专利名称：用编码腺病毒e1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白的制作方法：本发明涉及重组蛋白质生产的领域，尤其涉及使用人体细胞生产蛋白质。本发明还涉及单克隆抗体生产的领域，尤其用人体细胞生产单克隆抗体。本发明还涉及病毒蛋白生产的领域。本发明尤其用于生产疫苗，以助于脊椎动物，尤其哺乳动物特别是人抗病毒病原体的防护作用。本发明揭示了生产重组蛋白的方法和组合物。本发明尤其用于蛋白质的生产，该蛋白质需要翻译后或翻译时期(peritranslational)修饰，如糖基化和适当折叠。人重组蛋白在异源细胞中的表达已充分记录。许多重组蛋白的生产系统是可用的，如细菌，酵母，和真菌及昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞。然而尽管有这些生产系统，但有些生产系统仍不是最佳的，或只适于生产特殊类别的蛋白质。例如，在原核生产系统中不能生产需要翻译后或翻译时期修饰如糖基化，γ-羧基化或γ-羟基化的蛋白质。原核表达系统的另一熟知问题是在一些情况下经常产生错误折叠的产物，甚至产生不溶的包涵体。真核系统是生产特别是真核细胞衍生的蛋白质的一改良系统，但可用的生产系统仍有许多弊端。例如酵母菌株中的高甘露糖化影响酵母正确表达糖蛋白的能力。高甘露糖化通常甚至导致免疫反应，当这样制备的治疗性蛋白质施用于病人时。另外，酵母分泌信号不同于哺乳动物信号，导致哺乳动物蛋白包括人多肽输送至细胞外更有问题，这又导致持续生产和/或分离的问题。哺乳动物细胞广泛用于生产这种蛋白质，因为它们具有进行精确的翻译后修饰的能力。重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达在过去的几年里已取得明显进展，在许多情况下成为常规技术。尤其中国仓鼠卵巢细胞(CHO)已成为生产生物药学蛋白质和有诊断用处的蛋白质的通用及常规生产系统。有许多特征使CHO非常适用作宿主细胞CHO细胞中可达到的生产水平非常高；此细胞系提供了安全的生产系统，其没有感染性或类病毒颗粒；CHO细胞已精确定性，尽管其来源的细胞系的历史是模糊的；CHO细胞用无血清的培养基，可在生物反应器中悬浮生长直至高密度；CHO的dhfr-突变体(DG-44克隆，Urlaub等，1983)已产生，通过导入外源dhfr基因，之后用氨甲碟呤良好控制dhfr基因和转基因的扩增，从而获得简易的选择系统。然而，糖蛋白或包含至少两个(不同)亚单位的蛋白质仍会产生问题。糖基化蛋白质的生物活性可由于寡糖组分的精确性质而深远影响。糖基化的类型对糖蛋白的免疫原性，定向及药物动力学性质也有明显作用。近年来，在确定糖基化的细胞因子领域已取得重大进展，并已克隆了许多糖基转移酶。由此导致研究方向针对于糖基化机制的代谢工程化(Fussenegger等，1999；Lee等，1989；Vonach等，1998；Jenkim等，1998；Zhang等，1998；Muehmore等，1989)。这种策略例如见于以下所述。CHO细胞缺失功能性α-2，6-唾液酸转移酶，导致唾液酸通过α-2，3-键特有地添加于半乳糖中。已知α-2，6-键缺失可增强蛋白质从血流中清除。为解决这个问题，CHO细胞通过适当的糖基转移酶转染，已遗传工程化为模拟人聚糖分布。CHO细胞也不能生产Lewis×寡糖，现已产生表达人N-乙酰-D-葡糖胺转移酶和α-1，3-岩藻糖基转移酶III的CHO细胞系。相反已知啮齿动物细胞包括CHO细胞，产生糖基化CMP-N-乙酰神经氨酸的CMP-N-乙酰神经氨酸水解酶(Jenkine等，1996)，这是一种人体没有的酶。携带这种糖基化的蛋白质当注射时，可产生强免疫应答(Kawashima等，1993)。对编码此水解酶的啮齿动物基因的新近鉴别，很可能促进缺失此活性的CHO细胞的产生，并避免这种啮齿动物修饰。本领域因此教导可通过表达人糖基转移酶，而改变哺乳动物宿主细胞的糖基化趋势。尽管在重组蛋白上CHO衍生的聚糖结构可模拟在其天然人相应蛋白上的结构，但仍发现它们很不相同。另一潜在问题是不是所有的糖基化酶都已克隆并因此适于代谢工程化。治疗性施用不同于其天然人体相应蛋白的蛋白质，可导致激活病人的免疫系统，并产生影响治疗效果的非所需应答。使用非人细胞的其它问题是在翻译期间或之后可产生蛋白质的错误折叠，这可取决于不同陪伴蛋白的存在情况。发生异常折叠，可导致蛋白质生物活性的降低或丧失。另外，非常重要的是同时表达分离的多肽，这些分离的多肽以正确的相对丰度一起形成包含不同亚单位的蛋白质，如单克隆抗体。人体细胞能更好地提供正确表达和加工人体蛋白所必需的所有便利条件。因此，更需要生产人体重组蛋白的方法，其包括一种细胞，其提供一致的人类型加工如翻译后或翻译期间修饰，如糖基化，其优选还适于大规模生产。因此，本发明提供了一种在细胞中生产至少一种蛋白质物质的方法，所述细胞包括真核细胞，其在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，该细胞不从其基因组或整合入其中的序列编码结构性腺病毒蛋白；所述方法包括提供编码重组蛋白质物质的基因给所述细胞，将此细胞在适当的培养基中培养，并从所述细胞和/或培养基中收集至少一种蛋白质物质。蛋白质物质是一种包含通过肽键连接的至少两个氨基酸的物质。此物质还可进一步包含与所述氨基酸部分物理连接的一或多个其它分子或不包含这些分子。这些其它分子的非限制性例子包括碳水化合物和/或脂质分子。由于许多原因，编码腺病毒结构蛋白的核酸不应存在。原因之一是在所生产的蛋白质制备物中存在腺病毒结构蛋白在这种所生产的蛋白的应用中是非常不希望的。从产物中除去这种结构蛋白最好通过避免其在制备中发生而实现。优选地，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一优选的实施方案中，从细胞中收获的蛋白质物质和细胞自身是衍生自相同物种的。例如，如果将蛋白质施用于人，优选细胞和收获自所述细胞的蛋白质物质均来源于人。人体细胞的一优点是商业上大多数引人注意的蛋白质是人源的。收获自所述细胞的蛋白质物质可以是由所述细胞产生的任何蛋白质物质。在一实施方案中，至少一种收获的蛋白质物质是由所述基因编码的。在另一实施方案中，将基因提供给所述细胞，以增强和/或诱导一或多种内源性存在的基因在细胞中表达。例如，提供编码蛋白质的基因给所述细胞，能增强在所述细胞中蛋白质物质的表达。基因是指包含一种处于可表达形式如表达盒的感兴趣核酸的一种核酸。感兴趣的核酸可以从天然启动子或其衍生物或完全异源启动子表达，感兴趣核酸可包含或不包含内含子。相似地，其可以是cDNA或cNDA样核酸。感兴趣核酸可编码蛋白质。或者，感兴趣核酸可编码反义RNA。本发明还提供了一种在细胞中生产至少一种人重组蛋白的方法，包括将编码所述人重组蛋白的核酸提供给一种人体细胞，该细胞在其基因组中具有编码至少一种无限增殖化腺病毒E1蛋白质或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，此细胞不产生结构性腺病毒蛋白；将所述细胞在适当培养基中培养，并从所述细胞和/或培养基中收获至少一种人重组蛋白。直至本发明，几乎没有发现有任何人体细胞适于以任何可再生及大规模方式生产人重组蛋白。我们现已发现在其基因组中至少包含无限增殖化腺病毒E1序列的细胞，能相对非依赖于外源生长因子而生长(它们通过E1而无限增殖化)。另外，这些细胞能大量生产重组蛋白，并能正确加工生产的重组蛋白。当然这些细胞也能生产非人体蛋白。已用于大量生产重组蛋白的人体细胞系通常是肿瘤(转化)细胞系。大多数用于生产重组蛋白的人体细胞是肿瘤衍生的这一事实，增加了使用这些特殊细胞系的危险性，并导致分离重组蛋白的步骤要非常严格，以避免在任何蛋白质或其制备物中有转化活性或致瘤性物质。根据本发明优选使用的方法，所述细胞衍生自原代细胞。为能使其无限生长，原代细胞需以一些方式无限增殖化，在本发明中已通过导入腺病毒E1而达到。本领域还不清楚转化和无限增殖化的界线。本文中其不同之处是指无限增殖化的细胞无限地生长，而其表型仍存在；转化的细胞也无限生长，但其表型也明显改变。为通过细胞培养而达到大规模(持续性)生产重组蛋白，本领域优选使细胞能不需贴壁地生长。本发明的细胞具有此能力。当细胞在其基因组中包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或其片段的序列时，细胞的非依赖于贴壁的生长能力得以改善，其中优选所述E2A编码序列编码一种温度敏感性的突变E2A，如ts125。