专利名称：基于细胞流式技术的芦笋抗性超雄多倍化育种方法游离小孢子培养是指以机械等方法分离出处于适宜生育期的植物花粉粒，在液体培养基上进行悬浮培养，进而诱导花粉胚和单倍体植株，最终经人工加倍处理获得基因型高。C纯合的双单倍体后代(DH群体)的过程。与常规的通过花药培养获得双单倍体的方法相比，游离小孢子培养具备明显优势(I)减除了基因型的影响，诱导频率高。小孢子为单细胞，群体数量大，单次培养的基数可达数十万个，即使诱导频率为万分之一，也能确保再生植株的成功诱导。(2)小孢子为裸露的细胞，消除了药壁组织的干扰，所产生的后代植株不会混杂来自药壁组织细胞诱导的二倍体植株，群体遗传背景均一。(3)小孢子可塑性强，·易于受培养环境因子的诱导，使之向着育种家期望的方向发育。(4)操作技术相对简单，分离效率高。目前，该技术已成功应用于油菜、大麦、小黑麦等作物的抗性突变体筛选、自交系的培育、倍性育种、植物基因转化、分子标记辅助选择等现代生物技术育种领域。成为提高作物杂种优势、固定作物杂种优质、培育多倍化纯系品种、抗性品种缩短育种周期的有效工具。并即将成为现代生物技术育种体系的核心技术。芦笋为百合科多年生宿根草本植物，雌雄异株，以嫩茎为产品器官，是深受消费者喜爱的保健蔬菜。自然条件下芦笋雄株发茎数多，产量比雌株高25%左右，因此全雄育种已成为国内外芦笋育种研究的热点。天然的芦笋雄株的基因型是Mm，雌株的基因型是mm，要获得后代全雄的Fl杂种种子，只能依靠超雄株MM与雌株_进行杂交，然而由于芦笋的遗传基础过于复杂，通过自交获得超雄株亲本往往需要十几年甚至更久，因此，在以往的常规育种中要获得一个优良的全雄杂交种十分困难，这也是芦笋种子价格昂贵的主要原因。近年来，随着现代组织培养技术的不断成熟，中国学者对芦笋的组织培养技术做了大量而卓有成效的研究，已成功诱导了芦笋再生植株，并开展了花药培养、脱毒培养技术基础上的倍性育种研究。使我国芦笋的新品种培育水平达到了国际先进水平。然而，由于花药培养不可消除的培养缺陷，获得单倍体植株和优良品系的效率并不高。一些早期引入的UC800、UC72、玛丽华盛顿等多是国外早已淘汰的品种，产量低、抗病性弱、品质差，导且形成经济产量所需的时间长，一般情况下当年育苗，第2年移栽，第3年才开始采收，与杂交品种当年育苗，当年移栽，第2年即可采收相比，晚了 I年。芦笋是多年生宿根蔬菜，一次栽培可连续采收15年，因此其品种的优劣将影响芦笋整个生命周期的产量与品质，并决定其栽培的成败。自20世纪80年代开始，我国各科研单位相继开展了芦笋育种的研究，随着组织培养等生物技术的发展，我国芦笋育种研究者利用现代生物技术与常规育种相结合，取得了较大的科研成果和进展，培育出了一些高产、优质、抗病的芦笋新品种。目前，单株无性系杂交育种是我国芦笋育种的主要方法即通过引进芦笋品种资源，根据选育目标，筛选出具有各种优良性状的雌、雄株作为杂交亲本，组配杂交组合，再对Fl进行比较鉴定，筛选出优良的杂交组合，并结合组培快繁技术，扩繁两个亲本的单株无性系，利用雌、雄亲本无性系进行规模制种，即可育成符合选育目标的新品种(系)。除此之外，山东、江西等地的研究者还利用秋水仙素处理超雄株获得四倍体超雄株，再与二倍体雌株杂交的方法培育3倍体全雄株的方法进行了芦笋多倍体品种选育的研究，并培育了 J2-2，潍紫P-7，井冈红等3倍体新品种。但上述品种并不具备具备耐盐、耐旱、耐贫瘠抗病等特性。
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种以人工游离的小孢子为外植体，以培育抗茎枯、耐盐多倍体超雄株为目的，综合运用小孢子培养、抗病耐盐突变体筛选、人工加倍和流式倍性分析等多种现代生物育种新技术培育芦笋品种的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来解决的一种基于细胞流式技术的芦笋抗性超雄多倍化育种方法，按照如下步骤·(I)挑选大田优良雄株，进行室内栽植、镜检；(2)机械分离小孢子；(3)对机械分离出的小孢子进行流式分选；(4)对流式分选出的小孢子进行悬浮培养；(5)对步骤(4)培养诱导的花粉胚进行抗性突变体筛选；(6)对步骤(5)获得的单倍体抗性植株进行人工加倍处理；(7)对步骤(6)获得的加倍再生植株进行流式分析；(8)将步骤(7)获得的四倍体超雄系分别进行田间选配杂交组合和离体快速繁殖；(9)将田间选配杂交组合所得三倍体抗性超雄株和离体快速繁殖所得植株进行品比试验；并将试验筛选优良株系用于品种申定和大田推广。