专利名称：作为Fc融和蛋白之抗肥胖蛋白质的表达和外运的制作方法肥胖是伴发一些例如，糖尿病、高血压、心脏病和某些类型的癌症等疾病的主要生理紊乱。在美国，估计有超过30％的成人人口肥胖，例如至少20％超过理想体重。越来越多的迹象表明肥胖很快成为严重的世界性健康问题。已经认识到，在很多情况下，尤其在继承使之易患肥胖的遗传性状的人群中，单独的饮食和锻炼不足以降低体重。因此，需要帮助人们降低体重和降低肥胖相关病症危险性的药物。更具体地，需要在适宜的剂量水平，具有导致实质性体重下降的足够效力的抗肥胖药物。因为肥胖定义为超过理想体重20％，所以需要体重下降至少20％。在更严重的个案中，为使其体重降至健康范围，需要体重下降30-60％。肥胖症是多因素表型，其可以是生理、心理、遗传和环境因素的共同作用结果。与肥胖症有关的一个因素是肥胖(ob)基因，现已将其克隆(Zhang等人.(1994)自然(Nature)372425)。在正常小鼠中，该ob基因编码称为瘦素的激素(Friedman等人.(1998)自然395763)。在饱合状况下，过剩的能量在脂肪细胞中转化或以甘油三酯形式储存，反过来该脂肪细胞分泌瘦素至血流中。通过与其受体结合瘦素行使信使的功能，该受体的较长形态具有能进行信号转导的细胞质区域，并且发现该受体主要在下丘脑中。考虑激素受体结合是信号机制，通过该机制，脂肪组织可以通知大脑关于能量储存状况。考虑瘦素通过血脑屏障来接近位于下丘脑中的瘦素受体(Spiegelman等人，(1996)细胞(Cell)87377)。当大脑接收到能量储存丰富的信息时，它命令身体通过降低食物摄入和/或增加能量消耗进行相应调整。称为ob/ob小鼠的病态肥胖鼠是具有两个突变ob等位基因的纯合子。该突变等位基因产生截短的瘦素，其是无功能的并且可能在体内很快降解。在ob/ob小鼠中瘦素缺乏的结果是嗜睡、体温过低、高血糖、高血胰岛素和不育。在人类，尽管已经报道大多数肥胖病人具有高的循环瘦素水平(Considine等人.(1995)新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med)334292)，但是也存在与瘦素缺乏有关的体重增加和肥胖的证据(Montague等人(1997)自然387903；Ravussin等人(1997)自然医学(Nature Medicine)3238)。通过给予重组瘦素可缓解ob/ob小鼠中瘦素缺乏的相关症状。每日腹腔内注射瘦素可降低食物摄入、体重、体脂百分比和血清葡萄糖和胰岛素浓度。其伴发代谢率、体温和运动活动度的增加，所有的这些都需要能量消耗(Pelleymounter等人.(1995)科学(Science)269540；Halaas等人(1995)科学269543)。在相同的研究中，尽管体重、摄食和身体脂肪的降低是很小的，正常小鼠也从瘦素治疗中获得好处。也可以将重组瘦素用于纠正雌性和雄性ob/ob小鼠的不孕症(Chebab等人.(1996)自然遗传学(Nature Genetics)12318；Mounzib等人.(1997)内分泌学(Endocrinology)1381190)。而且最近的应用转基因小鼠的试验提示具有正常或低瘦素水平的大约5-10％肥胖人类可以对瘦素治疗敏感(Loffe等人，(1998)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9511852)。应用当前形式的瘦素需要每天多次注射大剂量的该蛋白质来达到预期的临床结果。例如，在最近的临床试验中，一些在大剂量范围的志愿者需要每日三次注射瘦素达6个月(Wall Street Journal，615，1998)。大概，因为瘦素效力低和血清半衰期较短，需要经常地、大剂量的给药。