由于从血管外部堵塞血管壁贯通部位，因此可以期待好的止血效果。
4.药物输送(1)药物在本发明中，通过使载体内包或担载药物，可以作为医药组合物使用。根据血管损伤部位的诊断和/或治疗的目的，药物可以使用诊断用物质或药理活性物质。
在本发明中，作为内包或担载在载体中的药物，可以使用任何药物，只要无损载体的形态就没有特别的限定。具体可以举出止血剂、血液凝固促进剂、抗血栓剂、血栓溶解剂、抗肿瘤剂、抗凝剂、蛋白酶抑制剂、前列腺环素制剂、血管平滑肌细胞增殖抑制剂、抗生素、抗炎剂、抗动脉硬化剂、脂质掺入抑制剂、血管内皮细胞增殖抑制剂、维生素(如维生素C、E、K)、抗感染剂、皮肤用药、感官用药、内分泌系统用药、消化器官用药、循环器官用药、排泄器官用药、生殖器官用药、呼吸器官用药、神经系统用药、诊断用辅助剂、营养剂、氨基酸、蛋白质等，这些物质可以单独使用或者适当组合使用。对象疾病是上述药物的适应症。此外，在载体中，还可以含有人工红细胞用的血红蛋白或用于癌的化学疗法剂等的各种医药品，或者以基因治疗为目的，在载体中还可以含有基因(核酸(DNA、RNA))。
此外，例如还可以将用可见光或紫外光等的光、超声波活化的药物内包或担载在载体上，还可以将通过温度或pH的变化而活化的药物内包或担载在载体上。进而，还可以将通过炎症细胞的吞噬或酶的分解而活化的药物内包或担载在载体上。炎症包括浮肿和白细胞浸润(疱疹、血管性水肿、脑积水、脑缺血)。上述炎症细胞可以举出淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞、血小板等。
“使载体内包药物”是指在载体内部的水性介质中包含药物。
使载体内包药物的方法，在载体为脂质体的情况下，如上所述制作载体时，将药物和原料脂质在水性介质中混合即可。
“使载体内包药物”是指使载体表面物理性地附着药物、或者化学性地结合药物，具体是指，使膜自身的双亲性部位结合药物，形成药物在脂质双分子膜内不穿透即不贯通膜的状态或穿透而贯通膜的状态，或者形成将药物夹在脂质双分子膜的疏水部之间形成夹心状的(结合的)状态。
使载体担载药物的方法可以在脂质体内腔中封入药物或者可以在脂质双层膜内部或表面持有药物。
可以将通过可见光、紫外光等的光、温度、pH的变化、超声波、炎症细胞(淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞、血小板)的吞噬、酶的分解而活化的药物内包或担载在载体中。上述药物的活化是指药物制剂活性表现的提高、药物从载体游离和/或非活性型药物的活化。对要诊断或治疗的部位进行激光照射，使血管局部损伤，则载体聚集在该位置。内皮细胞损伤到达血管基底膜时，载体部分扩散也在血管外侧聚集。在血管损伤部位聚集的载体中内包或担载的药物通过可见光、紫外光等的光、温度、pH的变化、超声波、炎症细胞(淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞、血小板)的吞噬、酶的分解而活化，从而可以有效地释放诊断用物质或药理活性物质。
本发明的载体中内包或担载的药物的量可以根据治疗目的由本领域技术人员适当设定。由于年龄、性别、症状、给药途径、给药次数不同，本发明的医药组合物的给药量可以适当选择而设定。例如，为抗肿瘤剂时，可以使其1～5mg作为内包型存在于直径为100～300nm的脂质体悬浮液1mL中。
本发明医药组合物的给药形式除了通常的静脉内、动脉内等全身给药之外，还可以在肌肉、皮下、皮内等进行局部给药。进而，还可以采用使用了导管的给药形式。
