专利名称：青稞籽粒B-hordein基因核酸序列及其用途的制作方法X复(Jtordeim vulgare L.)是世界上重要的栽培作物和遗传研究的模式植物，广泛分布于世界各地的农业种植区，具有食用、饲用、酿造和保健等多种用途。青稞又称裸大麦0 vulgare ssp. ra^are)，作为重要的粮食和饲料作物，在青藏高原地区扮演着极为重要的角色。其籽粒为裸粒，为加工带来了极大便利。此外，青稞籽粒含有丰富的蛋白质、膳食纤维、维生素E及葡聚糖等，使其具有较高营养价值，已越来越引起人们的关注。青藏高原作为栽培大麦的起源中心之一，是世界唯一集中种植青稞的地区，其复杂多样的地理环境和生态条件孕育了丰富的青稞种质资源。大麦胚乳贮藏蛋白主要是大麦醇溶蛋白(hordeins)，占大麦胚乳蛋白质的50 60%，是影响食品加工、酿造和饲养品质的主要因素之一。根据在SDS-PAGE蛋白电泳上的迁移率大小，大麦醇溶蛋白被划分为三种类型富硫蛋白亚类(B，γ-hordeins)、贫硫蛋白亚类(C-hordeins)以及高分子量蛋白亚类(D-hordeins)。B组(B-hordeins)和C组 (B-hordeins)醇溶蛋白是两类主要的多聚大麦醇溶蛋白，它们分别占大麦胚乳醇溶蛋白成分的70-80%和10-1洲。B-hordein是由IH染色体你rJ 编码，结构与小麦低分子量谷蛋白 (low-molecular-weight glutenin subunit, LMW-GS)较为类似。B-hordein 的数量禾口分布是大麦酿造品质的重要影响因子。亚糊粉层中的高B-hordein含量和低D/B-hordein比与酿造品质的提高密切相关。目前已报道的B-hordein基因主要来自普通栽培大麦、0 ra^are)、野生糙稃大麦(Λ torfcsimi^/ )以及野生智利大麦0 cAihase)，有关青稞中B-hordein基因的报道十分有限。
本发明提供了编码青稞B-hordein蛋白的基因序列及其变体或片段。本发明人根据已知大麦B-hordein同源基因设计引物，利用PCR技术从具有特殊B-hordein亚基组成的青稞中扩增并测序获得3个B-hordein蛋白的编码基因序列。经序列比对，本发明所提供的青稞B-hordein蛋白编码基因序列与已知大麦B-hordein基因序列具有较高序列相似性，其一致性为84% 95%。本发明提供的青稞B-hordein蛋白编码基因seq. 1序列如下 seq. 1 ATGAAGACCTTCCTCATCTTTGCACTCCTCGCCATTGCGGCAACAAGTACGATTGCACAGCAACAACCATTT CCACAACAACCCTTCCCACAACAGCCACAACCATACCCACAACAACCACAACCATATCCACAACAACCATTCCAACC GCAACAACCATTTCCACAACAAACCATCCCACAACAACCACAACCATACCCACAACAACCACAACCATATCCACAACAACCCTTCCCACCGCAACAAGAATTTCCACAACAACCGCCATTTTGGCCACAACAACCATTTCCACAACAACCACCA TTTGGGCTACAACAACCAATTCTATGGCAGCAACAACCATGTACACCACAACAAACACCACTCCCACAAGGACAACT GTATCAAACGCTTCTGCAACTACAAATACCCTATGTTCATCCTTCTATTTTGCAACAACTAAACCCATGCAAGGTAT TCCTCCAGCAGCAGTGCAACCCCGTGCGAATGCCACAACTTATTGCTAGGTTGCAAATGTTGCAGCAGAGCAGTTGT CATGTGTTGCAGCGACAATGTTGCCAGCAACTGCCGCAAATCTCCGAACAATTCCGCCATGAGGCAATCCGTGCAAT CGTCTACTCTATCTTTCTGCAAGAACAACCCCAACAGTCGGTCCAAGGTGTATCCCAACCCCAAAAACAGTTGCAGC AGGAGCAAGTTGGACAATGTTCTTTCCAACAACCTCAACCACAACAACTTGGTCAACCACAGCAGGTACCACACAGT GTTTTCTTGCAGCCACACCAGATAGCTCAGCTTGAGGCGACGACTTCCATTGCGCTGCGTACCCTACCAAGGATGTG CAATGTTAATGTGCCATTGTACGACATCATGCCAGTCGACTTTTGGCACTAG 。根据青稞B-hordein蛋白编码基因序列(seq. 1)，得到如下氨基酸序列 MKTFLIFALLAIAATSTIAQQQPFPQQPFPQQPQPYPQQPQPYPQQPFQPQQPFPQQTIPQQPQPYPQQPQPYPQQPFPPQQEFPQQPPFWPQQPFPQQPPFGLQQPILWQQQPCTPQQTPLPQGQLYQTLLQLQIPYVHPSILQQLN PCKVFLQQQCNPVRMPQLIARLQMLQQSSCHVLQRQCCQQLPQISEQFRHEAIRAIVYSIFLQEQPQQSVQGVSQPQ KQLQQEQVGQCSFQQPQPQQLGQPQQVPHSVFLQPHQIAQLEATTSIALRTLPRMCNVNVPLYDIMPVDFWH 。本发明提供的青稞B-hordein蛋白编码基因seq. 