所述步骤(I)是挑选大田高产、笋尖大小一致、无病虫害优良雄株，进行室内栽植、收集未开放小花、镜检，选择形态一致，处于单核期小花。所述步骤(2)是先将小孢子在10°C预处理7d+水解酪蛋白，然后机械匀浆7s、在9600rpm两次，过滤、200g洗涤，离心收集小孢子。所述步骤(3)是将回收小孢子无菌条件下流式分析，根据前向角散射光，将体积较大的E型花粉压电分选出来。所述步骤(4)是对流式分选出的小孢子进行悬浮培养，NBP99+10%FIC0IL 25°C,暗培养21-35d。所述步骤(5)是采用MES分化培养基+不同浓度抗性突变体毒素筛选压力，18°C，120001x,逐步诱导抗性单倍体植株。所述步骤(6)是采用体积百分比浓度O. 08%秋水仙素苗期蘸根人工加倍单倍体植株。所述步骤(7)是应用流式DNA含量分析技术，根据不同倍性植株间细胞核相对荧光强度差异，将加倍后群体中的四倍体植株鉴选出来。所述步骤(8)是将所得四倍体单株进行农艺性状评价，将抗病优良高产单株与二倍体优良雌株两两组合测定配合力。所述步骤(9)将杂交种播种与大田鉴定农艺性状和品种比较试验，优良单株用于新品种鉴定和推广。本发明的有益效果是(1)不同的外植体。以小孢子为外植体具有许多花药不具备的优势，效率更高、操作更简单，国际和国内尚没有展开过类似的研究和应用。(2)技术综合性强。综合了多种现代生物技术育种新技术，育种周期更短，效率更高。(3)品种综合性强。选育的品种将集多种优良特性于一身，而不是简单意义上的脱毒快繁。(4)育种技术新。图I为本发明的小孢子培养高效诱导芦笋单倍体的方法流程图。··
D倍性育种很多二倍体植株经加倍后都会引起器官巨大化，如菠菜、甜菜四倍体品种的产量要远高于二倍体，三倍体的无籽西瓜产量也常常高于二倍体。天然芦笋雄株基因型为Mm，进行花粉培养后可得到M或m单倍体，一次加倍后可得到二倍体MM (超雄株)和mm个体，它们与其他品种的丽和mm植株进行互补杂交即可获得全雄的Fl杂种。当丽和mm植株进行再次加倍后可获得四倍体MMMM植株和mmmm植株，当MMMM和mm植株杂交时便可获得三倍体不育超强雄株MMm，由于倍性的增加和生殖生长缺失引起的营养节约将使三倍体全雄芦笋具备更高的产量和品质，至于更高倍性的杂种是否会进一步提升产量我们还不得而知，但仍值得去探索尝试。E流式鉴定流式细胞术是上世纪八十年代发展起来的一项细胞粒子高速分析、分选技术，已广泛用于医学领域。其原理是不同倍性的细胞具备含有不同大小的核DNA，当这些DNA被DNA特异结合性荧光染料染色之后，在激发光的激发后会产生自发荧光，自发荧光的强弱与荧光染料的多少正相关，也代表着核DNA含量的多少核倍性的大小。当这些被染色的细胞粒子经过一个检测点的时候，不同大小的细胞就会被识别和分选。其精。C可以达到板半条染色体的差异，当芦笋再生植株被加倍后，如何快速检测众多再生个体的倍性就变得非常紧迫，而流式分析技术为我们提供了非常便捷的方法，它能够在一个工作日内检测上百个植株，而如果采用常规细胞压片染色体记数方法来鉴定，要完成一个材料的鉴定往往需要一到数周。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。


本发明公开一种基于细胞流式技术上的芦笋抗性超雄多倍化育种方法，按照如下步骤(1)挑选大田优良雄株，进行室内栽植、镜检；(2)机械分离小孢子；(3)进行流式分选；(4)进行悬浮培养；(5)进行抗性突变体筛选；(6)进行人工加倍处理；(7)进行流式分析；(8)将步骤(7)获得的小孢子分别进行田间选配杂交组合和离体快速繁殖；(9)将田间选配杂交组合所得株体和离体快速繁殖所得株体进行品比试验；并将试验所得株体用于大田生产。本发明的有益效果是(1)育种周期更短，效率更高、操作更简单；(2)品种综合性强；(3)育种技术新。