(2)功能控制如果血管内皮细胞受损，则血小板聚集在该损伤部位形成用于止血的血栓。此外，在初始期间，从因血管内皮损伤而产生的内皮细胞间隙漏出以清蛋白为代表的血浆胶质渗透压物质而引起浮肿，最终该间隙成为炎症细胞侵入组织中的门户。通过这些反应，引起所谓的炎症反应，引起浮肿或发热、发痛、发红。已知这些反应也普遍发生在因癌在血管内散播或败血症引起的多器官衰竭的血管系中(KatayamaT，Ikeda Y，Handa M，Tamatani T，Sakamoto S，Ito M，Ishimura Y，Suematsu M.Immunoneutralization of glycoprotein Ibα attenuatesendotoxin-induced interactions of platelets and leukocytes with ratvenular endothelium in vivo.Circulation Research 2000，86，1031-1037.)。即，血小板和白细胞具有识别内皮细胞损伤部位而聚集的性质。
在因激光等导致的外因性损伤部位中，血小板聚集来修补血管壁，起到防止出血、保持生物体循环系统的封闭性的作用。此外，血管内皮细胞脱落，或者因过氧化反应使血管内皮细胞受损，则血小板聚集在该损伤部位上，形成血栓。在因肿瘤导致的血管损伤部位中，血小板具有粘附、活化、或者放出血小板内的物质、在该部位形成血栓的性质。此外，上述血管内皮受损的部位因白细胞引起炎症反应。即，在血管内皮损伤部位不仅聚集血小板，还聚集白细胞。
因此，下面对应于各个细胞担负的生理功能，来说明应用识别内皮损伤部位而聚集的本发明载体的血管功能控制的例子。
(2-1)血小板显示与血小板相同的粘附活动的本发明载体可以作为血小板的功能控制药而发挥作用。功能控制是指通过使用内包或担载有对应于诊断或治疗目的的药物的载体来代替血小板，从而抑制或促进血小板的功能。血小板的功能控制作用具体为止血、抗血栓形成、血栓溶解或抗动脉硬化作用等。
例如，聚集在因受伤导致的外因性损伤部位的载体显示出堵塞损伤部位、止血效果。此外，使载体内包或担载具有止血效果、血液凝固促进效果的药物时，该载体可以显示更高的止血效果。因此，本发明的载体具有增大血小板止血功能的功能。
聚集在内因性损伤部位的载体通过在载体内内包或担载的药物的作用，可以防止或者溶解源自聚集的血小板的血栓。因此，本发明的载体可以发挥抑制血小板聚集功能的作用。
(2-2)白细胞如上所述，在血管内皮损伤部位不仅聚集血小板，还聚集白细胞。本发明的载体显示与血小板相同的向血管内皮损害部位的聚集性，因此推定该载体显示与白细胞相同的粘附活动，也可以作为白细胞的功能控制药而发挥作用。白细胞的功能控制是指，内包或担载抑制或促进白细胞生理作用的药物的载体作为白细胞而发挥作用。白细胞可以大致分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞3种，担任免疫功能的核心作用。这种白细胞的功能控制作用是微生物吞噬·杀菌·消化作用、生物体防御作用、感染防御作用、炎症作用、寄生虫破坏作用、即时型过敏反应促进作用等。
例如，聚集在外因性损伤部位的载体具有防止源自外部的病毒、微生物侵入、感染的作用。使载体内包或担载具有抗微生物、抗菌作用的药物等时，该载体可以显示更好的白细胞样功能。此外，使载体中内包各种细胞因子(例如1L-1、1L-2、1L-4等)，还可以使单核细胞或淋巴细胞活化。此外，聚集在内因性损伤部位的载体具有防止白细胞从血管浸润到组织中、防止体液漏出的作用。已知源自血管的白细胞浸润借助细胞因子的游离而引起组织炎症，而且，体液的漏出引起全身或局部(例如脚部、脑积水等)的浮肿。本发明的载体显示出防止成为这种炎症原因的白细胞浸润、体液漏出的功能。
因此，本发明的载体也可以控制白细胞的功能而发挥作用。
(3)药物的作用本发明载体的一部分扩散到血管外部，因此在血栓、血管损伤部位的治疗中，也可以从血管外壁发挥其效果。
此外，预先将用激光激发的荧光物质添加到药物中，在使用激光的诊断或治疗中，特别指定诊断部位或治疗部位变得容易，部位特异性的药物的活化变得容易。应说明的是，此时的激光作为与在本发明中用于在血管上给予损伤的激光不同的用途而使用。
