专利名称：人核糖体蛋白分子hRrp15p及其制备方法与应用的制作方法随着科学技术的快速发展，人们对生命的探索也快速进步，对生命的发生也进行了很多深入的研究，在生命发生过程中离不开各种物质的重要作用。核仁(nucleolus)是真核细胞间期核中最显著的结构，具有重要功能，是核糖体RNA合成、加工和核糖体亚单位的组装场所。核仁素(Nucleolin，又称C2!3)是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、 生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程。2007年，Kiichi Fukui实验室研究证实，核仁素是细胞核仁结构形成的决定蛋白分子。应用小分子RNA干扰技术(RNAi) 抑制核仁素在细胞内的表达，导致间期细胞核仁结构的消失，最终出现细胞分裂周期阻滞， 细胞增殖停滞(Nan Ma, et al. 2007)。但核仁素的核仁定位的决定因素仍不清楚。如能发现细胞内核仁素的核仁定位的决定因素，就可以通过这种因素影响核仁素的核仁定位，从而影响间期细胞核仁结构的形成，进而抑制肿瘤细胞的增殖，为探索临床肿瘤治疗方法寻找新的生物分子靶点。核糖体相关蛋白15(Rrpl5p)最早由Alessandro !^atica实验室于2005年发现于酵母细胞中，该实验室研究证实Rrpl5p分子是核糖体大亚基(60 前体的组成成分，并与核糖体大亚基的成熟相关。我们根据蛋白分子氨基酸序列的同源性，对比人基因组，检索出人核糖体相关蛋白15(hRrpl5p)的基因序列，然后设计PCR引物，从人子宫颈癌细胞HeLa 的cDNA文库中克隆出hRrpl5p的cDNA。经DNA测序后，与人GenBank对比，证实该cDNA序列。随后，我们制备了 hRrpl5p的多克隆抗体并构建该蛋白分子的多种突变体，对hRrpl5p 的细胞内表达，亚细胞定位以及该蛋白分子对核仁素核仁定位的影响作用进行深入研究。
本发明公开了人核糖体蛋白分子hRrpl5p核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO 1所示的核苷酸，全长为849个碱基。本发明所述人核糖体蛋白分子hRrpl5p核苷酸序列，其所对应的氨基酸序列如 SEQID NO 2具有282个氨基酸。本发明进一步公开了人核糖体蛋白分子hRrpl5p在决定核仁素的核仁定位方面的应用，其中hRrpl5p的的核仁定位序列为第2 至232氨基酸RKKPK。本发明进一步公开了人核糖体蛋白分子hRrpl5p在制备作为核仁素的核仁定位抑制肿瘤细胞的增殖药物方面的应用。本发明的研究结果充分证明hRrpl5p决定核仁素的核仁定位，从而解决了核仁素如何定位于核仁结构并促使核仁结构的形成，为细胞内核仁的功能的发挥奠定形态学基石出。本发明更加详细的制备方法如下方法与结果UhRrpl5p基因的克隆、特异性抗体的制备以及在细胞周期的表达在Gene bank中，通过同源蛋白比对，发现人基因组中酵母细胞Rrpl5p基因的同源基因序列(命名为hRrpl5p，Figure 1A, IB)。根据hRrpl5p的基因序列，设计PCR引物如下引物 1 :5，-CCGGAATTCATGGCAGCCGCCGCTCCGGAC-3，；引物 2 :5，-CCGCTCGAGTGTATCAGAGTCACTTGC-3，.以HeLa细胞的cDNA文库为模板，应用上述引物进行PCR扩增反应。将扩增的DNA 片段连接至质粒载体PEGFP，进行测序鉴定，与hRrpl5p基因序列完全相同。