专利名称:抗雄性特异抗原的抗体及其制备方法本发明涉及抗雄性特异抗原的抗体及其制备方法。在近交系小白鼠皮肤移植实验中，发现同性间的移植以及由雌性移植到雄性时不产生排斥，但由雄性移植到雌性时会诱导免疫反应而使移植片全部被排斥(Eichwald，E.J.及Silmser，C.R.1955)。而这是由在Y染色体上的遗传因子的发现生成物所引起，该生成物含有组织相容性Y抗原，或H-Y抗原，加上其它可能性，而将它命名为雄性特异抗原。本发明中，将抗雄性特异抗原的抗体称之为“抗雄性特异抗原”或“雄性特异抗体”。已知，这种抗雄性特异抗原的抗体，在近交系小白鼠中，可用雄性小白鼠的脾脏或睾丸使雌性小白鼠免疫致敏，再回收后者体内的抗体而制备获得(Wachtel.S.S.Koo.G.C.，Zuckerman，E，E，Hammerling，U.，Scheid，M.P.及Boyse，E.A.(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.Vol 71，1215;Utsumi，K，Sato，E，及Yuhara，M.(1983)，J.Reprod.Immunol，Vol.5(Sul.1)，59)。但是，对于用这种方法制备的抗体的特异性，并没有进行详细的研究，特别是没有提示这种抗体是否能与雄性精子结合。而近 系小白鼠一般是近交系动物通过群体交配培育、维持的，是近交种系， 遗传因子构成的血缘系数不一定高，因此可以预计，用这种近交系动物制备的抗体的特异性不会太高。据Proc.Natl.Acad，Sci.USA，Vol 70，N.5、 502-1505，1973的记载，由排斥来自雄性小白鼠皮肤移植后的雌性小 鼠所得之抗血清，是与精子的头部结合，而本发明之抗体则是与雄性精子的中心体部进行特异结合，因此与本发明之抗体不同。本发明提供了用极简单的方法制备特异性高的抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)的方法，以及用该法制得的抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)。通过提供一种以与雄性精子中心体部进行特异结合为特征的抗雄性特异抗原的抗体，以及提供一种与雄性精子中心体部特异结合的抗雄性特异抗原的制造方法，达到上述本发明之目的;此方法的特点是摘出雄性动物的细胞、组织或器官，并将其注射到雌性动物体内，再从雌性动物的血液中回收抗体。通常，实验动物经过成对交配约20代继代繁殖时，其血缘系数达到99.8%以上，在这种状态下，雄性动物及雌性动物，除产生雄性特异抗原的遗传因子之外，其它各种遗传因子都具有相同的遗传基团结构，对这种动物集团称之为纯种系，与群体交配方法继代的近交系动物不同。因此，一旦建立起这种纯系动物，就可以用产生雄性动物的雄性特异抗原的器官(如睾丸等)，通过使雌性动物发生免疫致敏这种极其简单的方法，便能使免疫致敏的雌性动物在血清中产生抗雄性特异抗原的抗体，即抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)。然而，建立上述那种纯系时，需要很长的时间和严格的管理，操作十分困难。也就是说，为了建立纯系必须进行20代以上的成对交配，此处说的成对交配是指由共同双亲生的子动物中仅一对雌雄繁殖，而与其它动物隔离开进行反复培育的方法，这种方法与多对双亲动物一起繁殖的群体交配不同，为了反复继续繁殖，需要极其严格的管理，因此，建立纯系时的动物种非常之少。本发明者通过使动物长年反复成对交配，成功地建立了仓鼠的纯系，并以此为基础完成了本发明。
本发明方法适用于能确立纯系的各种动物。列举如小白鼠、大白鼠、仓鼠、兔、猪、豚鼠、牛等各种动物种。在本发明中，用本发明者首次建立的仓鼠纯系对本发明进行具体说明。该纯系是经过8年20代的成对交配建立起来的，它具有99.8%以上的血缘系数。