此外，使本发明的载体内包或担载因可见光或紫外光等的光、温度、pH等而活化的药物时，可以选择希望的时间、希望的作用部位、希望的作用量而发挥药物效果。
药物可以按内包或担载在聚集于血管损伤部位的载体中的形式输送，特异性地作用于损伤部位。此外，药物通过载体聚集、扩散或载体活化，其活性受到控制。本发明提供这种药物输送方法及药物控制方法。
5.使用高速共聚焦广视野显微镜的血管内观察通过本发明，提供在高速共聚焦广视野显微镜下观察载体在生物体内的活动的方法。该方法可以多色且实时地观察载体在组织(血管)内的活动。除了载体之外，通过对源自生物体的血小板或白细胞(以下也称为“血小板等”)或目标部位进行荧光标记，可以同时观察两者在生物体内的活动。因此，本发明的方法在研究载体在生物体内的选择性、凝聚性及动态上极为有效。
(1)观察对象动物的准备实验动物只要是具有在共聚焦广视野显微镜下能够进行观察的血管的动物就没有特别的限定，优选在药物载体动态研究中通用的动物。优选大鼠、豚鼠、小鼠、仓鼠、鼩鼱、兔、狗、猪、猫及猴。更优选大鼠、豚鼠、小鼠及仓鼠。
实验动物的麻醉用在一般动物实验中使用的方法进行。例如，可以举出戊巴比妥钠盐、氯胺酮、水合三氯乙醛、尿烷、乙醚等及它们的组合。优选不表现血管扩张等血管作用的麻醉方法。对实验动物的给药可以按各种催眠药、麻醉药所适用的用法、用量来进行。
在麻醉实验动物的静脉中插入导管，将用于对血小板等进行荧光标记的化合物通过导管进行静脉内给药。导管的插入位置没有特别的限定，考虑到导管的稳定性、对实验动物的安全性和对观察部位的损伤的可能性，优选大腿静脉。
(2)血小板等的标记为了用显微镜观察血管损伤部位中的血小板的活动，将血小板等用荧光色素标记。对血小板等进行标记的化合物在分子内具有酯键，例如，可以举出羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxylfluoresceindiacetate succinimidyl esterCFDA-SE(CFSE))。
标记化合物由于具有膜透过性而掺入细胞内，在该阶段不发出荧光。CFDA-SE掺入血小板等中时，通过细胞内的酯酶切断酯键，由此，化合物形成荧光基团，发出强荧光。化合物一旦掺入细胞中，则原样停留在细胞内，因此在长时间的测定中细胞标记也不会消失。
(3)载体的标记载体的荧光标记剂只要是与用于上述血小板等的荧光标记的化合物显示不同色调的色素，就没有特别的限定，例如，可以举出若丹明、德克萨斯红、荧光素等。CFDA-SE发色呈绿色，因此将血小板用CFDA-SE标记时的载体的标记优选发色呈红色的若丹明。注入的载体按含有载体(脂质体)体积35％的溶液换算，为每100g大鼠10～2000μL、优选50～400μL、更优选250μL。
根据目的，载体的给与方法除了静脉内给与之外，可以是腹腔内给与、肌肉内给与、皮下给与、经鼻给与、经肺给与、经口给与、涂抹等各种形式。此外，根据给与方法，也可以按含有药理学上允许的赋形剂或基剂的形式给与载体。
(4)血管观察将荧光标记化合物从上述导管注入之后，打开腹腔，为了对生物体内进行观察，将血管观察部位配置在玻璃盖片上。观察部位优选肠系膜的回肠部位，但没有特别的限定，也包括脑、肝脏、消化管等循环器官。
观察部位用在生物试剂中常用的缓冲液(例如Krebs缓冲液)进行灌流。此时，缓冲液优选使用经95％N2/5％CO2饱和过的缓冲液。灌流的条件为在37℃下保温，使得不给试样带来负担。
(5)因激光导致的血管内皮细胞的损伤接着，从上述导管注入荧光标记后的载体。在此后1小时以内，选择待损伤的血管。成为引起损伤对象的血管可以举例出动脉、静脉、毛细血管、淋巴管等。损伤制作所用的激光使用氮分子激光的脉冲光。在显微镜物镜下，对目标部位照射如具有1μm直径光束的激光，由此在血管内皮细胞部位中特异性地引起损伤。