hRrpl5p基因序列(含TAA终止密码子849)ATGGCAGCOGCCGCTCOGGACTCAOGTGTGAGTGAGGMGAMACCTGMAMGACCCCMAGMGMGATGMAATGGTMCTGGAGCOGTAGCGTOGGTGCTGGMGACGAGGCCACAGACACTTCTGATAGTGMGGMGCTGTGGATCGGMMGGACCACTTTTATTCTGATGATGAOGCMTAGMGCTGACAGTGAGGGTGATGCTGAGCCCTGTGACMAGMMTGMMTGATGGAGMTCMGTGTTGGGACTMTATGGGCTGGGCAGATGCTATGGCTMAGTCCTCMCMGMMCTCCTGMAGTMACCTACTATTCTGGTCMMATMGMGCTGGMMGGMMAGMMGTTAMGCMGMAGACTAGAGMMTAMACAGOGTGATMGAGGCTGGAGTGGGMATGATGTGCAGAGTMAGCCAGATGTTGTCCMGACMAGAGACAGAGAGMATCTTCAGAGMTTGCMCMGGGGTGTGGTGCMTTATTTMTGCTGTTCAGMACATCMMGMTGTTGATGAMAGGTTMGGMGCTGGMGTTCTATGAGMAGCGTGCTMGTTGATATCMCTGTTTCCMGMAGATTTCATCAGTGTTTTGAGAGGGATGGATGGMGTACMATGAGACTGCTTCMGCAGGMGMACCAMAGCCMACAGACTGMGTGMATCAGMGMGGCCCAGGTTGGACGATCCTACGTGATGATTTCATGATGGGAGCATCTATGMAGACTGGGACMGGMAGTGATGGGCCAGATGACAGCAGACCAGMTCTGCAAGTGACTCTGATACATAAhRrpl5p氨基酸序列082个氨基酸)MAAAAPDSRVSEEENLKKTPKKKMKMVTGAVASVLEDEATDTSDSEGSCGSEKDHFYSDDDAIEADSEG DAEPCDKENEND(ESSV(TNMGWADAMAKVLNKKTPESKPTILVKNKKLEKEKEKLKQERLEKIKQRDKRLEWEM MCRVKPDVVQDKETERNLQRIATRGVVQLFNAVQKHQKNVDEKVKEAGSSMRKRAKLISTVSKKDFISVLRGMDG STNETASSRKKPKAKQTEVKSEEGPGffTILRDDFMMGASMKDWDKESDGPDDSRPESASDSDT应用原核细胞表达载体pHid8a (购自Novagen公司)，构建原核表达His-标记的全长hRrpl5p融合蛋白的载体质粒并将该质粒转化到hcherichia coli. BL-21 (DE)pLysS 菌株(购自Novagen公司)以诱导融合蛋白His-hRrpl5p的表达，随后裂解诱导菌株并用 Ni-NTA (亚硝基三乙酸镍)-琼脂糖柱层析得到纯化的His-hRrpl5融合蛋白。再用纯化的蛋白免疫英格兰大白兔产生兔抗-hRrp 15p抗体血清，最后用Hi s-hRrp 15p融合蛋白Ni-NTA 琼脂糖珠纯化血清中兔抗_hRrpl5p抗体。该抗体将来可以应用于阻断肿瘤细胞内源性 hRrpl5p的正常作用，进而抑制肿瘤细胞的生长(这里预示可以治疗什么病？)。应用纯化后的hRrpl5p抗体对人乳腺癌细胞MCF7的裂解液进行免疫共沉淀实验， 随后对沉淀物进行蛋白电泳(SDSPAGE)及印迹杂交(Western Blot)，证实hRrpl5抗体只识别细胞裂解液中的一个蛋白分子，分子量约40KDa(FigUre 1C)。该蛋白条带可以通过细胞内转染hRrp 15p特异性s i RNA而降低或消失(F i gur e 5,6),证明hRrp 15p抗体的特异性。该特异性兔抗hRrpl5p抗体为后续研究hRrpl5p的定位及功能奠定基础，也为探索以hRrpl5p 为生物靶点治疗临床肿瘤的研究提供了基本实验材料。对HeLa细胞进行G1A同步化，随后收集各时期的细胞并裂解，应用蛋白印迹杂交实验检测hRrpl5p蛋白在细胞周期各时期的表达情况，显示hRrpl5p在细胞周期G1期较高表达，M期较低表达(Figure ID, IE)。2、hRrpl5p蛋白分子的亚细胞定位应用特异性hRrpl5p抗体进行细胞免疫荧光染色，研究hRrpl5p在细胞周期各时期中的亚细胞定位。