为获得从中可易于分离所需重组蛋白的纯净及安全的生产系统，优选使用本发明的方法，其中所述人体细胞不包含其它腺病毒序列。本发明使用的最优选的细胞是以ECACC保藏号96022940保藏的PER.C6，或其衍生物。PER.C6比例如转化的人293细胞在运用中表现更佳，其也已经通过腺病毒的E1区而无限增殖化。对PER.C6细胞已经定性并已非常深入地研究，它们在大规模加工，悬浮生长和不依赖于生长因子方面表现更好。特别是PER.C6可在悬浮液中以高度可再生方式生长，这使其非常适于大规模生产。另外，已证明PER.C6细胞系可在生物反应器中生长至非常高的密度。本发明的细胞，尤其PER.C6具有另外的优点，其可在无动物或人衍生的血清或动物或人衍生的血清组分的培养基中培养。因此分离更加容易，而安全性由于培养基中没有额外的人或动物蛋白而提高，且此系统是非常可靠的(合成培养基是再生性最好的)。另外，腺病毒早期区域1A(E1A)的存在与缺失此特殊基因的(人)细胞系相比，又有另外的优点作为转录激活剂的E1A已知增强从巨细胞病毒介导的早期基因的增强子/启动子中转录(Olive等，1990；Gorman等，1989)。当产生的蛋白质在CMV增强子/启动子控制下时，所述细胞中表达水平提高，而缺失EIA的细胞中表达水平不提高。本发明因此还提供了一种在原核细胞中增加重组蛋白质物质产量的方法，包括提供编码所述蛋白质物质至少一部分的核酸给原核细胞，所述编码序列在CMV启动子，E1A启动子或其功能性同源物，衍生物和/或片段的控制下，并且进一步提供给所述细胞以E1A活性或类E1A活性。与CMV启动子相似，E1A启动子在表达一或多种E1A产物的细胞中，比在不表达这种产物的细胞中更有活性。已知实际上E1A表达增强作用是一些其它启动子的特性。就本发明而言，这种启动子是E1A启动子的功能同源物。E1A的作用可通过转录激活物引诱E1A启动子或其同源物，和/或通过除去/避免转录阻抑物附着启动子而介导。激活物与阻抑物与启动子的结合，以序列依赖方式发生。E1A启动子或其同源物的功能衍生物或片段至少包含一种E1A蛋白调节的激活物和/或阻抑物的核酸结合序列。
本发明的细胞的另一个优点是其具有并持续表达腺病毒E1B基因。腺病毒E1B是熟知的细胞程序死亡的抑制剂。此抑制是通过其55K E1B产物与转录因子p53结合，或随后抑制而发生的(Yew和Berk，1992)。E1B区域的其它产物，19K E1B，可通过结合并从而抑制细胞死亡蛋白Bax和Bak而防止细胞程序死亡，这两种蛋白均在p53的控制下(White等，1992；Debbas和White，1993；Han等，1996；Farrow等1995)。这些特点特别可用于表达这样的重组蛋白，即当此重组蛋白过表达时，可通过依赖p53途径诱导细胞程序死亡。
本发明还提供了人体细胞在生产人重组蛋白中的应用，所述细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种无限增殖化E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了这种应用，其中所述人体细胞衍生自原代细胞，优选所述细胞是PER.C6细胞或其衍生物。本发明还提供了一种应用，其中所述细胞在其基因组中还包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，优选其中所述E2A是温度敏感性的。
本发明还提供了可根据本发明方法或本发明的应用获得的人重组蛋白，所述人重组蛋白具有不同于分离的天然人相应蛋白的人糖基化模式。
在另一实施方案中，本发明提供了一种人体细胞，其基因组中具有编码腺病毒的E1或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白，并还具有编码人重组蛋白的基因，优选此人体细胞衍生自ECACC保藏号96022940的PER.C6。在另一实施方案中，本发明提供了这样一种人体细胞，PER.C6/E2A，其基因组中还包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，优选所述E2A是温度敏感性的。
在这些细胞中表达的蛋白质和使用本发明的方法，是本领域技术人员熟知的。这些蛋白优选是人体蛋白，优选经过一些天然加工，如分泌，陪伴折叠和/或转运，与其它亚单位共合成，糖基化，磷酸化。典型的治疗性或诊断性用途例如包括由一些亚单位组成的单克隆抗体，组织特异性纤溶酶原激活物(tpA)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和人促红细胞生成素(EPO)。EPO是一种典型的产物，尤其在体内，其活性和免疫原性主要依赖于其糖基化模式。因此，相对高水平的EPO可通过使用CHO细胞而达到，当与纯化自人尿液的EPO相对比时，其糖基化不同，但增加红细胞产生的活性相同。然而这种EPO的不同糖基化在受体中产生免疫原性问题，和半衰期改变的问题。
本发明为此还揭示了一种新的无限增殖化的人细胞系，及其进行生产的应用。PER.C6细胞(WO 97/00326)是通过用含有腺病毒血清型5(Ad5)E1A编码序列和E1B编码序列(Ad5的459-3510位核苷酸)的质粒，在人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下，转染原代人胚胎视网膜细胞而产生的。
以下特点使PER.C6特别适用作生产重组蛋白的宿主1.充分定性的人体细胞系；2，按照GLP产生；3.可作为悬浮培养物在没有任何人或动物衍生的蛋白质的限定的无血清培养基中生长；4.适合在滚瓶，摇瓶，旋动瓶和生物反应器中生长，倍增时间大约35小时；5.存在E1A使在CMV增强子/启动子的控制下的基因表达被正调节；6.存在E1B，防止依赖于p53的细胞程序死亡可能通过重组转基因的过表达而增强。
在一实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述细胞与常规哺乳动物细胞系相比，能产生2-200倍的更多重组蛋白和/或蛋白质物质。优选地，所述常规哺乳动物细胞选自CHO，COS，Vero，Hela，BHK和Sp-2细胞系。
在本发明的一方面，蛋白质物质或蛋白质是单克隆抗体。抗体或免疫球蛋白(Igs)是在体液免疫应答，结合抗原并灭活抗原，或触发炎症应答以消除抗原中起主要作用的血清蛋白。抗体能高度特异性地与多种配体相互作用，包括肿瘤相关标记，病毒外壳蛋白，和淋巴细胞表面的糖蛋白。因此，它们是诊断和治疗人体疾病的潜在的非常有用的制剂。重组单克隆和单链抗体技术展示了开发新的治疗和诊断制剂的新前景。小鼠单克隆抗体在许多临床试验中已用作治疗剂，以治疗感染性疾病和癌症。用小鼠单克隆抗体治疗病人的第一篇报道发表于1980年(Nadler等，1980)。然而，使用这些制剂所观测到的效果通常非常令人失望(参见Lowder等，1986；Mellstedt等，1991；Baldwin和Byers，1986)。传统地，重组单克隆抗体(免疫球蛋白)是在B细胞杂交瘤中生产的。这种杂交瘤是通过将初始通过其特异性选择的产生免疫球蛋白的B细胞，与小鼠骨髓瘤融合并从而无限增殖B细胞而产生的。无限增殖小鼠B细胞的原始方案产生于1975年(Kohier和Milstein)。然而，在这种杂交瘤中产生的免疫球蛋白有缺陷，即其来源于小鼠，导致低抗体特异性，低抗体亲和性和严重的宿主抗小鼠抗体应答(HAMA，Shawler等，1985)。此HAMA应答可导致病人出现炎症，发热甚至死亡。小鼠抗体在人体内亲和性较低且与人抗体相比，原因不明地在人体循环中半衰期非常短，人抗体半衰期为21天(Frodin等，1990)，小鼠抗体半衰期为19-42小时。结合HAMA应答的严重性，促使开发另外的产生更多人或完全人化的免疫球蛋白的方案(参见Owens和Young1994，Sandu1992，Vaswani等，1998)。一个这种方案是用人免疫球蛋白的恒定区置换小鼠的相应部分，产生新的“嵌合”和“人化”抗体。由于HAMA应答主要由于恒定区所致，因此采取该方案(Oi等，1983；Morrison等，1984)。这种嵌合抗体例如是CAMPATH-1H(Reichmann等，1988)。用于治疗非Hodgkin’sB细胞淋巴瘤的CAMPATH-1HAb，抗存在于所有淋巴细胞和单核细胞中，但不在其它类型细胞中的人抗原CAMPATH-1[CDw52]，(Hale等，1988；Isaacs等，1992)。其它例如是抗人CD20的Rituxan[Rituximab](Reff等，1994)，和用于血液凝血显影中的抗人片段D二聚体产生的嵌合抗体，15C5(Vandamme等，1990；Bulens等，1991)。然而，由于这些新产生的嵌合抗体仍有部分是小鼠的，其在体内可诱导免疫应答，尽管此应答没有抗全部源自小鼠的HAMA应答严重。