本发明方法，是通过由含有雄性特异抗原的雄性动物得到的免疫原制备物，使雌性鼠免疫致敏。该免疫原制备物可以用显现有睾丸、脾脏、脑等雄性特异抗原的细胞、组织或器官制备而获得，其中以睾丸为理想。对这些细胞、组织或器官，一般采用匀浆处理为最方便。当雌性动物进行免疫致敏时，最好使用作为免疫化补助剂的弗罗因德氏(Freund′s)的完全佐剂等，例如和匀浆等容量使用，颇为满意。免疫致敏是通过对雌性动物的皮下注射皮内注射、腹腔内注射或脾脏的直接注入等方法进行。这种免疫致敏以一周的间隔进行5次左右。在最后一次免疫致敏约10日后，采取动物血液，再用从血液中回收抗体的常规方法分离出目标抗体。
如此制得的本发明抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)，能够与各种哺乳类动物，如仓鼠、小白鼠、大白鼠、猪、人等的雄性精子结合。例如，将供试验的精子经离心洗净后，在含有如5%牛血清白蛋白的台罗德氏液的缓冲液或等渗磷酸缓冲液中和本发明之抗体一起孵化，之后再次进行洗净，将未结合抗体以及非特异结合的抗体从精子中分离除去。下一步将该精子与用FITC萤光异硫氰酸盐)(Fluorescein isothiocyanate)标记的兔抗仓鼠IgG一起孵化，然后再次洗净。将如此制备的精子放在萤光显微镜下进行观察。观察时可见本发明之抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)，不仅和仓鼠，而且和小白鼠、大白鼠、猪、牛以及人的精子的大约半数相结合。另外，利用人的精子中具有Y-染色体，即雄性精子用喹吖因芥子染色出现称之为F-体的光点(Barlow等1970)，进行喹吖因芥子染色和抗雄性特异抗原萤光免疫染色的双重染色时，可见用喹吖因芥子染色显示F-体的精子，也被萤光免疫染色所着色。由此结果可以合理地推断本发明之抗体为不仅能与仓鼠，而且能与小白鼠、大白鼠、猪、人等广泛种类之雄性精子结合的抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)、并确定为Ig G类。
以下根据本实施例进一步具体说明本发明。
实施例1抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)的制备将经过20代成对交配的纯系雄性仓鼠的睾丸摘出，用市售高速搅拌器将其搅匀，再与等容器的弗罗因德氏的完全佐剂混合制成乳剂。将该乳剂给予两支纯系雌性鼠皮下注射，各注入1ml，使之引起免疫致敏。共注射5次，每次间隔一周，在最末一次注射后第10日，用颈锥脱臼法将动物杀死，剖腹，从心脏取血。用此法可从1头动物中取得4ml血液，2头动物则取得8ml血液。
将该血液在4℃下放置一夜，使血液凝固，再于0℃下以20000Xg进行10分钟的离心分离，如此便可从2头动物中取得4ml抗血清。将这样制得的抗血清在56℃下进行30分钟的热处理，就可得到含有抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)的抗血清。
实施例2各种精子的雌雄识别将仓鼠、小白鼠、大白鼠、牛、猪及人的精子分别用含5%牛血清白蛋白的台罗德氏液或等渗磷酸缓冲液进行2～3次的离心洗净(250～300Xg，10分钟)，制成悬浮在台罗德氏液或等渗磷酸缓冲液的精子悬浮液。将该精子悬浮液和含有实施例1中制备的抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)的血清混合，在37℃下孵化30分钟。然后，再用台罗德液或等渗磷酸缓冲液在250～300Xg下进行1～2次洗净，每次10分钟，以除去未结合抗体和非特异吸附的抗体。随后将此精子用FITC标记的兔抗仓鼠Ig G在37℃下处理30分钟。再用含5%牛血清白蛋白的台罗德氏液或等渗磷酸缓冲液，在250～300Xg中离心洗净10分钟，然后将其放在无萤光的载玻片上，用盖玻片复盖后，再以透明指甲油密封，做成供萤光观察的标本。将这样制得的标本用萤光显微镜观察时，能清楚地看到大约有半数存在于标本上的精子结合有抗体。