结果显示，hRrpl5p在细胞分裂间期定位于的细胞内并积聚在一起， 在细胞有丝分裂过程中，该蛋白伴随染色体运动，并随染色体分离至子细胞中。在胞质分裂期，hRrpl5p定位于中间体部位(Figure 2A)。应用核仁素抗体与hRrpl5抗体进行共染色，发现hRrpl5p与核仁素在细胞核内共定位，表明hRrpl5p定位在间期细胞核核仁区域 (Figure 2B)。3、hRrpl5p各功能区的亚细胞定位应用基因工程技术及载体质粒pEGFP(购自Clontech公司)，构建hRrpl5p各功能区的真核细胞表达质粒(Figure 3A)，在HeLa细胞内表达hRrpl5p各功能区的绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白(Fiugre ，通过细胞免疫荧光染色方法以核仁素为对照检测hRrpl5p 各功能区的亚细胞定位。结果显示，hRrpl5p全长(WT)可以定位于核仁区域；hRrpl5p蛋白氨基端150个氨基酸片段(N150)可以定位于细胞核内，但不能聚集在核仁区；hRrpl5p羧基端175个氨基酸片段￠17 可以定位于核仁区；而hRrpl5p蛋白分子中间107至150氨基酸片段(M4!3)基本定位于细胞质中(Figure 3C)。上述结果表明hRrpl5p蛋白分子的核仁定位序列位于蛋白分子羧基端。4、hRrpl5p蛋白分子核仁定位序列的鉴定hRrpl5p蛋白分子羧基端含有一个核定位序列位于氨基酸2 至232 (RKKPK)，根据上述结果，应用基因工程技术及载体质粒PEGFP，构建hRrpl5p的2观_232氨基酸缺失的表达质粒pEGFP-hRrpl5pA (Figure 4A)，并在HeLa细胞内表达其绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白GFP-hRrpl5p Δ (Figure 4B)，经细胞免疫荧光染色，显示该缺失突变体蛋白分子定位于细胞核内，但不能定位于核仁区域(Figure 4C)。该结果表明hRrpl5p的第2 至232 氨基酸(RKKPK)是该蛋白分子的核仁定位序列。该研究方法以及结果可以有助于寻找发现新的具有相似核仁定位序列的其他蛋白，以便进一步研究核仁具体功能。5、抑制hRrpl5p蛋白分子细胞内表达导致核仁素不能在细胞核内聚集形成核仁分析hRrpl5p基因序列，设计以hRrpl5p基因74至93碱基 (AAATGGTAACTGGAGCCGTA)为靶点的特异性小分子干扰RNA(siRNA)。细胞内转染siRNA，三天后收集细胞并裂解，将细胞裂解液进行Western Blot检测分析，与无意义siRNA对照， hRrpl5p特异性siRNA可以有效抑制hRrpl5p蛋白分子的表达(Figure 5A)。对siRNA转染的细胞进行免疫荧光染色检测分析，结果显示，没有hRrpl5p蛋白染色的细胞内，核仁素在细胞核内弥散分布，不能集聚形成核仁。相反，无意义RNA转染的细胞内，hRrpl5p正常表达并与核仁素共定位于核仁区域(Figure 5B)。该实验结果表明核仁素的核仁定位依赖于hRrpl5p蛋白的正常表达。6、外源性表达hRrp 15p可以恢复hRrp 15p siRNA转染后的核仁素的核仁定位为了验证hRrpl5p小分子RNA干扰实验结果的特异性，设计制备针对hRrpl5p基因3’端非编码序列(3’ -UTR)的大肠杆菌核糖核酸酶III酶切的小分子RNA文库(esiRNAlibrary)。 向细胞内共转染esiRNA文库以及质粒pEGFP-hRrpl5p或pEGFP-hRrpl5pA，三天后对细胞裂解液进行Western Blot检测分析，结果显示hRrpl5p的siRNA可以有效抑制内源性 hRrpl5p以及外源性GFP-hRrpl5p或的表达，但hRrpl5p的esiRNA文库转染的细胞中，内源性hRrp 15p的表达明显降低，但外源性表达的GFP-hRrp 15p或GFP-hRrp 15ρ Δ不受影响(Figure 6A)。