该发现也与在ob/ob小鼠中的发现相一致，其中为证实体重的明显降低，需要腹腔内注射5-20mg/kg/天的瘦素(Pelleymounter等人.(1995)科学269540；Hallas等人.(1995)科学269543；Chebab等人.(1996)自然遗传学12318；Mounzih等人.(1997)内分泌学1381190)。为克服瘦素的“非最佳药物动力学”，在小鼠中为达到瘦素的生理血浆水平，需要皮下持续输注400ng/hr的瘦素(Halaas等人.(1997)美国国家科学院院报948878)。内在特性例如，瘦素大小和该药剂的制备方法看来是经常、大剂量(的给药)的主要原因。瘦素的分子量大约为16kD(Halaas等人.(1995)科学269543)这样该小分子足以通过肾脏滤过清除。因此，为弥补在体内的短血清半衰期，可需要大剂量给药。而且，较小的蛋白质例如瘦素可以在细菌，例如，大肠杆菌中产生。在某些情况下，在大肠杆菌中以不溶性包涵体(的形式)制备重组瘦素。应用前，使用变性剂，例如，盐酸胍溶解该包涵体，在变性条件下提纯之，并且在适宜条件下折叠，以制备功能蛋白质。另外瘦素含有两个参与分子内部二硫键形成的半胱氨酸残基。这样，为使可溶性的生物活性分子的回收达到最佳化，需要仔细控制该折叠过程以降低不可溶性蛋白质团块和分子间二硫键的形成。作为这样一个复杂生产过程的结果，也就是，从原核生物的包涵体中提纯瘦素，提供具有全部生物活性的特定同种蛋白质是不可能的。试图提高瘦素溶解度的方法包括，使某些氨基酸残基突变为天冬氨酸或谷氨酸，从而使瘦素的等电点(pI)由5.84降至5.5以下(美国专利号.5,719,266)。尽管这样操作得到能轻松制备和储存的产物，但是该产物也可以是能够在预期的接受体中具有免疫原性的突变蛋白质。
考虑到大剂量、低效能、短血清半衰期和在瘦素生产和提纯中的极其复杂的过程，在本领域需要增加产量和改善该抗肥胖试剂药理学特性的方法。
发明简述本发明涉及可用于制备和应用含有抗肥胖蛋白质例如，瘦素的融和蛋白的方法和组合物。该融和蛋白可促进具有生物活性的抗肥胖蛋白质的高水平表达。在向哺乳动物，例如，人给药前，该融和蛋白能与药用载体组合。在某些环境下，在制备和/或给药前，该抗肥胖蛋白质可从融和蛋白中断裂。或者，可以将编码含有融和蛋白的该抗肥胖蛋白质的核酸序列与药用载体组合并给于哺乳动物。
本发明的目的是提供新型的促进瘦素产生和分泌的核酸序列，例如，DNAs和RNAs。具体地，本发明的目的是(i)提供促进瘦素高效生产和分泌的新型核酸序列；(ii)提供在多种哺乳动物宿主细胞中用于瘦素快速和高效生产和分泌的核酸构建体；(iii)提供生产、分泌和收集重组瘦素或及其遗传操作的变异体的方法，该变异体包括非天然的、生物合成的、或其它人工瘦素蛋白质，例如，通过理性设计产生的蛋白质。
本发明的其它目的是提供多核苷酸序列，当与编码瘦素的多核苷酸融和时，该序列编码可用常规试剂和技术纯化的含融和多肽的瘦素。其它目的还有在分泌盒与该编码的瘦素蛋白质之间插入蛋白分解的断裂位点，使该分泌盒从瘦素区域断裂，这样可独立地将瘦素提纯。
本发明其它地目的是提供含有瘦素的融和蛋白。本发明的融和蛋白具有优于自然瘦素的生物特性，例如，溶解度增强、血清半衰期延长和与其受体结合力增加。这些特性可明显提高瘦素的临床效能。在优选的实施方案中，该融和蛋白在N-到C-端方向包括，免疫球蛋白FC区和瘦素，和其它部分例如，在免疫球蛋白Fc区和瘦素之间任选地插入的蛋白裂解位点。该产生的融和蛋白优选地在细胞中合成，该细胞使该Fc区在正常糖基化作用位点也就是，经常存在于模板抗体中发生糖基化。糖基化作用至少部分地有助于瘦素循环半衰期的提高。
本发明的其它目的是提供多价和多聚形式的瘦素融和蛋白及其组合。