在另一更复杂的方法中，抗体可变区中存在的但明显不是识别抗原所必需的残基，用更类人的氨基酸序列置换，产生第二代或高嵌合的抗体(Vaswani等，1998)。此方法熟知的例子是Herceptin(Carter等，1992)，其是一种95％是人的抗HER2(一种肿瘤特异性抗原)的抗体，并用于乳腺肿瘤的病人。
一种更优选的代替小鼠重组免疫球蛋白的方式是导致人免疫球蛋白产生的方式。重要地，由于用试验性生物制品免疫接种人体是不合乎规定的，因此不能继之选择特异的B细胞进行如小鼠B细胞所示的无限增殖化(Kohler和Milstein 1975)。尽管用病人的B细胞选择抗癌抗原的特异抗体，但与小鼠抗体相比技术上更难于从人体物质中制备人免疫球蛋白(Kohler和Milstein，1975)。通过使用表达人源可变区的噬菌体展示的抗体文库，一种生产全部人抗体的重组方法成为可能(McCafferty等，1990；Clarkson等，1991；Barbas等，1991；Garrard等，1991；Winter等，1994；Burton和Barbas，1994)。这些可变区是通过它们对一些抗原的特异亲和性选择的，随后与人免疫球蛋白的恒定区连接，产生人重组免疫球蛋白。这一方法例如是单链的Fv抗体17-1A(Riethmuller等，1994)，其被转变成称为UBS-54的完整人IgG1κ免疫球蛋白，抗肿瘤相关的EpCAM分子(Huls等，1999)。
产生重组免疫球蛋白的生产系统是多种多样的。首先用于临床试验的小鼠免疫球蛋白是在其亲代特异性B细胞中大量产生的，并融合于小鼠骨髓瘤细胞以无限增殖化。此系统的缺点是产生的免疫球蛋白全部源自小鼠，且在病人体内产生明显的免疫应答(HAMA应答，如上述)。部分人化的或人抗体缺少可无限增殖的亲代B细胞，并因此不得不在其它系统如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞中生产。也可使用一般适于免疫球蛋白生产的细胞，如肿瘤衍生的人或小鼠骨髓瘤细胞。然而，当与最初鉴别的无限增殖的B细胞中获得的抗体产量相比时，在骨髓瘤细胞中获得的抗体产量通常相对较低(±0.1μg/ml)，前者产生充足的小鼠免疫球蛋白(±10μg/ml，Sandu 1992)。
为解决这些及其它问题，正在开发不同的系统以生产较高产量的人化或人免疫球蛋白。
例如，近来研究表明可产生转基因小鼠品系，其中小鼠IgG基因用人的相应部分置换(Bruggeman等，1991；Lonberg等，1994；Lonberg和Huszan，1995；Jacobovits，1995)。将含有人重链和轻(k)链免疫球蛋白(Ig)基因座的大片段的酵母人工染色体(YACs)，导入Ig失活的小鼠中，产生人抗体产物，其与在人体中所见的抗体在包括基因重排，装配和所有组成成分方面十分相似(Mendez等，1997；Green等，1994)。类似地，Fishwild等(1996)已经构建人Ig转基因，以随后用常规的杂交瘤方法获得人免疫球蛋白。此杂交瘤细胞分泌的人免疫球蛋白的性质类似于在野生型小鼠中产生的性质，包括稳定性，生长和分泌水平。产生自这种转基因小鼠品系的重组抗体不携带非人氨基酸序列。
然而，这样产生的人免疫球蛋白的缺点是其是在非人细胞中产生的，导致非人翻译后修饰如糖基化和/或亚单位的折叠。所有抗体均在其恒定区的保守部位糖基化且碳水化合物的存在对抗原清除功能如补体激活是关键性的。附着的碳水化合物的结构也可影响抗体活性。抗体糖基化可受产生其的细胞，抗体的构象和细胞培养条件影响。例如，在小鼠细胞中产生的抗体携带含有Gal-α1-3Gal残基的聚糖，其在人体细胞中产生的蛋白质中不存在(Borrebaeck等，1993；Borrebaeck，1999)。人体中存在非常高效价的抗Gal-α1-3Gal抗体(100μg/ml，Galili，1993)，导致在其聚糖中携带此残基的(小鼠)蛋白质迅速清除。
很快显而易见的是为发挥作用，病人需长期用非常高剂量的重组免疫球蛋白治疗。对不是在人体细胞中产生的人或人化的免疫球蛋白的翻译后修饰，明显影响这些抗体从血流中清除的速率。
现还不清楚为什么在CHO细胞中产生的免疫球蛋白也需要以非常高的剂量应用，因为Gal-α1-3Gal残基在衍生自此细胞系的蛋白质上的聚糖中并不存在(Rother和Sauinto，1996)。因此，除Gal-α1-3Gal残基之外的其它翻译后修饰，可能参与人体抗在这种CHO细胞中产生的完全人或人化的免疫球蛋白的特异免疫应答。
本领域因此教导可产生不具有小鼠衍生的蛋白质序列的人化抗体。然而，目前产生的重组免疫球蛋白仍不同于其天然人相应物，如翻译后修饰如糖基化和折叠。这可导致病人免疫系统激活，并导致可影响治疗效果的非所需应答。因此，尽管研制出嵌合抗体，但目前的生产系统仍需最佳化，以产生完全人或人化的活性抗体。
因此明显需要一种生产完全人抗体并以高于在人骨髓瘤细胞中观测的产量生产的方法。
因此提供一种人体细胞，其产生类似翻译后和翻译期间加工例如但非限于糖基化的人类型蛋白质，这对本领域来讲是一大进展。另外，提供一种生产重组哺乳动物细胞，及从此重组哺乳动物细胞中大规模生产免疫球蛋白的方法，也是有益的。
本发明因而进一步提供了一种在重组哺乳动物细胞中生产免疫球蛋白的至少一个可变区的方法，包括提供一种哺乳动物细胞，该细胞在其基因组中包含编码腺病毒的至少一种无限增殖的E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物和/或其片段的核酸，并进一步另外还包含编码所述免疫球蛋白的第二种核酸，将所述细胞在适当培养基中培养，并从所述细胞和/或培养基中收获至少一种单克隆抗体。
在此之前，几乎没有发现以可再生及可大规模生产方式适于生产免疫球蛋白的人体细胞。本发明的细胞包含至少一种无限增殖化腺病毒E1蛋白，并能相对不依赖于外源生长因子而生长。
另外，这些细胞能大量生产免疫球蛋白，并能正确加工产生的免疫球蛋白。已用于生产免疫球蛋白的细胞是肿瘤衍生的这一事实，增加了使用这些特殊细胞系的额外危险性，并使分离免疫球蛋白的步骤非常严格，以避免在任何制备物中有转化活性或致瘤性物质。因此优选使用本发明的方法，其中所述细胞衍生自原代细胞。为能无限地生长，原代细胞需要无限增殖化，这在本发明中已通过导入腺病毒E1蛋白而达到。为通过细胞培养而大规模(持续)生产免疫球蛋白，优选细胞能不需贴壁而生长。本发明的细胞具有此能力。当细胞在其基因组中包含编码E2A(或其功能性衍生物或类似物或片段)的腺病毒衍生的序列时，非依赖贴壁的细胞生长能力得以改善。在一优选的实施方案中，E2A编码序列编码温度敏感性的突变体E2A，如ts125。另外，所述细胞还可包含一种核酸(如编码tTa的核酸)，当其置于启动子的控制下(如Teto启动子)时，可调节相应基因的表达。核酸可编码免疫球蛋白的重链，轻链和/或可变轻链。或者，一种分离的或独立的核酸可编码Ig(或其功能性衍生物，同源物和/或其片段)的一或多个可变区，作为第一种核酸(如上述)的相应物。本文所述的一或多种核酸可编码ScFv并可以是人或人化的。本发明的核酸优选置于可诱导的启动子(或其功能性衍生物)的控制下。
为获得从中易于分离所需免疫球蛋白的洁净且安全的生产系统，优选使用本发明方法，其中所述人体细胞不包括其它腺病毒序列。本发明的方法最优选的细胞是ECACC保藏号96022940的PER.C6或其衍生物。已发现PER.C6与例如通过腺病毒E1区而无限增殖化的转化的人293细胞相比更稳定，尤其更易使用。PER.C6细胞已精确定性并证实，表明具有良好的大规模生产，在悬浮液中生长及非依赖于生长因子等特点。另外，PER.C6可以高度可再生方式掺入悬浮液中，使其更适于大规模生产。为此，已确定PER.C6细胞系在生物反应器中可生长至非常高的密度。
