一种添加植物原料以提高丁醇生产菌发酵性能的方法[0002]丁醇既是重要的大宗化工原料，又是继乙醇后的一种极具发展前景的新一代液体燃料，通过产溶剂梭菌Clostridia的厌氧发酵,可将合适的碳水化合物转化为丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)等溶剂，此类溶剂生产技术因而也被简称为ABE发酵。[0003]丙酮丁醇发酵的研究始于19世纪。到在20世纪初，由于汽车工业的发展，需要大量的丙酮和丁醇作为合成橡胶的原料，这在一定程度上促进了丙酮丁醇发酵工业的发展。到了 1914年,著名的Chaim Weizmann博士成功分离出了一株菌,命名为ClostridiumacetobutylicunK丙酮丁醇梭菌)，它能够发酵各种谷物原料生成溶剂。该菌的发现为丙酮、丁醇发酵的工业化奠定了基础。在1914年爆发的第一次世界大战中，丙酮作为制造炸药的原料，其需求量大大增加。英国，美国，日本等国建立了多家丙酮丁醇发酵工厂，这使得丙酮、丁醇发酵工业成为继乙醇发酵工业之后的第二大发酵工业。由于丙酮丁醇梭菌是严格厌氧菌，这一工业也成为历史上最大的厌氧发酵工业。[0004]梭状芽胞杆菌Clostridia目前是产溶剂工业菌种的唯一来源。近年来，通过系统学、基因组DNA/DNA杂交和DNA指纹图谱以及发酵性能等方面的比较研究和分析认为，工业用的产溶剂梭菌归为4个 “种”(Species)，所有原来的淀粉发酵型菌株属于单独一个种，即丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum。该类菌呈现较强的淀粉酶活力，适用于发酵玉米和谷类等淀粉质原料，同时具有独特的系统发育特性，与其他3个紧密相关的种，即拜氏梭菌Clostridium beijerincki1、糖丁酸梭菌Clostridium Saccharobutylicum和糖乙酸多丁醇梭菌 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 的亲缘关系较远。[0005]丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)作为一类产孢厌氧菌,其发酵过程分为产酸期和产溶剂期两个阶段。但是对该菌进行连续的传代培养后发现，其产溶剂能力会逐渐退化，这在产溶剂发酵过程中，尤其在连续发酵过程中，是一个较为严重的问题。有研究学者发现，菌种传代超过10次，就失去了发酵葡萄糖的能力。为了缩短发酵过程的延滞期，增加菌种产溶剂能力，通常丙酮丁醇梭菌需保存于强化培养基基中，发酵前必须经过活化培养即热激(heat-shocking)化才能在淀粉或葡萄糖培养基中生长良好。[0006]丙酮丁醇梭菌代谢过程中伴随着生成大量的H2，这一反应主要是依靠铁氧还蛋白氧化还原酶和氢酶的催化而完成的。研究证明，丙酮丁醇梭菌生长过程中与培养基中氧化还原电位密切相关，nadh2/nad作为胞内氧化还原反应的电子供体，增加nadh2/nad的转化率能够增加丁醇的产量。为了在微氧或厌氧条件维持微生物细胞内最佳的nadh2/nad比率，可采用添加电子受体或改变底物氧化还原状态以实现对nadh2/nad比率的调节。已有研究表明，醛、酮、酸、分子氮或硝酸盐均能作为外源电子受体，加速NADH氧化，维持细胞处于最佳氧化还原状态。但是不同种类醛、酮、酸等小分子有机物(如丁香醛，阿魏酸，葛根异黄酮)对菌种生长的影响存在差异，并且向发酵培养基中直接添加醛、酮、酸等有机物，当这些外源电子受体浓度高于10mg/L-100mg/L时,将会对菌体生长造成抑制作用。[0007]植物原料化学组成复杂，其水溶性物质包括多种醛、酮、酸等有机物。例如植物原料中木质素组成单体阿魏酸，黄酮等物质在生物代谢中就表现出抗氧化性，具有得失电子的能力。由此推测向发酵培养基中添加少量植物原料，将有助于调节菌种培养条件，加速发酵途径中NADH代谢速度，从而提高丙酮丁醇梭菌的发酵性能。[0008]本发明提供一种添加植物原料以提高丁醇生产菌发酵性能的方法，即分别在丁醇生产菌发酵起始阶段和产酸阶段向发酵培养基中补加少量植物原料，可以使未经活化的丁醇生产菌直接用于发酵生产，缩短了丁醇生产菌发酵延滞期，同时提高了丁醇生产菌的溶剂转化率。本发明解决了丁醇生产菌普通存在的保存菌种易退化、发酵延滞期长的问题，同时提高了丁醇生产菌的溶剂产量，降低了发酵液中副产物丁酸和乙酸的比例。