本发明的另一目的是提供应用该融合蛋白或断裂瘦素的治疗方法。本发明总的目的是提供既高效、便宜和生产具有生物活性的抗肥胖蛋白质的方法。
因此，在一方面，本发明提供编码免疫球蛋白Fc区-瘦素融合蛋白的核酸分子，例如，DNA或RNA分子。该核酸分子编码信号序列、免疫球蛋白Fc区，和至少一靶蛋白，在此也称为抗肥胖蛋白质，例如瘦素。在优选的实施方案中，该核酸分子5’-3’方向连续编码，该信号序列、免疫球蛋白Fc区和靶蛋白序列。在另一实施方案中，该核酸分子5’-3’方向连续编码，该信号序列、靶序列和免疫球蛋白Fc区。该核酸可编码X-Fc或Fc-X结构，其中X是靶蛋白例如瘦素。优选的实施方案是Fc-X，因为其表达水平较高。
在优选的实施方案中，该免疫球蛋白Fc区含有免疫球蛋白铰链区和优选含有至少一个免疫球蛋白恒定重链结构域，例如免疫球蛋白恒定重链2(CH2)结构域、免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域和依据产生Fc区的免疫球蛋白的类型，优选地，免疫球蛋白恒定重链4(CH4)结构域。在更优选的实施方案中，该免疫球蛋白Fc区至少缺少免疫球蛋白恒定重链(CH1)结构域。尽管免疫球蛋白Fc区可以以任何免疫球蛋白种类为基础，例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选以IgG为基础的免疫球蛋白Fc区。
可以将本发明核酸操作性掺入到可复制的表达载体中，然后可以将其导入能产生以瘦素为基础的融合蛋白的哺乳动物宿主细胞中。从哺乳动物宿主细胞中，高效生产和分泌所产生的以瘦素为基础的融合蛋白。无需裂解该哺乳动物宿主细胞，可从培养基中收集该分泌的以瘦素为基础的融合蛋白。应用所需的常规试剂能分析其活性和/或提纯该蛋白质产物，和/或应用传统的方法将其与融合伙伴(partner)分离。
另一方面，该发明提供含有直接通过多肽键或间接通过多肽连接物(1inker)与该靶蛋白相连的免疫球蛋白Fc区。可通过其C-端将该靶蛋白与免疫球蛋白Fc区N-端融合。但是，在更优选的实施方案中，可通过其N-端将该靶蛋白与免疫球蛋白Fc区C-端融合。
在一实施方案中，当向至少50克起始体重的ob/ob小鼠连续5天给予剂量大约为0.25mg/kg/天的本发明之融合蛋白时，其造成体重下降大约10％(约5克)，更优选大约12％(约6克)或更优选15％(约7.5克)。在更优选的实施方案中，当向起始体重至少50克的ob/ob小鼠连续5天给予剂量大约为0.1mg/kg/天的本发明之融合蛋白时，其造成体重下降大约10％(约5克)，更优选大约12％(约6克)或更优选15％(约7.5克)。
在另一实施方案中，该融合蛋白可含有第二靶蛋白，例如，成熟、全长瘦素或其生物活性片段。在该类型的构建体中，该第一和第二靶蛋白可以是相同的或不同的蛋白质。可以直接地或通过多肽连接物将该第一和第二靶蛋白连接在一起。或者，可以直接地或通过多肽连接物将两种靶蛋白与免疫球蛋白Fc区相连。在后者中，可以将该第一靶蛋白与免疫球蛋白Fc区N端相连，并且可以将第二靶蛋白与免疫球蛋白Fc区C端相连。
在另一实施方案中，两融合蛋白共价地，例如，通过二硫键或多肽键，或非共价连接以生成二聚体蛋白质。在优选的实施方案中，两融合蛋白通过至少一个和更优选的两个通过半胱氨酸残基(形成的)链间二硫键共价结合，该二硫键优选位于每一链免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白铰链区。