另外，在此实验中，抗体是用兔抗-仓鼠Ig G抗体检出的，因此用上述方法制备的抗体显然属于Ig G类。
此项结果如图1～图4所示。这些图均为用萤光显微镜对按上述方法制备的标本的相同部分进行可见光观察(A)及萤光观察(B)的显微镜照片。
实施例3按上述方法将人的精子洗净后，在含有2%多聚甲醛、75m M赖氨酸、10mM偏过碘酸钠及32.5mM磷酸缓冲液(PH为6.2)的溶液中，在4℃下固定1小时，再用等渗磷酸缓冲液，像上述那样离心洗净两次，然后涂抹在载玻片上干燥，然后，对附着在载玻片上的精子进行如下处理。
首先，在含有5%牛血清白蛋白的等渗磷酸缓冲液中于37℃下孵化1小时之后，在含有抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)的血清中于37℃下孵育30分钟，又在生物素(biotin)化抗仓鼠-Ig G中于37℃下孵育30分钟，再在碱性蕊香红标记的抗生物素蛋白中，于37℃孵育30分钟，最后在0.005%的喹吖因芥子中室温下孵育30分钟。在上述过程中，移到下一步孵育时要用等渗磷酸缓冲液清洗。最末一次洗净之后，用盖玻片覆盖以供观察。
观察结果如表1所示。采用不同的三人所提供的精子进行三次不同的实验，若用开平方法检定实验，不同精子提供者之间的实验结果没有有意义的差别。当用3次不同实验的总计进行开平方检定时，精确度在0.1%以上，可见被免疫染色的精子也被喹吖因芥子所染色。因此可以定论，本发明之抗雄性特异抗原仅是具有Y染色体的精子，即雄性精子。
表1人精子双重染色结果喹吖因染色 + + - -免疫萤光染色 + - + -实验1 216 16 51 210(43.81) (3.25) (10.34) (42.60)实验2 153 28 38 174(38.93) (7.12) (9.67) (44.27)实验3 162 30 35 191(38.76) (7.18) (8.37) (45.69)合计 531 74 124 575(40.72) (5.67) (9.51) (44.10)“+”表示染色时被着色，“-”表示未被着色，示出其综合结果。表中括号内的数值表示每个实验在整体中的百分率。各实验是采用不同人提供的精子独立进行的。
图5示出结果之1例。该图示出头部的喹吖因萤光部位及抗体结合的中心体部。判定精子(A)和(C)是雄性精子，精子(B)是雌性精子。
以上结果清楚表明本发明之抗雄性特异抗原(雄性特异抗体)可以用简单方法制造。由于使用了这种抗体，就能用一种抗体来识别多种哺乳动物精子的雌雄。进而，又可利用本发明之抗体对雄性精子的特异结合来区分精子的雌雄。
以下对图进行简单说明。
图1～图4为实施例2中萤光染色的各种精子的显微镜照片，是代替表示生物形态图的照片。图1、图2、图3和图4分别表示仓鼠、小白鼠、大白鼠和牛的精子，(A)为可见光下观察所见、(B)为萤光下观察所见。
图5是实施例3显微镜下观察的草图。


本发明涉及抗雄性特异抗原的抗体及其制造方法。具体地说，是提供一种与雄性精子中心体部进行特异结合的抗雄性特异抗原的抗体及其制造方法，该方法甚为简单，特征是摘出雄性动物的细胞组织或器官，通过一系列的处理之后注射到雌性动物体内，使之产生免疫致敏，再从其血液中回收抗体。应用本抗体及本抗体对雄性精子的特异性结合，可以鉴别多种哺乳动物精子的雄雌。