本发明的细胞，尤其PER.C6，具有可在无动物或人血清，或动物或人血清组分的培养基中培养的优点。因此，分离单克隆抗体很简单，且由于培养基中没有另外的人或动物蛋白从而安全性增加。没有血清存在还提高系统的可靠性，因为使用本发明的合成培养基增强了再生性。本发明还提供了重组哺乳动物细胞在生产免疫球蛋白的至少一个可变区中的应用，所述细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了这样一种应用，其中所述细胞衍生自原代细胞，优选其中所述人体细胞是PER.C6细胞或其衍生物。
本发明还提供了一种应用，其中所述细胞在其基因组中还包含编码E2A(或其功能性衍生物，同源物或片段)的序列，优选E2A是温度敏感性的。另外，本发明提供了一种使用本发明的方法，其中所述细胞还包含反式激活蛋白以诱导所述可诱导的启动子。本发明还提供了根据本发明所得的免疫球蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了一种人体细胞，该细胞在其基因组中具有编码腺病毒E1蛋白(或其功能性衍生物，同源物或片段)的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白，并具有编码人重组蛋白的基因，优选人体细胞衍生自保藏在ECACC中保藏号No.96022940的PER.C6。
在又一实施方案中，本发明提供了这样一种人体细胞，PER.C6/E2A，其在基因组中还包含编码E2A(或其功能性衍生物或类似物或片段)的序列，优选其中所述E2A是温度敏感性的。欲在本发明的细胞中表达的免疫球蛋白是本领域技术人员所知的。重组免疫球蛋白例如包括但非限于Herceptin，Rituxan(Rituximab)，CAMPATH-1H和15C5。
本发明还提供了在重组哺乳动物细胞中生产至少一个免疫球蛋白可变区的方法，其利用本发明的无限增殖的重组哺乳动物细胞，在适当培养基中培养，并从重组哺乳动物细胞和/或培养基中收获所选择的Ig的至少一个可变区。免疫球蛋白，免疫球蛋白的可变区，或其衍生物，可用于治疗哺乳动物或生产药物组合物。
本发明另一方面提供了生产非腺病毒或腺病毒蛋白的用作疫苗的病毒蛋白的方法，包括提供一种细胞，其具有编码腺病毒的E1基因或其功能性衍生物的至少一个基因产物的至少一个序列，提供给所述细胞以编码所述病毒蛋白的核酸，将所述细胞在适当培养基中培养，使所述病毒蛋白表达，并从所述培养基和/或所述细胞中收集病毒蛋白。直至本发明，很少发现(人体)细胞适于以任何可再生及可大规模生产方式和/或足够高的产量和/或易纯化方式，生产用作疫苗的病毒蛋白。我们现在发现优选在其基因组中包含腺病毒E1序列的细胞能大量生产病毒蛋白。
本发明优选的细胞衍生自人体原代细胞，优选细胞通过所述E1基因的产物而无限增殖。为了能生长，原代细胞当然需要无限增殖化。这种细胞例如是衍生自人胚胎成视网膜细胞的细胞。
本发明的细胞中重要的是在细胞周期期间，E1基因序列不丧失。因此优选编码E1基因的至少一个基因产物的所述序列存在于所述(人体)细胞的基因组中。考虑到安全原因，在本发明的细胞中最好避免有非所需的腺病毒序列。因此本发明的另一实施方案提供了不产生腺病毒结构蛋白的细胞。然而，为通过细胞培养大规模(持续)生产病毒蛋白，优选使细胞能不需贴壁而生长。本发明的细胞具有此能力。为获得从中易于回收及如果需要纯化病毒蛋白的洁净及安全的生产系统，优选使用本发明的方法，其中所述人体细胞不包含其它腺病毒序列。本发明使用的优选的细胞是在ECACC中保藏号No.96022940的PER.C6，或其衍生物。
因此，本发明提供了一种使用本发明细胞的方法，其中所述细胞还包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，优选细胞中所述编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，存在于所述人体细胞的基因组中，更优选的是细胞中所述E2A编码序列编码温度敏感性突变体E2A。另外，本发明还提供了一种方法，其中所述(人体)细胞能在悬浮液中生长。
本发明还提供了一种方法，其中所述人体细胞能在无血清的培养基中培养。本发明的细胞，尤其PER.C6所具有的另一优点是，其可在无血清或血清组分的培养基中培养。因此，分离是容易的，安全性增加且此系统的可靠性良好(合成培养基是再现性最好的)。本发明的人体细胞，尤其那些基于原代细胞和HER细胞的细胞，能正常翻译后及翻译期间修饰及装配。这意味着它们非常适用于制备用于疫苗中的病毒蛋白。
因此本发明提供了一种方法，其中所述病毒蛋白包含一种经过翻译后和/或翻译期间修饰的蛋白质，尤其其中所述修饰包含糖基化。此疫苗可用于接种人体，然而此疫苗在动物体内也有效。在此实施方案中，疫苗优选是根据本发明生产的，其中衍生所述细胞的物种与衍生疫苗中病毒蛋白的物种相同。病毒蛋白可以是完整病毒蛋白或其功能性等价物。病毒蛋白的功能等价物是病毒蛋白的至少一个免疫原部分。迄今无法以任何可靠方式生产的病毒疫苗例如是流感疫苗。本发明提供了一种方法，其中所述病毒蛋白包含至少流感病毒神经氨酸酶和/或血凝素之一。可根据本发明的方法生产的其它病毒蛋白(亚单位)包括来自如下病毒的蛋白，如肠道病毒如鼻病毒，口蹄疫病毒，或脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒，如单纯疱疹病毒，假狂犬病病毒或牛疱疹病毒，正粘病毒如流感病毒，副粘病毒如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒，逆转录病毒，如人免疫缺陷病毒或细小病毒或乳多空病毒，轮状病毒或冠状病毒，如传染性胃肠炎病毒或黄病毒，如壁虱脑炎病毒或黄热病病毒，披膜病毒，如风疹病毒或东方、西方或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，肝炎病毒，如甲型或乙型肝炎病毒，瘟病毒属，如猪瘟病毒，或弹状病毒，如狂犬病毒。本发明还提供了一种人体细胞在生产用于疫苗的至少一种病毒蛋白中的应用，该细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一个E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒。当然，对于这种应用，本发明方法中优选使用的细胞也是优选的。本发明还提供了得自本发明方法的产物，尤其根据本发明获得的病毒蛋白，特别是与适当的赋形剂和一些形式(亚单位)的佐剂组成药物组合物。如果从已注册的疫苗中不能得出，施用的剂量和途径通过正常临床测试而加以区分。
因此，本发明还提供了一种用于疫苗中的病毒蛋白，所述病毒蛋白没有任何非人哺乳动物蛋白质物质，本发明还提供了包含这种病毒蛋白的药物配方。
在一优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明方法或应用获得的流感疫苗。
本发明另一方面提供了具有抗细胞程序死亡活性的腺病毒E1B蛋白或其功能性衍生物，同源物和/或片段在真核细胞中增加蛋白质物质产生中的应用，所述应用包括提供所述E1B蛋白，其衍生物，同源物和/或片段给所述真核细胞。在一优选的实施方案中，所述应用包括本发明的细胞。在另一优选的实施方案中，本发明还提供了所述应用在本发明方法和/或应用中的应用。
实施例为举例说明本发明而提供了以下实施例，无限制本发明之意。人红细胞生成素(EPO)分子含有4个碳水化合物链，其中3个含有与天冬酰胺的N键，一个含有与丝氨酸残基的O键。糖基化在EPO的生物活性中的重要性已充分证实(Delorme等，1992；Yamaguchi等，1991)。将编码人EPO的cDNA克隆入PER.C6细胞和PER.C6/E2A细胞中并在其中表达，显示表达，并分析糖基化模式。
实施例1构建基本表达载体将质粒pcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)用NruI和EcoRV消化，在5’末端通过虾碱性磷酸酶(SAP，GIBCOLifeTech.)去磷酸化，并从凝胶中纯化出缺失巨细胞病毒CMV的立即早期增强子和启动子的质粒片段。将含有全长CMV增强子/启动子(-735～+95)及产生重组腺病毒的重叠腺病毒衍生序列的质粒pAdApt，用AvrII消化，用Klenow聚合酶补平，并用HpaI消化；从琼脂糖凝胶中纯化含有CMV增强子和启动子的片段。将此CMV增强子和启动子片段平端对平端地连接于pcDNA3.1/Hygro(-)的NruI/EcoRV片段。所得质粒称为pcDNA2000/Hyg(-)。