另一方面，本发明提供产生包括免疫球蛋白Fc区和该靶蛋白的融合蛋白的方法。该方法包括步骤(a)提供含有如编码带有或不带有信号序列的融合蛋白的DNA分子的哺乳类细胞，和(b)培养该哺乳类细胞以产生该融合蛋白。然后可利用本领域熟知和使用的传统纯化技术收集、再折叠(需要的话)和纯化所产生的融合蛋白。假设该融和蛋白包括位于免疫球蛋白Fc区和靶蛋白之间的蛋白水解断裂位点，可用传统的蛋白水解酶，将该靶蛋白从该融和蛋白上断裂，并且若需要的话，在使用前进行纯化。
还有一方面，通过给予哺乳动物有效剂量的通过本发明的方法和/或本发明的融合构建体产生的瘦素，本发明提供治疗用瘦素或其活性变体可减缓的疾病的方法。本发明还通过给予患有该疾病的哺乳动物以本发明的DNA或RNA，如“裸露DNA”，或含有该本发明之DNA或RNA的载体，提供治疗用瘦素或其活性变体可减缓的疾病的方法。
通过详细说明、附图和以下的权利要求，本发明的上述和其他目的、特点和优点会更加显而易见。
附图简述

图1A-1E是根据本发明构建的示例性抗肥胖融和蛋白的示意图。该图分别说明，图1A，Fc-瘦素二聚体；图1B，Fc-瘦素-甘氨酸丝氨酸连接体瘦素片段二聚体；图1C，Fc-瘦素-甘氨酸丝氨酸连接体-瘦素二聚体；图1D，瘦素-Fc二聚体；和图1E，瘦素-甘氨酸丝氨酸连接体-Fc二聚体。该竖线表示连接位于每一免疫球蛋白区之铰链区内的半胱氨酸残基(C)的任选的二硫键。
图2示用克表示的ob/ob小鼠的体重，该小鼠分别IP注射了0.25mg/kg鼠瘦素-连接体-鼠Fc(菱形)、0.25mg/kg鼠瘦素-鼠Fc(方形)、0.25mg/kg鼠Fc-鼠瘦素(三角形)、或磷酸盐缓冲液(PBS)(十字形)。
图3示每天(头12天每天给药，然后仅星期一至星期五给药)腹腔内(IP)注射0.25mg/kg鼠Fc-鼠瘦素(菱形)或磷酸盐缓冲液(PBS)(方形)的ob/ob小鼠的体重。
图4示连续5天每天静脉内(IV)注射0.25mg/kg鼠Fc-鼠瘦素(三角形)、1.0mg/kg鼠Fc-鼠瘦素(圆形)，或PBS(方形)，然后不加处理的ob/ob小鼠的体重(用克表示)。
图5示不同的剂量方案对ob/ob小鼠体重的影响，该小鼠皮下(SC)注射鼠Fc-鼠瘦素(0.25 mg/kg(菱形)；0.1 mg/kg然后是1.0mg/kg(方块))或PBS(三角形)。
图6示用克表示的ob/ob小鼠的体重，该小鼠腹腔内(IP)注射了0.1mg/kg人Fc-人瘦素(菱形)、0.5mg/kg人Fc-人瘦素(方形)、或磷酸盐缓冲液(PBS)(三角形)。
图7示给药后糖基化人Fc-人瘦素(菱形)和非糖基化人Fc(N-Q突变)-人瘦素(方形)随时间(小时)变化的血清循环水平。用起始剂量百分比表示该循环水平。
发明详述本发明提供可用于生产抗肥胖蛋白质的融合蛋白。可将本发明的融合蛋白和/或编码该融合蛋白的核酸直接给予需要用抗肥胖蛋白质治疗的哺乳类动物。但是考虑在使用前该抗肥胖蛋白质可自该融和蛋白中断裂。
因此本发明提供包括免疫球蛋白Fc区和至少一种靶蛋白的融和蛋白，该靶蛋白在此指瘦素。附图1A-1E说明了五个体现本发明的示例性蛋白质构建体实施方案。因为优选二聚体，所有示例均为二聚体，通过相邻亚基中半胱氨酸之间的一对二硫键交联。在附图中，该二硫键经过每一重链内的免疫球蛋白铰链区连接起两个免疫球蛋白重链Fc区，因此成为这些分子的天然形式的特点。尽管包括铰链Fc区的构建体是优选的，且已表明其作为治疗药物很有前景，本发明考虑可选择其他位置的交联。还有，一些情况下，可通过非共价连接例如疏水作用产生用于本发明的二聚体或多聚体。
由于构建体的同源二聚体是本发明重要的实施方案，附图示例的是此类构建体。应理解构建体的异源二聚体也可用于本发明。可构建用来抑制包括人类在内的多种哺乳类的肥胖症的成功构建体，例如二聚体Fc融和蛋白的一条链包括全长的瘦素，该二聚体Fc融和蛋白的另一条链包括瘦素变异体。