(6)血栓形成和载体动态的生物体内摄像血管损伤部位的摄像所必需的系统可以改变Falati等人的方法来使用(Falati S.et al.，Nature Medicine，8(10)，1175-1180(2002))。该改变系统是具有三目镜筒的改良落射型显微镜。此外，为了在生物体内进行用显微镜的检查，必须具有一定开口数的水浸透镜或油浸透镜。具体优选具有1.1开口数的60×水浸透镜(LUMFL)。
在本发明中，如果使用以尼普科夫圆盘(Nipkow disk)技术为根据的扫描仪作为共聚焦显微镜，则显微镜在理论上能够于1秒内拍720幅图像。用于激发荧光的激光器可以举例出氩-氪2列激光器。使用该激光器，则在具有激发波长为488nm、568nm的共聚焦显微镜中可以得到荧光。
通过激光形成血栓时，使用氮色素激光。接着，在落射荧光(epi-illumination port)的光路中导入激光，就可以通过物镜对肠系膜的小血管的内皮细胞照射激光。激光在血管直径为约0.5μm的血管表面以3～10Hz的频率形成4-nsec能量脉冲。脉冲能量用适宜的数码控制器进行定量控制。
在三目显微镜的镜台中央部分接续彩色CCD相机，因此可以摄像在空间及时间上具有高分辨能的彩色图像。
(7)图像解析用采用了血小板标记色素的激发波长、载体标记色素激发波长以及双激发波长的激发光的三种方法来收集荧光图像，由此可以分别将血小板自身的活动、载体自身的活动以及血小板与载体两者的活动作为图像而得到。激发光是借助根据各色素而设定的滤光片的激光。
荧光图像首先被接续在计算机上的8位的数字化转换器加工，基于像素的数据变换成灰度级。接着，用数码图像处理软件将目标部位的灰度级数值化。
用激光实施损伤的血管周边中的荧光标记载体的空间分布通过测定灰度级进行评价。具体而言，以血管壁的损伤部位为中心，在血管长轴方向或与长轴方向垂直的截面方向的两个方向进行线扫描。通过线扫描，可以明白漏出到血管外的载体量及其分布的空间特异性。
下面，列举实施例更具体地说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
实施例1 脂质体的制备将1g混合脂质粉末(DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)/胆固醇/DPEA/∶PEG-DSP(N-(单甲氧基聚乙二醇氨基甲酰)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)＝5/5/10/0.033(摩尔比))分散于25mL生理盐水中，在室温下搅拌10小时。用挤出机使其透过孔径为0.22μm的过滤器2次，得到平均粒径为263±43nm的脂质体分散液。用生理盐水将脂质浓度调到3g/dL。对于该分散液20ml，一边搅拌一边滴入另外调好的600μL十八烷基若丹明B(Molecular Probe公司制)的乙醇溶液(1mg/1mL)，进而在避光下搅拌2小时。通过离心分离(10万g、60分钟+15万g、30分钟)使脂质体沉降，除去残存于上清中的微量未导入色素和乙醇。添加生理盐水，使小泡再分散，最后透过过滤器(孔径为0.45μm)。
测定所得脂质体的膜的电荷，结果是ξ电位为-2.6V。
实施例2 用图像解析法进行的脂质体活动解析1.生物体显微镜系统和微循环观察记录系统大鼠根据庆应义塾大学医学部实验动物中心的管理进行饲养。依照Suematsu等人的方法(Suematsu M，et al. Lab Invest 1994)，肌肉注射戊巴比妥钠50mg/kg来麻醉Wistar系雄性大鼠(200～250g，日本CLEAR，东京)，在大腿静脉中插入导管，给与1mg/kg羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)，对体内的血小板进行生物染色。
