专利名称：微生物发酵生产豆豉溶栓酶的方法豆豉溶栓酶(Nattokinase，简称NK)是一种碱性丝氨酸蛋白酶，无毒性，可口服(李江伟等，中国药学杂志，1999)，易被人体吸收，能直接溶解纤维蛋白，具有强烈溶栓功能(郝征红等，农业工程学报，2008 ;彭勇等，高技术通讯，2002)，且溶栓作用时间长，作为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物，具有广阔的应用前景(陶琳，氨基酸和生物资源，2004)。早期临床上应用最多的溶栓剂是链激酶、尿激酶等，虽可以促进血液中血纤维蛋白溶酶的形成或可以直接对血栓进行溶解，但都存在不同程度的不足，如半衰期短、抗原性强、副作用较大等，很难成为一种大众药品(卢露，中国调味品，2011)。国内外关于微生物发酵NK研究处于起步阶段，我国主要集中在菌株选育、发酵条件优化、酶学性质，酶分离纯化以及工程菌构建等(陶琳，氨基酸和生物资源，2004 ;豆孝伟，现代食品科技，2006)。微生物发酵生产NK产业化，规模化生产及作为口服溶栓剂应用还未见报道。微生物发酵生产的NK具有安全性好、不会引起免疫反应、作用迅速、持久、成本低、口服亦有效的优点，弥补了临床溶栓药物的不足。本发明微生物发酵生产NK可以形成一定规模化，生产周期短，成本低，产量高，促使快速治愈脑血栓、肺血栓、急性心肌梗塞等血栓性疾病成为可能。微生物发酵NK具有广阔的开发潜力和应用前景。
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产NK的方法。该方法主要是微生物经过产物定向驯化后，在26°C 32°C液体发酵生产NK的方法，这种生产方法获得的NK粗酶液活性可以达到180U/ml，如再经过系列分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶活性为5000U/ml或5000U/mg，口服2000U 4000U每日用量应用于量小鼠实验，22 37天表现出明显的溶栓效果。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免其它溶栓剂应用的弊端。本发明所述的一种微生物发酵生产NK的方法具体包括以下步骤(I)将产生NK的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；(2)按常规方法将NK产生菌在26 32°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在26 32°C培养72 144h时，即微生物发酵生产NK结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(3)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。NK产生菌(例如，CGMCC菌种编号1. 354或I. 769)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产NK。产酶驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在零下80°C条件下可以长期保藏。/实施例一(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水I. 0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种产物定向驯化培养基蛋白胨3.0 7.0g，牛肉膏3.0 7.0g，纤维蛋白10. 0 20. 0g, NaCl 5. 0 15. 0g，琼脂20g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基胰蛋白胨8.0 12. 0g，酵母粉4.0 6. 0g，NaCl 8. 0 10. Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖13. 0 17. 0g，蛋白胨13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. lg, CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3 0.7g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生NK的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将产生NK的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的NK产生菌在26 32°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3 5%的接种量接入10L的产酶培养基中，在26 28°C培养120 144h时，即微生物发酵生产NK结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的NK制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水1.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种产物定向驯化培养基蛋白胨3. 0 7. 0g，牛肉膏3. 0 7. Og,纤维蛋白10.0- 20. 0g，NaCl 5. O 15. Og，琼脂20g，蒸馏水I. 0L pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液 体种子培养基胰蛋白胨8.0 12. 0g，酵母粉4.0 6. 0g，NaCl 8. 0 10. Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖13. 0 17. 0g，蛋白胨13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. lg, CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3 0.7g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生NK的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将产生NK的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的NK产生菌在26 32°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在28 30°C培养96 120h时，即微生物发酵生产NK结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的NK制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水
1.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种产物定向驯化培养基蛋白胨3. 0 7. 0g，牛肉膏3. 0 7. Og,纤维蛋白10. 0 20. 0g, NaCl 5. 0 15. 0g，琼脂20g，蒸馏水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基胰蛋白胨8.0 12. 0g，酵母粉4.0 6. 0g，NaCl 8. 0
10.Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖13. 0 17. 0g，蛋白胨13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. lg, CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3
0.7g,自来水1. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生NK的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将产生NK的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的NK产生菌在26 32°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入100L的产酶培养基中，在30 32°C培养72 96h时，即微生物发酵生产NK结束；
(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离 纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的NK制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产豆豉溶栓酶(简称NK)的方法是将产生NK的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在26～32℃环境条件下生长良好；将产物定向驯化的NK在26～32℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在26～32℃培养72～144h时，即微生物发酵生产NK结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。