图1A表示根据此处所示原则产生的构建体二聚体(见，如实施例1和4)。实施例1表达鼠构建体，实施例4表达人构建体。该同源二聚体的每一单体包括免疫球蛋白Fc区1(包括铰链区)、CH2结构域和CH3结构域。直接连接到，即通过多肽键，Fc区C端的是瘦素2。应理解该Fc区可通过多肽连接物连接到靶蛋白上(数据未列)。
图1B和1C表示包括多种抗肥胖靶蛋白的蛋白质构建体，这些靶蛋白以串联方式排列，由连接物相连。图1B中，该靶蛋白包括全长瘦素2、由甘氨酸和丝氨酸残基组成的多肽连接物4，和瘦素的活性变异体3。图1C与图1B的构建体的不同处在于多数C端蛋白质结构域包括第二全长瘦素2拷贝。
尽管图1A-1C表示Fc-X构建体，其中X是该靶蛋白，考虑在本发明的实践中X-Fc构建体也是有用的。因此，图1D和IE描述根据此处所示原则制成的构建体(见，如，实施例5和6)。在图1D中描述的该X-Fc构建体在其N-端含有全长瘦素2’。含有铰链区的Fc区1’直接与该瘦素的C端连接。在图1E中阐述的构建体在其N端具有全长瘦素2’。但是与图1D相比，通过多肽连接物4’将图1E中描述的该瘦素2’与Fc区1’相连。而且，考虑用于本发明的蛋白质也可以用公式X-Fc-X代表，其中，该X’可代表相同或不同的蛋白质。
此处应用的该术语“多肽连接物”理解为可将在自然界中没有自然连接的两蛋白质连接在一起的肽序列。该多肽连接物优选包括多数氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸或这些氨基酸的组合。优选地，该多肽连接物含有约10-15个残基长的一系列甘氨酸和丝氨酸的肽。见，如，美国专利号5,258,698，该发现在此引用以作为参考。但是，考虑可通过常规的实验来测定该最佳连接物长度和氨基酸成分。
在此使用的术语“多价体”指掺入两个或多个生物活性片段的重组分子。形成多价体分子的蛋白质片段可通过肽连接物连接，该肽连接物与组成部分相连又不影响其独立行使功能。
在此使用的术语“二价体”指具有Fc-X或X-Fc结构的多价重组分子，其中X是靶分子。免疫球蛋白Fc区可以例如通过链间的二硫键连接成图1A和D所示的构建体类型。若本发明的融和构造具有Fc-X-X的结构，产生的Fc二聚体分子如图1C所示。两种靶蛋白可通过肽连接物相连。图1A所示构建体类型可提高靶分子与其受体之间的明显的结合亲和力。例如，若Fc-瘦素融和蛋白的一个瘦素基团能够以一定的亲和力结合到细胞上的受体的话，同一Fc-瘦素融和蛋白的另一个瘦素基团可以以更高的亲和力结合到同一细胞的另一个受体上(明显的亲和力)。之所以如此是因为第一个瘦素基团已结合后第二个瘦素基团与该受体的物理距离更接近。就抗体抗原结合而言，明显的亲和力可以提高至少一万倍，即104。每一蛋白质的亚基，即“X”，具有其独立功能，这样在多价分子中该蛋白质亚基的功能可以是相加或协同性的。
在此所用的术语“多聚”指两种或多种多肽链以共价例如通过共价作用如二硫键，或非共价方式例如疏水作用稳定连接。术语多聚体的意思为包括其中亚单位相同的同型多聚体和亚单位不同的异型多聚体。
在此使用的术语“二聚体”指两条多肽链通过共价或非-共价作用牢固结合的特定多聚分子。应当理解，包括至少部分铰链区、CH2和CH3结构域的免疫球蛋白Fc区一般组成二聚体。已知许多蛋白质配体以二聚体形式与其受体结合。如果蛋白质配体X自然二聚体化，在Fc-X分子中该X基团将在较高程度上形成二聚体，因为二聚体化过程是浓度依赖性的。Fc连接的该两X基团物理(距离)上的接近使得二聚体化在分子内进行，显著使该平衡向有利于二聚体(的方向)转化并且提高其与受体的结合力。