将回盲部的肠系膜打开到腹腔外，用直立型激光共聚焦显微镜观察微循环系统。
物镜使用60倍。在显微镜光路中可以输出将CFSE荧光图像化的488nm的氩激光以及将若丹明B图像化的568nm的激光，单独对前者的绿色荧光或者单独对后者的红色荧光进行拍摄，进而同时对二者进行拍摄，安装将合并图像化的滤光器，进行自由切换。还可以在无滤光器的状态下获取透射光线图像。此外，安装能够自由地定量控制输出的氮色素激光(微点激光烧蚀Micropoint laser ablation)，通过将微小血管的任意位置设置在显微镜画面中央，由此可以用1微米的光束引起细胞损伤。通过改变输出能量，可以从制作伴随有破裂出血的(即伴随有基底膜损伤的)出血，直至制作仅有几个红细胞漏出、不伴随有血小板的一次凝聚块形成的仅为连接处外漏(junctionalleakage)的血管内皮细胞损害。
即，在本系统中，把以下3点作为指标，可以制作不同程度的血管内皮细胞伤害，即(1)有无因基底膜伤害导致的破裂出血，(2)有无以伤害点作为基点的血小板凝集块，(3)有无用透射光线图像能够识别的红细胞漏出到内皮下腔中。没有这3种变化的实验判定为没有因氮色素激光导致的伤害。
为了获得血小板的图像和涂抹有若丹明B的脂质体图像，在显微镜光路中安装高灵敏度的CCD照相机(C5810、滨松PHOTONICS制)，图像全部作为DVD图像进行8位彩色数码保存。脂质体使用以已有方法制成的平均粒径为263nm的脂质体，记录控制的微循环图像之后，每100g大鼠注射250μl的脂质体分散液(分散液中脂质体的体积比例为35％(样品中推定脂质体数为4.8×1012个/毫升))，在进行微点激光烧蚀之前以及实施之后花30分钟进行解析。
2.图像解析法根据记录的荧光图像，进行从血管漏出的若丹明B标记脂质体(以下也称为Rh-lipo)的分布和量的半定量解析。以血管壁上的氮激光照射部位(point of injury、伤害部位)为中心，在血管的长轴方向或法线方向设定轴，用8位灰度级(0-255)测定漏出到内皮下腔的荧光的强度。在测定中使用图像解析软件(MetaMorph 6.1，Universal ImagingCorporation)，如图1所示，沿着血管的长轴每2微米或者沿着法线每5微米测定灰度级。灰度级的测定在各单位微米内把10个位置左右的测定值的平均值作为代表值，用在4只不同动物、不同小动脉、小静脉中测得的平均值(标准误差)表示数据。
3.结果(1)正常微循环中的脂质体活动通过本实施例中所用的CFSE标记规程，对循环血液中约80％的血小板染色。这些血小板在画面上被拍摄成绿色的虚线状。注入Rh-lipo则荧光一过性地通过观察视野，虽然其一部分稍微将被认为是小静脉内皮细胞连接处的部位染色，但大部分分布在血液空间中。此时，被CFSE染色的血小板的色调没有变化，由于能够识别为绿色，因此认为给与的Rh-lipo掺入到血小板内的可能性低。此外，Rh-lipo给与后，未见血小板在血管内皮细胞中的一过性粘附反应发生大的变化。这些结果成为表示脂质体的给与不会对血小板的活动带来影响的佐证。
(2)伴随着微点激光烧蚀的脂质体的活动在上述(1)条件下通过一定的激光能量(以5Hz照射4-nsec energypulse的激光约5秒，激光发生机出口的输出为300μJ)在小动脉、小静脉血管(直径为20～40微米)中进行微点激光烧蚀。
图2表示小动脉中的烧蚀后的Rh-lipo的活动。图中，箭头表示伤害部位，A表示小动脉，V表示小静脉。左上图表示Rh-lipo的活动，右上图表示CFSE标记血小板的活动，左下图表示Rh-lipo和CFSE标记血小板的彩色标记的活动的叠加图像，右下图表示透射光的图像。确认在烧蚀后几秒内脂质体从血管内漏出，同时形成多个血小板集块。用红色显示的若丹明标记荧光图像可明显示出(图2左上图)，脂质体从伤害附近的血管内皮连接处漏出，不扩散而停留在基底膜和内皮细胞的分界(内皮下腔)，并且在血管长轴方向不扩散而充满局部，可见局限性的蓄积。这些现象证明，本实施例中所用的脂质体在血管内皮细胞损伤部位特异性地聚集，填充内皮下腔。