[0009]本发明的目的在于提供一种添加植物原料以提高丁醇生产菌发酵性能的方法，即通过在丁醇生产菌发酵起始阶段 向发酵培养基中补加少量植物原料，以缩短丁醇生产菌发酵延滞期；在丁醇生产菌产酸阶段向发酵培养基中补加少量植物原料，以提高丁醇生产菌的溶剂转化率，降低发酵液中副产物丁酸和乙酸的比例。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]本发明提供的一种添加植物原料以提高丁醇生产菌发酵性能的方法，其步骤如下:
[0012]I)植物原料的制备:
[0013]本发明所用的植物原料包括玉米秸杆，荞麦杆，稻杆，小麦杆，花生壳，苹果皮，陈皮，葛根，大豆，银杏叶，竹叶和葡萄籽中之一或任意组合。
[0014]将植物原料用自来水清洗干净，自然晾干。用磨咖啡豆机(TSK-927S，厦门灿坤实业股份有限公司)将植物原料粉碎后置入烧杯中，在115°C下灭菌15min待用。
[0015]2)菌种和培养条件:
[0016]本发明采用的丁醇生产菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),拜氏梭菌(Clostriridium beijerinckii)和糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)中之一。
[0017]丁醇生产菌的保藏在6%的玉米醪培养基中，菌种在4°C下保藏2-3个月。
[0018]丁醇生产菌的发酵培养基每升含葡萄糖60g，乙酸铵4.3g,磷酸二氢钾1.768g,磷酸氢二钾2.938g,对-氨基苯甲酸IOmg,生物素IOmg,无机盐溶液ImL, pH 6.5-7.0。其中 IL 无机盐溶液组成为=NaMoO4.2H20 2.4g ；CoCl2.6Η200.24g ；CaCl2.2H20,1.5g ；FeCl3.6Η20 27g ；H2S0428ml ；CuSO4.5Η20 0.25g ；ZnSO4.7Η20 0.29g ；MnSO4.H2O 1.7g ；MgS0412g。
[0019]发酵培养基在115°C下灭菌15min，冷却至室温，接入5-10%的丁醇生产菌的保藏菌种，在35°C _37°C下静止厌氧培养96h，用气相色谱测定发酵液中的产物含量。
[0020]3)发酵过程中向培养基中补加植物原料:[0021]在丁醇生产菌发酵O-1Oh时，向发酵培养基中补加0.l-10g/L粉碎的植物原料后，继续厌氧培养24-48h时，仍向培养基中补加0.l-10g/L粉碎的植物原料，厌氧培养直至发酵终止。

[0022]下面通过实施例进一步描述本发明。
[0023]实施例1
[0024]将葡萄籽用自来水清洗干净，自然晾干。用磨咖啡豆机将葡萄籽粉碎后置入烧杯中，在115°C下灭菌15min待用。
[0025]丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum ATCC824)保藏在 6% 的玉米醪培养基中，并在4°C保存2个月。分别在发酵培养基(配方见
)中添加0.lg/L，2g/L和10g/L葡萄籽制备成培养基I号，培养基2号和培养基3号。将3种培养基在115°C下灭菌15min,冷却至室温后,接入5%的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)保藏菌种。菌种在37 °C下静止厌氧培养。
[0026]对于培养基I号,当菌种发酵IOh后，向培养基中补加2g/L葡萄籽；当菌种发酵24h后，向培养基中补加8g/L葡萄籽，之后菌种在35°C下静止厌氧培养直到发酵结束。
[0027]对于培养基2号，当菌种发酵48h后，向培养基中补加8g/L葡萄籽,之后菌种在35 0C下静止厌氧培养直 到发酵结束。
[0028]对于培养基3号，当菌种发酵48h后,菌种在35°C下静止厌氧培养直到发酵结束。
[0029]以不添加葡萄籽的发酵培养基作为对照培养基。发酵培养基(配方见
)在115°C下灭菌15min,冷却至室温后，直接接入5%的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)保藏菌种。菌种在35°C下静止厌氧培养。
[0030]采用气相色谱法测定添加葡萄籽的3种培养基和对照培养基中各发酵产物含量(表 I)。
[0031]表I补加葡萄籽对丁醇生产菌发酵性能的促进作用