将质粒pcDNA2000/Hyg(-)用PmlI消化，并从凝胶中纯化出缺失潮霉素抗性标记基因的线性化质粒，并再连接。所得质粒称为pcDNA2000。将质粒pcDNA2000用PmlI消化并通过SAP在两端去磷酸化。将含有野生型人DHFR cDNA的质粒pIG-GC9(Havenga等，1998)，通过聚合酶链反应(PCR)在cDNA上游和下游导入非编码的PmlI位点，而获得野生型DHFR基因。所用PCR引物是DHFR上游5’GAT CCA CGT GAG ATC TCC ACC ATG GTT GGTTCG CTA AAC TG-3′，和DHFR下游5’GAT CCA CGT GAG ATCTTT AAT CAT TCT TCT CAT ATAC-3′。将PCR产物用PmlI消化并连接于pcDNA2000(用PmlI消化并用SAP去磷酸化)中，以获得pcDNA2000/DHFRwt(图1)。野生型序列和正确使用的克隆位点通过双链测序证实。另外，人DHFR基因的突变体(DHFRm)，通过选择在具有高转录活性的基因组区域可能整合的转基因，用于在PER.C6和PER.C6/E2A细胞中达到10,000倍高的氨甲喋呤抗性。此突变体含有通过PCR导入的32位(苯丙氨酸取代为丝氨酸)和159位(亮氨酸取代为丙氨酸)氨基酸取代。对质粒pIG-GC12(Havenga等，1998)进行PCR用于获得人DHFR的突变体。此突变体的克隆与野生型DHFR克隆相似。用突变体DHFR所获质粒称为pcDNA2000/DHFRm。
将pIPspAdapt 6(Galapgos)用限制酶AgeI和BamHI消化。所得多接头片段具有以下序列5’-ACC GGTGAA TTC GGC GCGCCG TCG ACG ATA TCG ATC GGA CCG ACG CGT TCG CGA GCGGCC GCA ATT CGC TAG CGT TAA CGG ATC C-3′。划线处为所用的AgeI和BamHI识别位点。此片段含有一些单一限制酶识别位点，经琼脂糖凝胶纯化及连接于AgeI/BamHI消化的并经琼脂糖凝胶纯化的质粒pcDNA2000/DHFRwt质粒。所得载体称为pcDNA2001/DHFRwt(图2)。
pIPspAdapt 7(Galapgos)用AgeI和BamHI限制酶消化，并具有以下序列5’-ACC GGTGAA TTG CGG CCG CTC GCG AACGCG TCG GTC CGT ATC GAT ATC GTC GAC GGC GCG CCG AATTCG CTA GCG TTA ACG GAT CC-3′。下划线处是所用的AgeI和BamHI识别位点。此多接头片段含有一些单一限制酶识别位点(不同于pIPspAdapt 6)，其纯化自琼脂糖凝胶，并连接于AgeI/BamHI消化的及经琼脂糖凝胶纯化的pcDNA2000/DHFRwt。获得pcDNA2002/DHFRwt(图3)。
将pcDNA2000/DHFRwt用限制酶PvuII部分消化。在此质粒中有两个PvuII位点，在SV40 poly(A)和CoLEl之间的位点而非在BGH poly(A)下游的PvuII位点进行克隆。将质粒的单位点消化的混合物用SAP去磷酸化，并用Klenow酶平端化及自琼脂糖凝胶中纯化。将pcDNA2001/DHFRwt用MunI和PvuII限制酶消化，及用Klenow酶和游离核苷酸补平，使两端均为平端。将所得含有CMV启动子-接头-BGH poly(A)的片段从凝胶中分离，并与载体分离。将此片段连接于部分消化及去磷酸化的载体，检测方向及插入位点。所得质粒称为pcDNAs3000/DHFRwt(图4)。
实施例2构建EPO表达载体在成年人肝脏cDNA文库中使用寡核苷酸引物EPO-START5’AAA AAG GAT CCG CCA CCA TGC GGG TGC ACG AAT GTCCTG CCT G-3′，和EPO-STOP5’AAA AAG GAT CCT CAT CTGTCC CCT GTC CTG CAG GCC TC-3′(CambridgeBioscience公司)，通过PCR克隆全长人EPOcDNA。将扩增的片段克隆入用BamHI线性化的pUC18中。通过双链测序法检测序列。将含有在pUC18中的EPO cDNA的此质粒用BamHI消化，并将EPO插入序列自琼脂糖凝胶中纯化。质粒pcDNA2000/DHFRwt和pcDNA2000/DHFRm用BamHI线性化，并通过SAP在5’突出端去磷酸化，并将质粒从琼脂糖凝胶中纯化。将EPOcDNA片段连接于pcDNA2000/DHFRwt和pcDNA2000/DHFRm的BamHI位点；所得质粒称为pEPO2000/DHFRwt(图5)和pEPO2000/DHFRm。
质粒pMLPI.TK(如WO97/00326所述)是设计与改良的包装细胞系如PER.C6(如WO97/00326和US 08/892 873所述)组合使用的衔接子质粒的一实例。首先，用以下引物从pZipΔMo+PyF101(N-)模板DNA(见于PCT/NL96/00195所述)中产生PCR片段LTR-1(5’-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CATGGA AAA ATA CAT AAC TG-3′)和LTR-2(5’-GCG GAT CCTTCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGGGCG ACT CAG TCA ATCG-3′)。然后将PCR产物用BamHI消化，并连接于用Pvu II和BamHI消化的pMLP10(Levrero等，1991)中，从而产生载体pLTR10。此载体含有腺病毒1-454bp序列，后接由Mo-MuLV的一部分组成的启动子，其野生型增强子由多瘤病毒突变体(PyF101)的增强子所取代。此启动子片段称为L420。接着，插入小鼠H SA基因的编码区。将p LTR10用BstBI消化随后通过Klenow处理及用NcoI消化。用以下引物在pUC18-H SA(Kay等，1990)上进行PCR扩增而获得HSA基因HSA1(5’-GCG CCA CCATGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3’)和HSA2(5’-GTT AGATCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATGTAG AA-3′)。将269bp的PCR片段用NcoI和Bgl II位点亚克隆入穿梭载体中。测序分析证实掺入正确的HSA基因编码序列，但在TAG终止密码子之后有额外的TAG插入体。包括TAG重复的HSA基因的编码区然后用NcoI/SalI酶切为片段，并克隆入经NcoI/BstBI酶切的3.5kb的p LTR 10中，产生p LTR-HSA10。将此质粒用EcoRI和BamHI消化，之后将含有剩余的ITR，包装信号，L420启动子和HSA基因的片段插入用相同酶消化的载体pMLPI.TK中，从而置换启动子和基因序列，产生新的衔接子质粒pAd5/L420-HSA。
将pAd5/L420-HSA质粒用Avr II和Bgl II消化，随后用Klenow处理，并连接于平端的1570bp的pcDNA1/amp[Invitrogen]的片段中，该片段是通过用HhaI和AvrII消化，随后用T4 DNA聚合酶处理而获得的。此衔接子质粒称为pAd5/CLIP。
为能从剩余的ITR中除去载体序列，将pAd5/L420-HSA用EcoRI部分消化，并分离线性化的片段。将序列为5’-TTA AGTCGA C-3′的寡聚物自身退火，产生具有SalI位点和EcoRI突出端的接头。将此接头连接于部分消化的pAd5/L420-HSA载体，并选择这样的克隆，该克隆中接头插入pAd5/L420-HSA中剩余的腺病毒ITR上游23bp的EcoRI位点中，产生pAd5/L420-HSA.sal。
为能从剩余的ITR中除去载体序列，将pAd5/CLIP也用EcoRI部分消化，并分离线性化的片段。将EcoRI接头5’-TTA AGT CGAC-3′连接于部分消化的pAd5/CLIP载体，并选择这样的克隆，该克隆中接头插入剩余的腺病毒ITR上游23bp的EcoRI位点中，产生pAd5/CLIP.sal。对载体pAd5/L420-HSA也进行修饰以产生位于剩余的ITR上游的PacI位点。之后，将pAd5/L420-HSA用EcoRI消化，并连接于PacI接头(5’-AAT TGT CTT AAT TAA CCG CTTAA-3’)。将此连接混合物用PacI消化，并在琼脂糖凝胶中分离线性化DNA以除去串联的接头之后再连接。由此产生衔接子质粒pAd5/I420-HSA.pac。