对转染的细胞进行免疫荧光染色检测，发现在表达外源性GFP_hRrpl5p 的细胞内，核仁素重新聚集在核仁区域。然而，在外源性表达GFP-hRrpl5pA的细胞内， GFP-hRrp 15ρ Δ定位于细胞核内，但却无法定位于核仁区域，同时核仁素也不能在细胞核内聚集形成核仁结构(Figure 6B)。对上述转染实验的细胞进行统计，结果显示，在 hRrp 15 esiRNA单独转染的细胞中，只有37. 7士7. 31 %的细胞存在核仁素的核仁定位； 在 hRrp比esiRNA 与质粒 pEGFP_hRrpl5p 共转染的细胞中，66. 5士6. 19 % 的 GFP_hRrpl5p 表达(GFP+)的细胞中可检测到核仁素的核仁定位，而没有GFP-hRrpl5p表达(GFP-)的细胞，只有44士8. 45%的细胞可检测到核仁素的核仁定位；相反，在hRrpMesiRNA与质粒pEGFP-hRrpl5pA共转染的细胞中，只有47. 5士7. 64%的GFP_hRrpl5p Δ表达的细胞和44. 8士8. 14%的GFP-hRrp 15ρ Δ无表达的细胞中可检测到核仁素的核仁定位(Figure 6C)。该结果表明，外源性蛋白GFP-hRrpl5p可以恢复hRrpl5p RNAi细胞中的核仁素的核仁定位，相反外源性蛋白GFP-hRrpl5pA不能。因此，hRrpl5p蛋白分子的核仁定位决定核仁素的核仁定位。7、抑制肿瘤细胞内hRrpl5p蛋白分子的表达导致子宫颈肿瘤细胞HeLa发生凋亡。在进行hRrpl5p小分子RNA干扰试验中，我们发现转染后的很多细胞发生细胞膜皱缩，细胞形态改变，原本粘附生长的细胞脱离培养皿底部，悬浮在培养液中。为进一步证实hRrpl5p小分子RNA转染对细胞的作用，我们对转染后的细胞进行Armexin V染色检测。 结果显示，没有转染(mock)或转染无意义小分子RNA(nonsence siRNA)的细胞被Annexin V染色的比例分别为5. 0%和4. 6%，然而，转染hRrpl5p小分子RNA的细胞中被Annexin V 染色的比例为38. 7% (Figure 7A，7B)。该结果表明抑制细胞内hRrpl5p蛋白分子的表达可以诱导子宫颈肿瘤细胞HeLa发生凋亡。结论(1)克隆人核糖体相关蛋白15(hRrpl5p)的cDNA并制备特异性多克隆抗体证实 hRrpl5p定位于细胞核仁区；(2)发现hRrpl5p蛋白分子的2观_232氨基酸(RKKPK)是该蛋白分子的核仁定位序列；(3)发现抑制hRrpl5p的表达导致核仁素无法在细胞核内集聚形成核仁。(4)发现抑制hRrpl5p的表达导致子宫颈肿瘤细胞HeLa发生凋亡。图I-A为hRrpl5p蛋白分子理论二级结构模式图(绿色代表α螺旋，黄代表无规则卷曲，红色代表核定位序列)；图I-B为在其他物种中与hRrpl5p同源蛋白比对，显示该蛋白在进化上高度保守；图I-C为兔抗hRrpl5p抗体的特异性检测；图1_D为流式细胞术检测细胞周期同步化后各时段细胞内DNA含量变化，以反映各时段细胞所处细胞生活时期；图I-E为蛋白免疫印迹分析hRrpl5p蛋白在细胞周期各时期蛋白表达变化，PRCl作为周期对照，α-tubulin为蛋白量内参。图2-A为免疫荧光染色技术检测hRrpl5p蛋白分子在MCF7细胞各细胞周期时相中的定位(绿色代表hRrpl5p，红色代表α-tublin，蓝色代表核DNA)；图2-B为免疫荧光染色技术检测hRrpl5p在MCF7细胞间期的核仁定位(绿色代表hRrpl5p，红色代表核仁素 NucIeolin，蓝色代表核DNA)。