另一方面，血小板以伤害点作为基点形成凝聚块，如合并图像所示，未见与脂质体的重叠，双方荧光的重叠也很少(图2左下图)。这表示在本实施例中所用的负电荷脂质体不依赖于与血小板的相互作用而聚集在伤害局部。同样的Rh-lipo活动，如图3所示，与伤害了小静脉中的血管内皮细胞的情况相同。但是，零星地看见在小静脉中血小板粘附在将血管壁附近翻转的白细胞上，或者脂质体部分掺入卷有白细胞的血小板凝聚块之中等现象。应说明的是，在图3中，箭头表示伤害部位，V表示小静脉。左上图表示Rh-lipo的活动，右上图表示CFSE标记血小板的活动，左下图表示Rh-lipo和CFSE标记血小板的彩色标记的活动的叠加图像，右下图表示透射光的图像。
(3)Rh-lipo在血管内皮下腔中的聚集图4表示小动脉的伤害部位中的脂质体聚集的解析结果。箭头表示伤害部位。图4右侧的图像表示直径从上到下依次为22.4、21.7、23.0及26.0μm的小动脉的伤害部位中的Rh-lipo聚集图像，左侧的图像是将各个小动脉的脂质体漏出图像化而得到的图像。解析在脂质体漏出和聚集达到稳定状态的烧蚀后的5分钟以后进行。将这些数据的平均值图像化之后所得的图像为图5，确认脂质体聚集在以伤害部位为中心的约30微米内外。即使法线方向的解析也显示以伤害部位为中心的局限的聚集，粒子向伤害部位相对侧的转移是微小的。另一方面，在小静脉中发生以伤害部位为中心约40微米范围的聚集。法线方向的分布也与小动脉的情况基本相同，但有时可见脂质体向与伤害部位相对侧的血管壁的转移。
无论在小动脉和小静脉的任何一种血管种类中，本实施例所使用的脂质体都具有向血管内皮细胞伤害部位聚集、漏出的作用，具有聚集在血管内皮下腔来填充伤害部位的作用，其作用表现为不依赖于与血小板的相互作用。
实施例3 炎症刺激下的脂质体的活动本实施例不是机械刺激肠系膜，其目的在于明确以一般的炎症物质刺激时的脂质体的活动。炎症刺激物质使用组胺。与实施例2的方法相同，肌肉注射戊巴比妥钠50mg/kg来麻醉Wistar系雄性大鼠(200～250g)，在大腿静脉中插入导管。将回盲部的肠系膜打开到腹腔外，用直立型激光共聚焦显微镜观察微循环系统。物镜使用60倍。
将用实施例1的方法制成的脂质体分散液按每100g大鼠250μl(250μl/100g大鼠，分散液中脂质体的体积比例为35％(样品中的推定脂质体数为4.8×1012个/毫升))通过导管注入到大腿静脉中。
脂质体注入10分钟后，开始组胺(30μM)的superfusion(表面灌流)(流速2ml/min)，拍摄脂质体的活动10分钟。将组胺灌流开始0分钟、2分钟后的小动脉(A)及小静脉(V)中的脂质体的若丹明标记荧光图像显示在图6的左上和右上图中。中央下图表示组胺灌流开始2分钟后的透射光的图像。
通过组胺2分钟的表面灌流，小静脉的血管内皮细胞的大孔打开，以开口的大孔为对象，可以确认白细胞(WBC)旋转后聚集的样子(图6中央下图)。认为组胺灌流的结果是，在周围浸润的白细胞游离出细胞因子，引起组织的炎症。图6右上图表示脂质体聚集、填充于开口的大孔中。即，明确脂质体通过填充作为侵入白细胞组织中的门户的大孔，由此抑制白细胞的组织侵入(聚集)。
在因组胺等导致的炎症反应中，内皮细胞之间的大孔的开口是决定炎症反应程度的重要因子。特别是浮肿，在因组胺导致的急性炎症中，由大孔开始，首先蛋白质成分少的体液从血管内漏出到组织中，接着含有血浆蛋白的体液从血管内漏出到组织中。已知这种炎症通常在小静脉中发生。由图6可知，本发明的脂质体的聚集、填充都仅在小静脉观察到，不存在于小动脉中。
因此，通过本实施例，本发明的脂质体显示出具有聚集在炎症部位而抑制炎症的作用。