将此质粒用AvrII和Bgl II消化。将此载体片段与用相同限制酶消化的接头寡核苷酸连接。此接头是通过退火以下序列的寡聚物而产生的PLL-1(5’-GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACCGGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GATCTG G-3′)和PLL-2(5’-CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATCCGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAGGGA TGG C-3’)。将退火的接头分别连接于Avr II/Bgl II消化的pAd5/L420-HSA.pac片段，产生pAdMire.pac。随后，将含有sal接头的0.7kb的pAd5/CLIP.sal的ScaI/BsrGI片段，在除去含有pal接头的片段之后，克隆入pAdMire.pac质粒的ScaI/BsrGI位点中。所得质粒称为pAdMire.sal。
将质粒pAd5/L420-HSA.pac用AvrII消化，并将5’突出端用Klenow酶补平。用HindIII的第二次消化除去L420启动子序列。分离载体片段并分别连接于含有CMV启动子序列的PCR片段中。此PCR片段是用以下引物从pCMVLacI(Stratagene)中扩增CMV序列之后而获得的CMVplus(5’-GAT CGG TAC CAC TGC AGTGGT CAA TAT TGG CCA TTA GCC-3’)和CMVminA(5’-GATCAA GC TTC CAA TGC ACC GTT CCC GGC-3’)。将此PCR片段首先用PstI消化，然后通过T4 DNA聚合酶处理除去3’突出端。接着将此DNA用Hind III消化并连接于经Avr II/Hind III消化的pAd5/L420-HAS.pac载体中。所得质粒称为pAd5/CMV-HAS.pac。将此质粒随后用Hind III和BamHI消化，分离载体片段并连接于经Hind III/Bgl II消化后的pAdMire.pac的多接头序列中。所得质粒称为pAdApt.pac，并含有人CMV启动子/增强子(BoshartM等，1985)的-735～+95位核苷酸。将含有用于正确翻译的完全Kozak序列的全长人EPOc DNA(Genbank登记号M11319)，在经BamHI消化后从pUC18主链中取出。将此cDNA插入体经琼脂糖凝胶纯化并连接于pAdApt.pac中，该pAdApt.pac也用BamHI消化，接着在5’和3’插入位点用SAP去磷酸化，并也经琼脂糖凝胶纯化，以除去短BamHI-BamHI接头序列。将所得环状质粒用KpnI，DdeI和NcoI限制消化检测，均示出正确条带。另外，通过双链测序法确定方向和序列。所得具有正确方向的人EPOc DNA的质粒称为pAdApt.EPO(图6)。
实施例3构建UBS-54表达载体包含内含子序列和连接(“铰链”)区的人免疫球蛋白G1(IgG1)基因的重链恒定区(CH1，CH2和CH3)，是用上游和下游引物通过PCR产生的。上游引物(CAMH-UP)序列是5’-GAT CGA TATCGC TAGCAC CAA GGG CCCATC GGT C-3′，其中退火核苷酸以斜体字表示，两个相接的限制酶识别位点(EcoRV和NheI)是下划线处。
下游引物(CAMH-DOWN)的序列是5’-GAT CGT TTAAACTCA TTT ACC CGG AGA CAG-3’，其中退火核苷酸以斜体字表示，导入的PmeI限制酶识别位点是划线处。
人IgG1重链的各区域如下排列CH1-内含子-铰链-内含子-CH2-内含子-CH3。在质粒(pCMgamma NEO Skappa VgammaCgamma hu)上进行PCR，所述质粒含有抗人血纤蛋白原的D二聚体(Vandamme等，1990)的人化抗体的重链。此抗体称为15C5，且其人化是通过导入包括内含子序列的人恒定区而进行的(Bulens等，1991)。
PCR产生1621个核苷酸的产物。导入NheI和PmeI位点以易于克隆入pcDNA2000/Hyg(-)多接头中。NheI位点编码二个氨基酸(Ala和Ser)，其是恒定区CH1的一部分，但不与模板中存在的DNA杂交(Crowe等，1992)。
将PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化，并连接于经NheI和PmeI消化及琼脂糖凝胶纯化的pcDNA2000/Hygro(-)中。产生质粒pHC2000/Hyg(-)(图7)，其可用于将包括内含子的人重链恒定区连接于任何鉴别的免疫球蛋白重链的任何可能的可变区，以进行人化。
人免疫球蛋白(IgG1)基因的轻链恒定区，是用上游和下游引物通过PCR产生的。上游引物(CAML-UP)的序列是5’-GAT CCGTAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT C-3′，其中退火核苷酸以斜字体表示，导入的SunI限制酶识别位点是下划线处。下游引物(CAML-DOWN)的序列是5’-GAT CGT TTA AACCTA ACA CTC TCCCCT GTT G-3’，其中退火核苷酸以斜字体表示，导入的PmeI限制酶识别位点是下划线处。在质粒(pCMkappa DHFR13 15C5 kappa人化的)上进行PCR，该质粒携带连接于人IgG1轻链恒定区的15C5小鼠信号序列和小鼠轻链可变区(Vandamme等，1990；Bulens等，1991)。
PCR产生340个核苷酸的产物。导入SunI和PmeI位点以克隆入pcDNA2001/DHFRwt多接头。SunI位点编码两个氨基酸(Arg和Thr)，其苏氨酸残基是人免疫球蛋白轻链恒定区的一部分，而精氨酸是CAMPATH-1H(Crowe等，1992)的可变区的一部分。这使得随后可进行3’克隆入质粒唯一的SunI位点。将PCR产物用SunI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化，连接于经BamHI，PmeI消化的及琼脂糖凝胶纯化的用Klenow酶和游离核苷酸平端化的pcDNA2001/DHFRwt中。正确方向的连接导致在5’端丧失BamHI位点，及保留SunI和PmeI位点。所得质粒称为pLC2001/DHFRwt(图8)，该质粒可用于将人轻链恒定区连接于任何鉴别的免疫球蛋白轻链的任何可能的可变区以人化。
pNUT-C gamma(Huls等，1999)含有人IgG1重链恒定区，内含子和绞链区(Huls等，1999)，并在第一个恒定区上游接受由以下前导肽序列为先导的完全人化的单克隆抗体UBS-54的γ链可变区，所述前导肽序列为MACPGFLWALVISTCLEFSM(序列5’-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATCTCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3′)。所产生的插入体长度大约为2kb。完整的γ链是用上游引物(UBS-UP)和下游引物CAMH-DOWN通过PCR扩增的。UBS-UP的序列为5′-GAT CAC GCGTGC TAG CCA CCA TGG CAT GCC CTG GCT TC-3′其中导入的MluI和NheI位点是下划线处，完全的Kozak序列是斜体字处。将所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化并连接于pcDNA2000/Hygro(-)质粒，该质粒也是用NheI和PmeI消化，用tSAP去磷酸化并经凝胶纯化的。所得质粒称为pUBS-Heavy2000/Hyg(-)(图9)。pNUT-C kappa含有人IgG1 kappa(Huls等，1999)轻链恒定区，及接受由以下前导肽为先导的完全人化的单克隆抗体UBS-54kappa链的可变区，所述前导肽为MACPGFLWALVISTCLEFSM(序列5’-ATG GCA TGC CCT GGCTTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTTTCC ATG-3’，关于此质粒的详述见UbiSys所述)。