专利名称：一种辅酶q10生产的固料母种发酵培养的方法辅酶QlO (2，3 二甲氧基-5-甲基6癸异戊烯基苯醌，Coenzyme Q10，CoQlO)，又名泛醌，癸烯醌，广泛存在于动物、植物及微生物体内，是生物细胞呼吸链中的重要递氢体。辅酶QlO是一种重要的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。同时，Co QlO还具有抗衰老作用，在化妆品和保健品领域有广泛的市场。辅酶QlO的制备方法主要有3种，即动植物组织提取、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动物辅酶QlO含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法在技术上比较成熟，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，生产成本高，限制其工业化生产的程度。 微生物发酵法由于原料廉价丰富，产物分离过程相对简单，产物为天然品，不存在异构体问题，生物活性好，易被人体吸收，且可以通过发酵罐实现规模化工业化生产，因此成为最有发展潜力的辅酶QlO生产方法。在微生物发酵生产中，种子的扩大培养是发酵生产的第一道工序，种子液质量的优劣对发酵生产起着关键作用。优良的种子可以缩短发酵周期、稳定产量与质量、提高设备的利用率。因此种子扩大培养是辅酶QlO发酵关键。目前，辅酶QlO发酵通常的种子培养工艺流程为斜面一母种一一级扩培一二级扩培一三级扩培(如需要)一发酵，其中大多数的母种都是采用液体发酵培养法。中国专利CN101519681公开了一种辅酶QlO的生产发酵工艺，在保持辅酶QlO发酵品质的前提下，根据辅酶QlO产生菌代谢过程中主要副产物5-脱甲氧基辅酶QlO的合成速率及其含量变化，反馈调节代谢初始反应，并对合成代谢起限速作用，从而对细胞内目的产物辅酶QlO的积累进行反馈调节，通过对发酵配方中主要底物浓度的优化，及在发酵过程中对搅拌转速的优化调控，使辅酶QlO的发酵水平有较大幅度的提升，辅酶QlO发酵水平可提高到3000u/ml以上，放罐最佳时机的确定提高了细胞内辅酶QlO生产的时间利用率， 降低了发酵成本，使发酵原材料消耗大大降低。
本发明的目的在于针对辅酶QlO发酵种子培养现有技术存在的不足，提供能提高产能的一种辅酶QlO生产的固料母种发酵培养的方法。本发明采用的菌种为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides JDW-610，已于2010 年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo. 4497。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明包括以下步骤1)菌种传代采用斜面菌种传代，斜面培养基培养；2)固料种子培养基的制备将固料培养基蒸煮后晾干，分装灭菌，所述固料培养基包含固料组分与液体组分；3)固料种子的培养将新鲜斜面菌种类球红细菌Iihodobacter sphaeroides加无菌水制成菌悬液，倒入固料培养基，培养后作为一级发酵的母种。在步骤1)中，所述斜面培养基的配方可为葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨 5g/L,氯化钠5g/L，硫酸铵0. 5g/L，维生素B1 1 μ g/L，维生素K 1 μ g/L，维生素A 1. 5 μ g/ L, Na2MoO4 · 2Η20 0. 8 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 L 2 μ g/L, KNO3 0. 33 μ g/L, NaBr 0. 44 μ g/L,琼脂20g/L，pH可为72 ；所述培养的条件可为灭菌温度121°C，灭菌时间25min，30°C避光培养Mh，4 °C保藏备用，使用前先活化。在步骤2)中，所述固料组分的配方按质量比可为麸皮25，大米25，小米50 ；所述液体组分的配方可为葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，氯化钙2g/ L，硫酸铵 0. 5g/L，维生素 B1 lyg/L，维生素 K lyg/L，维生素 A 1. 5 μ g/L，CuSO2 · 5H20 0· 6 μ g/L, Na2MoO4 · 2Η20 0. 8 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 L 2 μ g/L, KNO3 0. 33 μ g/L, NaBr 0. 