实施例4 小鼠的各组织中的血浆漏出量的评价在本实施例中，使用伊文思蓝(Evans blue)示踪器，进行小鼠(C57BL/6)各组织(脑、肝脏、肾脏及肺)的微小血管中的血浆漏出的试验·评价。
(1)脂质体的制备脂质体与实施例1相同地进行制备，得到平均粒径为247±129nm、分散液中的体积率为35％、粒子浓度为约4.5×106个/μl的脂质体分散液。
(2)试验方法用尿烷(600mg/kg)/α-氯醛糖(60mg/kg)麻醉小鼠(C57BL/6)，插入气管插管(自动换气)之后，在大腿部的静脉中插入套管。
从大腿部的静脉注入脂质体的分散液，使得相对于小鼠体重达到5μl/g。
接着，为了制作脑缺血模型，在堵塞左右颈动脉(BCCA)1小时后，进行再灌流。
从大腿部的静脉注入伊文思蓝。应说明的是，伊文思蓝色素的储备溶液为3％w/v(in PBS)，用过滤器过滤，于4℃下保存。注入量为相对于小鼠1g体重注入5μl(50mg/kg)将上述储备溶液用PBS(1％溶液)稀释4倍后所得之物。
继续上述灌流(缺血灌流)4小时，然后，用37℃的100mM枸橼酸缓冲液(pH3.5)进行心脏灌流。组织学上利用小鼠组织时，用在50mM枸橼酸中使仲甲醛溶解1％所得之物进行灌流。通过在低pH下预先固定，由此保持伊文思蓝和清蛋白的结合。将小鼠腹侧部用大头针固定在软木板上，打开胸部腔，使心脏露出。在左心室(正好为顶尖部的右侧)插入21G的蝶形针，然后进行灌流。在左心房添加小裂缝。由此，将全部的血液和伊文思蓝从脉管冲洗是非常重要的。
小鼠的各组织(脑、肝脏、肾脏及肺)用枸橼酸缓冲液简单地进行冲洗之后，用纸巾轻轻地擦干净。称量各组织的重量之后，与0.5ml甲酰胺一起装入到4ml的玻璃管形瓶中。
将各玻璃管形瓶在55℃下搅拌一晚，提取伊文思蓝。第二天早上，将每100μl甲酰胺提取样品与伊文思蓝标准液一起转移到比色杯中，用分光光度计(OD620～OD750)测定各样品中的伊文思蓝的量。
由测得的OD值通过使用了标准曲线的换算求出伊文思蓝的浓度(ng/mg)。另外，伊文思蓝使用添加到1ml的甲酰胺中的在55℃下搅拌一晚所得之物。换算值成为相对于小鼠各组织的重量(mg)的伊文思蓝的量(ng)。
作为对照，在上述试验方法中，对仅不进行左右颈动脉(BCCA)的堵塞及其后的灌流(缺血灌流)的情况(Sham假手术组)和仅不进行脂质体的注入的情况(载体组Vehicle)进行研究。
(3)试验结果·评价结果示于图7～9中。
图7是将作为对照的假手术组伊文思蓝浓度(ng/mg)设为1.0时，各组织(脑、肝脏、肾脏及肺)中以相对值表示的载体组和本实施例情况的浓度的图。图8是各组织中以绝对值表示伊文思蓝的浓度(ng/mg)的图，其中，仅将脑的扩大图示于图9中。
由这些结果可知，在各组织中，特别是在脑中，相对于假手术组，载体组中的血浆漏出量显著，而且相对于载体组，本实施例中的血浆漏出量有效地减少。在不进行缺血操作的脑、肾脏及肺中，未见伊文思蓝的漏出增加。即，本发明的脂质体在脑组织中的微小血管中，形成因脑积水等炎症引起损伤时或者能够引起损伤的状态时，显示出能够有效地抑制或阻止这种损害。
产业实用性通过本发明，提供了表面为非阳离子性的，能够粘附、聚集在组织损伤部位的，特异性地填充损伤部位的载体，含有该载体的医药组合物。本发明的医药组合物可以作为具有止血作用或抗血栓作用等的血小板功能控制药使用。此外，本发明的医药组合物可以用于向血管损伤部输送药物(DDS)中。
进而，通过本发明，使用高速共聚焦显微镜，可以多色且实时地观察载体在组织内的活动。本发明的方法由于能够直接观察血管中的载体活动，因此可以在新型药物载体或具有高选择性的药物载体的研究、开发中使用。


本发明提供聚集在损伤组织的、作为血小板功能控制药而起作用的载体，使用所述载体的药物输送方法以及含有所述载体的医药组合物。此外，本发明提供表面为非阳离子性的载体，含有所述载体的药物输送体及医药组合物。