产生的插入体长度大约为1.2kb。完整的插入体是用上游引物UBS-UP和下游引物CAML-DOWN通过PCR扩增的，以此修饰翻译起始位点。将所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化，并连接于pcDNA2001/DHFRwt中，产生pUBS-Light2001/DHFRwt(图10)，pcDNA2001/DHFRwt也是用NheI和PmeI消化的，用tSAP去磷酸化并经凝胶纯化的。为除去位于pNUT-Cgamma中可变区和第一个恒定区之间的额外内含子，及将信号肽和可变区与野生型人IgG1重链恒定区连接，缺失pNUT-Cgamma中羧基末端恒定区中的许多多态性，用UBS-UP和具有以下序列的UBSHV-DOWN引物产生PCR产物5’-GAT CGC TAG CTG TCG AGA CGG TGACCA G-3′，其中导入的NheI位点是下划线处，退火核苷酸以斜体字表示。所得PCR产物用NheI限制酶消化，经凝胶纯化并连接于经NheI消化和SAP去磷酸化的，及经凝胶纯化的pHC2000/Hyg(-)质粒中。具有正确方向的插入体和开放读框称的该质粒为pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)(图11)。
为除去位于pNUT-Ckappa中可变区和恒定区之间的额外内含子，及将信号肽和可变区连接于人IgG1轻链的野生型恒定区，用UBS-UP和具有以下序列的UBSLV-DOWN引物产生PCR产物5’-GAT CCG TAC GCT TGA TCT CCA CCT TGG TC-3′，其中导入的SunI位点是下划线处，退火核苷酸是黑体字处。然后将所得PCR产物用MluI和SunI限制酶消化，经凝胶纯化，并连接于经MluI和SunI消化的，经凝胶纯化的pLC2001/DHFRwt质粒中。所得质粒称为pUBS2-Light2001/DHFRwt(图12)。UBS-54的全长重链的PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，并用Klenow酶平端化。将此片段连接于质粒pcDNAS3000/DHFRwt中，该质粒用BstXI限制酶消化，平端化，通过SAP去磷酸化并经凝胶纯化。具有重链插入体的质粒称为pUBS-Heavy3000/DHFRwt。接着，将轻链的PCR产物用MluI和PmeI限制酶消化，平端化，经凝胶纯化，并连接于pUBS-Heavy3000/DHFRwt中，该质粒用HpaI消化，通过tSAP去磷酸化并经凝胶纯化。所得载体称为pUBS-3000/DHFRwt(图13)。将编码不含可变区和第一个恒定区之间的内含子，但具有野生型羧基端恒定区的UBS-54的重链的基因(2031个核苷酸)，在用EcoRI和PmeI消化pUBS2-2000/Hyg(-)，及用Klenow酶和游离核苷酸平端化EcoRI位点之后，经凝胶纯化。接着，将该插入体连接于pcDNAs3000/DHFRwt质粒，该质粒用BstXI消化，平端化，用SAP去磷酸化并经凝胶纯化。所得质粒称为pUBS2-Heavy3000/DHFRwt。然后将pUBS2-Light2001/DHFRwt用EcoRV和PmeI消化，并将含有信号肽以及相连接的UBS-54的Kappa链的可变区和没有内含子序列的人IgG1Kappa链的恒定区的755个核苷酸插入体经凝胶纯化，并连接于pUBS2-Heavy3000/DHFRwt中，该质粒用HpaI消化，用tSAP去磷酸化并经凝胶纯化。所得质粒称为pUBS2-3000/DHFRwt(图14)。
将质粒pRc/CMV[Invitrogen]用BstBI限制酶消化，用Klenow酶平端化，接着用XmaI酶消化。将含有新霉素抗性基因的此片段经琼脂糖凝胶纯化，并连接于pUBS-Light2001/DHFRwt质粒，该质粒用XmaI和PmlI限制酶消化，随后用SAP去磷酸化并经凝胶纯化以除去DHFRcDNA。所得质粒称为pUBS-Light2001/Neo。将此片段也连接于经XmaI/PmlI消化及凝胶纯化的pcDNA2001/DHFRwt质粒，产生pcDNA2001/Neo。将UBS-54可变区的PCR产物和消化及纯化的恒定区PCR产物用于与MluI/PmeI消化的pcDNA2001/Neo三点连接。所得质粒称为pUBS2-Light2001/Neo。
实施例4构建CAMPATH-1H表达载体Cambridge生物科学公司(英国)生产了一种396个核苷酸的片段，其含有完整的Kozak序列，后接公布的CAMPATH-1H轻链的信号序列和可变区(Crowe等，1992)。此片段在5’末端含有导入的和单一的Hind III位点，在3’末端含有导入的和单一的SunI位点，将此片段导入适当的穿梭载体中。将此质粒用Hind III和SunI消化，并将所得CAMPATH-1H轻链片段经凝胶纯化，并连接于经Hind III/SunI消化和琼脂糖凝胶纯化的pLC2001/DHFRwt中。所得质粒称为pCAMPATH-Light2001/DHFRwt。Cambridge生物科学公司(英国)生产了一种438个核苷酸的片段，其含有完整的Kozak序列，后接CAMPATH-1H重链可变区的信号序列和公布的可变区(Crowe等，1992)，将此片段克隆入适当的克隆载体中。此产物在5’末端含有单一的Hind III限制酶识别位点，在3’末端含有单一的NheI限制酶识别位点。此质粒用Hind III和NheI消化，所得CAMPATH-1H重链片段经凝胶纯化，并连接于纯化的及经Hind III/NheI消化的pHC2000/Hyg(-)中。所得质粒称为pCAMPATH-Heavy2000/Hyg(-)。
实施例5；构建15C5表达载体抗人血纤蛋白片段D二聚体的人化形式的单克隆抗体15C5的重链(Bulens等，1991；Vandamme等，1990)，由包含内含子序列的人恒定区，绞链区和可变区及前导的来自15C5kappa轻链的信号肽组成，其是用质粒“pCMgamma NEO Skappa Vgamma Cgammahu”作模板用CAMH-DOWN作下游引物，和15C5-UP作上游引物，通过PCR而扩增。15C5-UP引物具有以下序列5’-GA TCA CGCGTG CTA GCC ACC ATG GGT ACT CCT GCT CAG TTT CTT GGAATC-3′，其中导入的MluI和NheI限制酶识别位点是下划线处，完整的Kozak序列是斜体字处。为适当的导入合适的Kozak结构，在+4位的腺嘌呤(ATG起始密码子中腺嘌呤是+1位)用鸟嘌呤置换，导致精氨酸突变为甘氨酸。为防止引物二聚体化，将+6位的鸟嘌呤用胸腺嘧啶置换，+9位的胞嘧啶用胸腺嘧啶置换。后一种突变中苏氨酸残基保持原样。所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经凝胶纯化并连接于经NheI和PmeI消化的，及通过SAP去磷酸化和凝胶纯化的pcDNA2000/Hygro(-)中。所得质粒称为p15C5-Heavy2000/Hyg(-)。抗人血纤蛋白片段D二聚体的人化形式单克隆抗体15C5的轻链(Bulens等，1991；Vandamme等，1990)，由人恒定区和可变区以及前导的20个氨基酸的信号肽组成，将其用质粒pCMkappaDHFR1315C5 kappahu作模板，用CAML-DOWN作下游引物，15C5-UP作上游引物，通过PCR扩增。所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经凝胶纯化并连接于经NheI和PmeI消化的，及通过SAP去磷酸化及经琼脂糖凝胶纯化的pcDNA2001/DHFRwt中。所得质粒称为p15C5-Light2001/DHFRwt。