2序列如下 seq. 2 ATGAAGACCTTCCTCATCTTTGCACTCCTCGCCATTGCGGCAACAAGCACGATTGCGCAGCAACAACCATTT CCACAACAACCCATCCCACAACAACCACAACCATACCCACAACAACCACAACCATATCCACAACAACCCTTTCCACC GCAACAACCATTTCCACAACAACCCGTCCCACAACAACCACAACCATACCCACAACAACCCTTCCCACCGCAACAAC CATTTCCACAACAACCACCATTTTGGCAACAAAAACCATTTCCACAACAACCACCATTTGGGCTACAACAACCAATT CTATCGCAGCAACAACCATGTACACCACAACAAACACCACTCCCACAAGGACAACTGTACCAAACGCTTCTGCAACT ACAAATACAATATGTTCATCCATCTATTTTGCAACAGCTAAACCCATGCAAGGTATTCCTCCAGCAGCAGTGCAGCC CTGTGCCAGTGCCACAACGTATTGCTAGGTCGCAAATGTTGCAGCAGAGCAGTTGCCATGTGTTGCAGCAACAATGT TGCCAGCAACTACCCCAAATCCCCGAACAACTCCGCCATGAGGCAGTCCGTGCAATCGTCTACTCTATCGTCCTGCA AGAACAATCCCTACAATTGGTCCAAGGTGTCTCCCAACCCCAACAACAGTCACAACAGCAACAAGTCGGACAATGTT CTTTCCAACAACCTCAACCACAACAGGGTCAACAACAGCAAGTGCCACAGAGTGTTCTCTTGCAGCCACACCAAATA GCTCAACTTGAGGCGACAACTTCCATTGCGCTACGTACCCTACCAACGATGTGCAGTGTTAATGTGCCGTTGTACCG CATAGTGCCATTAGCCATTGACACCAGAGTTGGTGTCTAATGATAA 。根据青稞B-hordein蛋白编码基因序列(seq. 2)，得到如下氨基酸序列MKTFLIFALLAIAATSTIAQQQPFPQQPIPQQPQPYPQQPQPYPQQPFPPQQPFPQQPVPQQPQPYPQQPFP PQQPFPQQPPFWQQKPFPQQPPFGLQQPILSQQQPCTPQQTPLPQGQLYQTLLQLQIQYVHPSILQQLNPCKVFLQQ QCSPVPVPQRIARSQMLQQSSCHVLQQQCCQQLPQIPEQLRHEAVRAIVYSIVLQEQSLQLVQGVSQPQQQSQQQQV GQCSFQQPQPQQGQQQQVPQSVLLQPHQIAQLEATTSIALRTLPTMCSVNVPLYRIVPLAIDTRVGV 。本发明提供的青稞B-hordein蛋白编码基因seq. 3序列如下 seq. 3 ATGAAGACCTTCCTCATCTTTGCACTCCTCGCCATTGTGGCAACAAGTACCATTGCACAACAACAACCATAC CCACAACAACCACAACCATTTCCACAACAACCCATCCCACAACAACCACAACCATTTCCACAACAACCACAACCATA CCCACAACAACCACAACCATTTCCACAACAACCCATCCCACAACAACCACAACCATACCCACAACAACCACAACCAT TTCCACAACAACCCATCCCACAACAACCACAACCATACCCACAACAACCACAACCATTTCCCCTACAACCCTTCCCATCACAACAACCATTTCCACAACAACCACCATTTTGGCAACAACAACCAGTTCTATCGCAGCAACAACCATGTACACA AGAACAAACACCACTCCTACAAGAACAACAAGATCAAATGCTTCTGCAAGTACAAATACCATTTGTTCATCCATCTA TTTTGCAGCAGCTAAACCCATGCAAGGTATTCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCTGTGGCAATGTCACAACGTATTGCA AGGTCGCAGATGTTGCAACAGAGCAGTTGCCATGTGTTGCAGCAACAGTGTTGCCAACAACTGCCGCAAATCCCCGA ACAACTCCGCCATGAGGCAGTCCGTGCAATCGTCTACTCTATCGTCCTGCAAGAACAATCCCTACAATTGGTCCAAG GTGTCTCCCAACCCCAACAACAGTCACAACAGCAACAAGTCGGACAATGTTCTTTCCAACAACCTCAACCACAACAG GGTCAACAACAGCAAGTGCCACAGAGTGTTCTCTTGCAGCCACACCAAATAGCTCAACTTGAGGCGACAACTTCCAT TGCGCTGCGTACCCTACCAACGATGTGCAGTGTTAATGTGCCGTTGTACCGCATAGTGCCATTAGCCATTGACACCA GAGTTGGTGTCTAATGATAA 。根据青稞B-hordein蛋白编码基因序列(seq. 3)，得到如下氨基酸序列 MKTFLIFALLAIVATSTIAQQQPYPQQPQPFPQQPIPQQPQPFPQQPQPYPQQPQPFPQQPIPQQPQPYP
QQPQPFPQQPIPQQPQPYPQQPQPFPLQPFPSQQPFPQQPPFWQQQPVLSQQQPCTQEQTPLLQEQQDQMLLQVQI PFVHPSILQQLNPCKVFLQQQCSPVAMSQRIARSQMLQQSSCHVLQQQCCQQLPQIPEQLRHEAVRAIVYSIVLQE QSLQLVQGVSQPQQQSQQQQVGQCSFQQPQPQQGQQQQVPQSVLLQPHQIAQLEATTSIALRTLPTMCSVNVPLYR IVPLAIDTRVGV 。本发明的有益效果为