图3-A为hRrpl5p各功能片段模式图(绿色代表α螺旋，黄色代表无规则卷曲，红色代表核定位序列)；图3-Β为蛋白免疫印迹检测GFP-标记的hRrpl5p各功能片段融合蛋白在MCF7细胞内的表达；图3-C为免疫荧光染色技术检测GFP-标记的hRrpl5p各功能片段融合蛋白在MCF7细胞间期细胞内定位(绿色代表hRrpl5p，红色代表核仁素Nucleolin， 蓝色代表核DNA)；图4-A为hRrpl5p蛋白分子C端核定位序列0观_232氨基酸)缺失突变体模式图；图4-B为蛋白免疫印迹检测GFP-标记的hRrpl5p蛋白分子C端核定位序列缺失突变体在MCF7细胞内的表达；图4-C为免疫荧光染色技术检测GFP-标记的hRrpl5p蛋白分子C 端核定位序列缺失突变体在MCF7细胞间期细胞内定位(绿色代表hRrpl5p，红色代表核仁素NucIeolin，蓝色代表核DNA)；图5-A为蛋白免疫印迹检测对MCF7细胞进行成功hRrpl5p RNAi ；图5-B为免疫荧光染色技术检测hRrpl5p RNAi对MCF7细胞核仁影响(绿色代表hRrpl5p，红色代表核仁素NucIeolin，蓝色代表核DNA)。图6-A为蛋白免疫印迹检测hRrpl5p 3’-UTR esiRNA在MCF7细胞中对内源性 hRrpl5p和外源转入质粒表达的GFP-hRrpl5/hRrpl5的作用；图6-B为免疫荧光染色技术检测MCF7共转染hRrpl5p 3，-UTR esiRNA和GFP_hRrpl5/hRrpl5 Δ表达质粒对细胞核仁影响(绿色代表hRrpl5p，红色代表核仁素Nucleolin，蓝色代表核DNA)；图6-C为统计分析各处理组有核仁的细胞所占百分数。图7-A为Annexin V免疫荧光染色不同小分子RNA转染的细胞。Annexin V染色为绿色，Hoechsst 33342染色为蓝色，PI染色为红色；图7-B为对上述染色的细胞进行统计分析，横坐标为不同处理方法，纵坐标为Armexin V染色的细胞百分比。
体系)为模板 PCR 扩增 hRrpl5p cDNA 全长(50 μ 1
HeLa cDNA 文库 EasvPfu 酶(5U/ μ 1) IOX buffer dNTPs(2mM) Primer 1(10 μ Μ) Primer 2(10 μ Μ) 高压三蒸ddH20:
5 μ 1 1μ 1 5 μ 1 4μ 1 2μ 1 1μ 1 32 μ 1
95°C~5mins. 95°C-30s, 60°C - 30s, 72°C-60s, 72°C-10mins 30cycles
3)用BioFluxPCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物
-将 100 μ 1 PCR 产物加入 200 μ 1 Binding buffer 混勻； -将混合液全部转移到Spin Column里 -6000g，离心lmin，并弃去管内液体
-向 Spin Column 内加入 650 μ 1 Wash buffer 12000g，30_60s 离心；
-重复上步操作一次；
-再次12000g离心lmin，然后将Spin Column转移到无菌的1. 5ml EP管中 -向 Spin Column 内加 42 μ 1 50°C预热的 Elution buffer，并于室温静置 lmin -于 12000g 离心 Imin ；
-1. 5% Agrose IOOV TAE电泳证明EP管内液体溶有目的片段；
4)酶切纯化产物50μ 1体系


本发明公开了人核糖体蛋白分子hRrp15p具有的特异核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO1所示的核苷酸，全长为849个碱基。其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO2具有282个氨基酸。本发明制备了hRrp15p的多克隆抗体并构建该蛋白分子的多种突变体，对hRrp15p的细胞内表达，亚细胞定位以及该蛋白分子对核仁素核仁定位的影响作用进行深入研究。从而解决了核仁素如何定位于核仁结构并促使核仁结构的形成，为细胞内核仁的功能的发挥奠定形态学基础。