44 μ g/ L，pH可为72;所述固料组分与液体组分的质量比可为10 7;所述蒸煮的温度可为80°C， 蒸煮的时间可为40min ；所述分装灭菌，可将固料培养基按200g/瓶分装进规格为IOOOmL 的K氏瓶中，灭菌的温度可为121°C，灭菌的时间可为30min。在步骤幻中，所述培养，可采用在30°C避光培养1 后再次摇勻继续培养至Mh。本发明在保持辅酶QlO发酵原有品质的前提下，根据辅酶QlO产生菌的生理特性， 通过大量的种子工艺优化实验，以简化种子工艺、提高辅酶QlO产能为目的，建立辅酶QlO 固料母种工艺，对其种子培养条件进行优化，提供了一种最终影响发酵，可提高产能的一种辅酶QlO生产的固料母种发酵培养的方法。本发明首次在辅酶QlO发酵扩种工艺中采用固料母种发酵培养的新方法，使用麸皮、大米、小米等固料代替琼脂粉制备固料种子培养基，由于麸皮、大米、小米作为固体载体相对琼脂平板具备更大的表面积，因此在有限的体积可提供更多的种子量；另外，由于这些固体原料本身富含多种生长因子，尤其是小米、麸皮的微量养分更丰富，因此非常有利于种子培养；同时，由于固料种子保存更方便，不易老化，因此便于发酵生产安排。由此可见，本发明相比液体母种具备以下优点①菌种细胞的生长活力强、同步性较好，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；②生理状态稳定，保持稳定的生产能力；③ 简化扩种工艺，更易安排发酵过程。本发明首次在辅酶QlO发酵中建立固料母种发酵培养方法，并应用于中试与大试发酵中，取得理想的发酵结果。^ \ ·①菌体形态个体较大，更饱满；②菌种活力较强，菌浓较高；③简化种子工艺。表1液体种与固体种摇瓶发酵结果终止发酵液检测种子工艺 _OD湿重(g/5mL)镜检效价(IU/mL)液体种0.1900.310菌体圆形、个小73.46液体种0.1980.317菌体圆形、个小76.25液体种0.1870.306菌体圆形、个小69.61固体种0.2110.324菌体圆形饱满、个大87.98固体种0.2270.336菌体圆形饱满、个大93.38固体种0.2240.334菌体圆形饱满、个大89.48 实施例2 液体种与固体种100L小试罐辅酶QlO发酵的比较固体种小试流程新鲜斜面一固体种一30L种子罐一100L发酵罐一发酵液提取 HPLC检测发酵水平。具体过程如下新鲜斜面与固体种子菌悬液的制备同上；将备好的固体种子菌悬液按1. 2%接种量接入 30L 种子罐，接后 15L，30°C，pH5. 5 5. 8, 200r/min, 0. 02 0. 04MPa,通气量 0. 8 1. Im3A避光培养30h ；将种子液按10%接种量压入100L发酵罐中，接后60L，32°C， pH5. 5 5. 8，200r/min, 0. 02 0. 05MPa,通气量 1. 8 2. 8m3/h 避光培养 88h 发酵结束， 在发酵40h后每他取样检测效价。液体种小试流程新鲜斜面一液体一级摇瓶种子一30L 二级种子罐一100L发酵罐 —发酵液提取HPLC检测发酵水平。具体过程如下斜面菌悬液的制备同上。将备好的斜面菌悬液按接种量接入液体一级摇瓶种子培养基，3(TC，200r/min避光培养Mh ；按1. 2 %接种量将一级摇瓶种子液接入二级种子罐，接后 15L，30°C，pH5. 5 5. 8，200r/min，0. 02 0. 04MPa，通气量 0. 8 1. lm3/h 避光培养30h ；将二级种子液按10%移种量压入100L发酵罐中，接后60L，32°C，pH5. 5 5. 8， 200r/min, 0. 02 0. 05MPa,通气量1. 8 2. 8m3/h避光培养88h发酵结束，在发酵40h后每取样检测效价。发酵过程总共进行2次补料，补料时间分别为发酵5 和72h，补料体积按发酵液中控制含糖量4g/L，pH5. 5 5. 8为准。液体种与固体种小试100L发酵实验结果对比如表2，结果表明固体种体现以下优点①菌种细胞的生长活力强、同步性较好，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；②生理状态稳定，保持稳定的生产能力；③简化扩种工艺，缩短发酵周期。表2液体种与固体种100L小试罐发酵结果


一种辅酶Q10生产的固料母种发酵培养的方法，涉及一种固料母种发酵培养的方法。提供能提高产能的一种辅酶Q10生产的固料母种发酵培养的方法。采用的菌种为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides。采用斜面菌种传代，斜面培养基培养；将固料培养基蒸煮后晾干，分装灭菌，所述固料培养基包含固料组分与液体组分；将新鲜斜面菌种类球红细菌Rhodobacter sphaeroides加无菌水制成菌悬液，倒入固料培养基，培养后作为一级发酵的母种。在种子工艺中使用，有效提高辅酶Q10发酵水平，节省发酵级数缩短了周期，简化生产环节，降低生产成本。