本发明提供的青稞B-hordein蛋白编码基因编码特殊的B-hordein蛋白亚基，它们与已知基因具有较高的同源性。B-hordein蛋白与青稞的加工品质密切相关，在作物改良方面具有潜在的应用价值。本发明所述的青稞B-hordein蛋白编码基因，可通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域研究人员共知的方法导入普通大麦、青稞、小麦、水稻等作物中， 用于改变其原有的加工特性。本发明的有益效果还表现在
可将本发明所提供的青稞B-hordein蛋白编码基因构建至原核和酵母表达载体中，通过本领域共知的研究方法将其分别导入大肠杆菌和酵母中进行大量表达，然后纯化该基因表达的蛋白并将其添加到面粉中，以改变面粉或面团的加工特性。在本申请的说明书和权利要求书中使用的以下术语具有如下的含义
“变体”是指对一个目的DNA序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、 缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于所述目的DNA序列的活性；
“片段”是指基本DNA序列的一个或多个区域，其仍然具有类似于基本DNA序列的活性。

1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65°C的2XCTAB提取液(2% CTAB； 1. 4M NaCl, 0. 1 MTris-HCl, PH8. 0，0. IM EDTA, PH8. 0) 15 ml，混勻；
2)65°C水浴30-45min,其间轻摇混勻。冷却至室温后加等体积的氯仿异戊醇(24 1)，轻轻混勻至上清液呈牛奶状，4000 rpm离心10 min ；
3)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA;
4)勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH8.0的1 X TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100 μ g/ μ L ；5) 100V恒定电压下，1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。(2)根据 GenBank 中三个 B-hordein 基因序列(GenBank No. X03103, X53690 和 X53691)，利用Primer Premier5软件设计一对引物
HoBl :5，-AACCTCGGGATTTCTATACTTT-3， HoB2 :5， -ACACTTTATTTGTCACCGCTAC-3，。(3) PCR 扩增 反应体系如下DNA dNTPs 引物HoBl 引物HoB2 Taq plus聚合酶 IOXPCR缓冲液 Mg2+ ddH20
PCR反应程序
1)94°C4 分钟
2)94°C40 秒
3)56"C40 秒
4)72°C1 分钟重复(2)—(4) 35个循环
5) 72°C10 分钟
PCR反应在PTC-200型PCR仪(MJ Research, U. S. A.)中进行。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳30分钟。(4) PCR产物回收和纯化
使用北京天根的回收试剂盒，所有操作均按照说明书进行。(5)连接和转化
将回收产物连接到PMD-18T载体的反应体系如下 PMD-18T 载体1 μ L (约 50ng)
IOX连接酶缓冲液2 yL
T4DNA连接酶350 U
回收PCR产物加至终反应体积20 μ L
16°C连接10小时转化大肠杆菌DH5 α 感受态细胞的制备
1)取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于2 μ L LB液体培养基中， 37°C振荡过夜培养(220 rpm)；
2)取500μ L活化过夜的菌液于50 ml LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D600=0. 3 ；
3)将菌液倒入50ml离心管中，冰浴放置10 min ；
4)在预冷至4°C的离心机中，4000rpm离心10 min后去掉上清液，收集菌体；
100-150ng
100 μ M 5 pmol 5 pmol IU 2. 5μ L 1. 5mM 加至终体积25 μ L5)加入20ml冰冷的0. IM CaCl2于离心管中，均勻悬浮菌体后，冰浴中30 min ；
6)4°C下，4000rpm离心10 min后去掉上清液，收集菌体，加入2 ml冰冷的0. IM CaCl2 溶液均勻悬浮菌体后，放入冰中待用；
转化步骤如下
1)将连接产物加入200μ L感受态细胞中，充分混勻置于冰上30 min ；
2)42°C热击2min 30 s，冰浴1 min后加入预热至37°C的LB液体培养基400 yL；
3)37°C低速(100 rpm)振荡培养 40 min ；
4)在每个含有氨苄青霉素(50μ g/ml)的LB固体培养基平板上加200 μ L菌液，0.1 M IPTG 4 μ L禾口 20 mg/ml的X_gal 40 μ L均勻涂于平板上；
5)37°C培养箱中培养16小时； (6)阳性克隆的筛选
1)挑取培养平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37°C培养12小时)；
2)挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增，反应体系如下
DNA dNTPs 引物Pl 引物P2
Taq plus聚合酶 10XPCR缓冲液 Mg2+ ddH20
3)PCR反应程序同前,
少许菌体 100 μ M 5 pmol 5 pmol IU 2. 5μ L 1. 5mM
加至终体积25 μ L 扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳30分钟，