实施例6确定氨甲喋呤、潮霉素和G418选择水平将PER.C6和PER.C6/E2A以不同密度种植。在这些敏感性研究中氨甲喋呤(MTX)的起始浓度范围在0nM至2500nM之间。确定这两种细胞系的致死浓度；当在6孔平皿中细胞以100,000个细胞/孔的密度种植时，在10nM浓度每孔仍100％铺满，在25nM浓度，90-100％铺满，而在50nM浓度大多数细胞被杀死，在温育6-15天之后则更多细胞被杀死。这些结果概括示于表1。对PER.C6细胞测试其对潮霉素和G418组合的抗性，以选择突出生长的稳定集落，该集落表达由携带潮霉素或新霉素抗性基因的质粒编码的各重组单克隆抗体的重链和轻链。当细胞在含有100μg/ml潮霉素和250μg/ml G418的正常培养基上生长时，未转染的细胞被杀死，稳定的集落可显现(见实施例7)。
将CHO-dhfr细胞ATCCCRL9096以不同浓度种植于各自的培养基中。在这些敏感性研究中氨甲喋呤的起始浓度范围在大约0.5nM至500nM之间。确定此细胞系的致死浓度，接着在IgG重链选择(hyg)和轻链选择(dhfr)的情况中在潮霉素中生长选择之后，直接使用。
实施例7转染EPO表达载体以获得稳定的细胞系将PER.C6和PER.C6/E2A细胞系的细胞以大约2-3×106个细胞/平皿种植于40个组织培养平皿(直径10cm)中，并在各自的条件下保持过夜(PER.C6/E2A的条件为39℃，10％ CO2浓度，PER.C6的条件为37℃，10％ CO2浓度)。第二天，在37℃用Lipofectamine(Gibco)进行转染。在用新鲜培养基(DMEM)置换4小时之后，将PER.C6/E2A细胞再移至39℃环境中，而PER.C6/E2A细胞保持37℃。将每个细胞系的20个平皿用5μg经ScaI消化的pEPO2000/DHFRwt转染，另20个平皿用5μg经ScaI消化的pEPO2000/DHFRm转染。另13个平皿作为氨甲喋呤杀伤力和转染效率的阴性对照，转染效率为大约50％。第二天，在溶解于含有透析的FBS的培养基中的DHFRwt中加入浓度为100-1000nM的MTX，在DHFRm中加入浓度为50.000-500.000nM的MTX。将细胞温育4-5周。每2-3天更换一次组织培养基(含有MTX)。监测细胞每天的死亡情况，将阳性与阴性对照结果相比较。挑取突出生长的集落并亚克隆。在接受突变体DHFR基因的转染体中不能传代培养阳性克隆，主要是由于所应用的高浓度MTX的毒性效应所致。从用野生型DHFR基因转染的PER.C6和PER.C6/E2A细胞中，只有当细胞在100nMMTX中生长时在第一代中可建立细胞系。尽管在250和500nM MTX的平皿中呈现集落，这些克隆在传代培养期间无价值，将其杀死。
实施例8转染的细胞的传代培养将从每个细胞系中选择的大约50个对MTX阈值浓度有抗性的集落，以其各自的培养基加上MTX生长于96孔，24孔，6孔平板和T25瓶中。当细胞在T25组织培养瓶中生长时，将每个克隆的至少一个小瓶冷冻储存，随后测试人重组EPO的产生。为此，使用购自R&D系统的ELISA试剂盒(Quantikine IVD human EPO，Quantitative Colorimetric Sandwich ELISA，cat.#DEPOO)。由于不同的克隆呈现不同的生长特性和生长曲线，EPO生产标准设定如下开始时将细胞种植于T25组织培养瓶中，浓度为0.5-1.5×106个细胞/瓶。在第4天，取上清并用于EPOELISA中。由此生产水平设定为ELISA单位/106个种植的细胞/天(U/1E6/天)。这些克隆中的一些见表2所示。
良好生产克隆是基于高表达，培养行为及生存性选择的。为检测在延期生长期间在滚瓶和生物反应器中的长期生存性，悬浮生长能力，将最佳生产克隆的多个小瓶冷冻，并选择以下每个细胞系的最佳生产者进行进一步研究P8，P9，E17和E55，其中“P”代表PER.C6，“E”代表PER.C6/E2A。将这些克隆传代培养并在2个月内提高氨甲喋呤剂量。从区域值浓度开始，并提高至0.2m M。在这两个月期间，定期进行EPO ELISA试验，以检测EPO产生量的增加情况。在最高氨甲喋呤浓度，选择最稳定的生产者，与得自最佳CHO克隆的数量进行对比，并用于细胞存库(RL)。将所有其它克隆的5个小瓶冷冻。通过Southern印迹分析检测扩增的EPOc DNA拷贝数目。
实施例9在生物反应器中生产EPO将产生EPO的最佳转染PER.C6的稳定细胞系，P9，置于悬浮液中并按比例扩容至1-2升发酵罐中。为将P9置于悬浮液中，用PBS冲洗贴壁细胞，接着用PER.C6的JRHExCeLL525培养基(JRH)温育，之后细胞自瓶中脱落，形成悬浮培养物。将细胞保持在两种浓度的MTX中0nM和100nM。在这些浓度中(在滚瓶)达到的EPO的一般生产水平分别为1500和5700单位/106种植的细胞/天。尽管在没有MTX的情况下产量较低可解释为由于整合的DNA除去所致，但似乎也有整合的DNA的抑制效应，因为在较低浓度MTX中长期保持的细胞当它们再一次移至100nMMTX浓度时能达到它们从前的产量(见实施例11)。
将悬浮的P9细胞与100nM MTX正常培养生长，并用于接种生物反应器。对两种生物反应器设定进行测试；灌流和重复分批培养。
A在2升生物反应器中灌流将细胞以0.5×106个细胞/ml浓度种植，并在细胞达到大约2.3×106个细胞/ml密度之后3天开始灌流。灌流速率为每24小时1体积，流量为每24小时250ml。在此设定中，P9细胞停留在大约5×106细胞/ml的恒定密度下，且几乎95％的生存力超过一个月。定期确定EPO浓度并示于图15。在2升灌流的生物反应器中，P9细胞能保持大约6000ELISA单位/ml的生产水平。灌流速率为1工作体积/天(1.5-1.6升)时，这意味着在此2升生物反应器中，在没有MTX的情况下，P9细胞生产大约1×107单位/天/2升生物反应器。
B.在2升生物反应器中重复分批培养将在滚瓶中生长的P9悬浮细胞接种于没有MTX的2升生物反应器中，并至生长为大约1.5×106个细胞/ml密度，之后除去1/3的细胞群(每2-3天±1升)，并将剩余的培养物用新鲜培养基稀释至密度为0.5×106个细胞/ml。将此步骤重复3周，工作体积保持在1.6升。确定除去的培养基中EPO浓度，结果示于图16。平均浓度为大约3000 ELISA单位/ml。对平均2天后将细胞群稀释，这意味着在此2升生物反应器中，在没有MTX的情况下，P9细胞生产大约1.5×106单位/天。
C.在具有不同浓度溶解氧，温度和pH设定值的1升生物反应器中重复分批培养将P9悬浮细胞在存在100nM MTX的情况下，在滚瓶中生长，并用于接种4×1升生物反应器，至在JRH ExCeLL525培养基中密度为0.3×106个细胞/ml。在3′5和7天后确定EPO产量。测试的第一种设定值是溶解氧的浓度(％DO)为0.5％，10％，150％，阳性对照为50％。50％DO是正常保持PER.C6和P9细胞的条件。在另一试验中，在不同温度下(32℃，34℃，37℃和39℃)接种P9细胞并测试EPO产量，其中37℃是PER.C6和P9细胞的正常设定值。在又一试验中，在不同pH值(pH6.5，pH6.8，pH7.0和pH7.3)下接种新鲜P9细胞并测试EPO产量。PER.C6细胞在pH7.3的情况下正常保持。EPO产量(在种植3天后)结果示于图17。明显地，当温度从32℃升至39℃时，EPO浓度增加，PER.C6/E2A细胞在39℃也可见到此结果(表4)，且50％DO对P9细胞而言是测试范围内最佳的。在pH6.5，细胞不能存活，因为在此生物反应器中的存活性在7天之后降低80％。对在这些设定值中产生的EPO样品检测糖基化及在2D电泳中的电荷情况(也见于实施例17)。
实施例10扩增DHFR基因将实施例8所述的一些细胞系用于扩增试验，以确定在2个月以上的时间内，通过提高MTX浓度而发生的DHFR基因数目增加的可能性。起始浓度为阈值浓度(100nM)，并以200nM，400nM，800nM和1200nM梯度加至1800nM。在此期间，定期进行EPO ELISA试验，以检测每天每106个种植的细胞的ELISA单位数(图18)。在最高MTX浓度(1800nM)，冷冻一些小瓶。从中获取细胞沉淀，提取DNA并接着用Bgl II消化，因为此酶在p EPO2000/DHFRwt中的野生型DHFR基因附近切割(图5)，因此这种大小的独特DHFR条带可与Southern印迹中内源性DHFR条带相区别。将此DNA进行印迹，并将印迹与放射性DHFR探针杂交，接着用腺病毒E1探针作背景对照(图19)。在磷光显影仪中测定杂交条带的强度，并对背景水平校正。结果示于表3。明显地，尽管在此情况下只有内源性DHFR而无整合的载体，仍可在PER.C6细胞中获得扩增的DHFR基因。
实施例11在稳定的细胞系中EPO表达的稳定性将实施例8