检测有无目的片段。 (7)基因的序列测定由hvitrogen生物公司上海分公司完成。序列分析采用NCBI 网址上的相关软件进行。包括BLAST程序(http://www. ncbi. nlm. nih. gov),DNAman5. 2软件和多重序列比对软件 ClustalW (http://www.ebi. ac.uk/clustal W)。利用 ORF Finder 软件将B-hordein基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院成都生物研究所<120>青稞籽粒B-hordein基因核<130>说明书<160>6<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>894<212>DNA<213>H. vulgare ssp. vuIgare<400>1
7atgaagacct tcctcatctt tgcactcctc gccattgcgg caacaagtac gattgcacag 60 caacaaccat ttccacaaca acccttccca caacagccac aaccataccc acaacaacca 120 caaccatatc cacaacaacc attccaaccg caacaaccat ttccacaaca aaccatccca 180 caacaaccac aaccataccc acaacaacca caaccatatc cacaacaacc cttcccaccg 240 caacaagaat ttccacaaca accgccattt tggccacaac aaccatttcc acaacaacca 300 ccatttgggc tacaacaacc aattctatgg cagcaacaac catgtacacc acaacaaaca 360 ccactcccac aaggacaact gtatcaaacg cttctgcaac tacaaatacc ctatgttcat 420 ccttctattt tgcaacaact aaacccatgc aaggtattcc tccagcagca gtgcaacccc 480 gtgcgaatgc cacaacttat tgctaggttg caaatgttgc agcagagcag ttgtcatgtg 540 ttgcagcgac aatgttgcca gcaactgccg caaatctccg aacaattccg ccatgaggca 600 atccgtgcaa tcgtctactc tatctttctg caagaacaac cccaacagtc ggtccaaggt 660 gtatcccaac cccaaaaaca gttgcagcag gagcaagttg gacaatgttc tttccaacaa 720 cctcaaccac aacaacttgg tcaaccacag caggtaccac acagtgtttt cttgcagcca 780 caccagatag ctcagcttga ggcgacgact tccattgcgc tgcgtaccct accaaggatg 840 tgcaatgtta atgtgccatt gtacgacatc atgccagtcg acttttggca ctag894
〈210〉 2 〈211〉 297 〈212〉 PRT
<213> H. VUIgare ssp. vulgare 〈400〉 2
Met Lys Thr Phe Leu lie Phe Ala Leu Leu Ala lie Ala Ala Thr Ser 151015
Thr lie Ala Gln Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln
202530
Pro Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Pro Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Pro Phe
354045
Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln Thr lie Pro Gln Gln Pro Gln
505560
Pro Tyr Pro Gln Gln Pro Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Pro Phe Pro Pro 65707580
Gln Gln Glu Phe Pro Gln Gln Pro Pro Phe Trp Pro Gln Gln Pro Phe
859095
Pro Gln Gln Pro Pro Phe Gly Leu Gln Gln Pro lie Leu Trp Gln Gln
100105110
Gln Pro Cys Thr Pro Gln Gln Thr Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Tyr
115120125
Gln Thr Leu Leu Gln Leu Gln lie Pro Tyr Val His Pro Ser lie Leu
130135140
Gln Gln Leu Asn Pro Cys Lys Val Phe Leu Gln Gln Gln Cys Asn Pro


本发明属于植物遗传工程领域，具体涉及一种来自青藏高原青稞的新型B-hordein籽粒蛋白编码基因核酸序列及其用途。本发明所述青稞籽粒B-hordein基因核酸序列含有seq.1或seq.2或seq.3基因片段。本发明所述青稞籽粒B-hordein基因核酸序列用于作物品质改良具有广阔的用途。