在此使用的术语“瘦素”理解为不仅是指全长的成熟的瘦素蛋白质(见，如，分别代表人和鼠成熟瘦素的SEP ID NO2和SEP ID NO4)，还指其变异体和其生物活性片段。术语生物活性片段是指通过应用ob/ob小鼠模型测定，具有至少30％、更优选至少70％、和最优选至少90％该天然模板瘦素蛋白质的生物活性的任何瘦素蛋白质片段。术语变异体包括种类和等位基因变异体，和其他的天然存在的或非天然存在例如，通过基因工程方法产生的变异体，其与任一此处所示天然存在的瘦素序列至少70％相似或60％相同，更优选地，至少75％相似或65％相同，最优选地，至少80％相似或70％相同。
为测定候选多肽与参考多肽相比是否具有所需百分比的相似性和相同性，应用Smith和Waterman在(1981)分子生物学杂志(J.Mol.Biol)147195-197中描述的动态编程算法，结合应用Henikoff和Henikoff(1992)，“来自蛋白质模块的氨基酸置换矩阵”，美国国家科学院院报8910915-10919中图2描述的BLOSUM62置换矩阵，首先将该候选氨基酸序列和参考氨基酸序列排列一起。就本发明而言，缝隙插入补偿(gap insertion penalty)的适宜值为-12，并且缝隙延伸补偿(gap extention penalty)的适宜值是-4。应用Smith-Waterman算法和BLOSUM62矩阵，例如GCG程序组(牛津分子组(Oxford Molecular Group)，牛津，英国)进行排列的计算机程序市场有售并且是本专业的那些技术人员所广泛应用的。
一旦该候选和参考序列之间的排列完成，可以计算相似性百分比。根据它们彼此的相似性，顺序比较每一序列的单一氨基酸。如果在BLOSUM62矩阵中与两种排列的氨基酸对应的值为0或负值的话，该匹配相似性分数为0；否则该匹配相似性分数为1。该原始匹配相似性分数为该排列的氨基酸的匹配相似性分数的和。然后通过除以在更小的候选或参考序列中的氨基酸数，将该原始匹配相似性分数标准化。标准化的原始分数是百分比相似性。或者，再一次顺序比较每一序列所排列的氨基酸，以计算相同性百分比。如果该氨基酸不同的话，该匹配相同分数为0；否则该匹配相同分数为1.0。原始相同分数是相同排列的氨基酸之和。然后通过除以在更小的该候选或参考序列中的氨基酸数，将原始匹配相同分数标准化。该标准化原始分数为相同性百分比。为了计算相似性和相同性百分比，忽略插入和缺失。因此，尽管在起始排列中应用缝隙补偿，在此计算中不应用之。
变异体也可以包括其他具有瘦素样活性的瘦素突变蛋白质。见，如，美国专利号.5,719,266，其内容在此引用以供参考。种类变异体，包括，但不局限于人和鼠瘦素序列(分别见，如2和4号序列)和在Genbank和/或EMBL数据库中所示的核苷酸序列编码的种类变异体，例如，登记号U72873(猩猩)、U96450(Pan troglogytes)、U66254(Sus scrota)、U50365(Bos taurus)、D49653(褐家鼠)、U58492(猕猴)、U72872(大猩猩)、62123(OVIS ARIES)、AF082500(原鸡)、AF082501(Meleagris gallopavo)AB020986(Canisfamiliaris)、AF097582(Equus caballus)，和AF159713(Sminthopsis crassicaudata)，其内容在此引用以供参考。
而且，该瘦素序列可以包括一部分或全部SEQ ID N020中所示的共有序列，其中通过在该ob/ob小鼠中测定，该瘦素具有至少30％，更优选地至少70％，和最好至少90％的成熟全长瘦素的生物活性。从来源于小鼠、大鼠、鸡、人、黑猩猩、母牛、绵羊、低地大猩猩、恒河猴、猪、猩猩和狗的瘦素序列中产生SEQ ID N020的共有序列，例如，该瘦素可以含有部分或全长共有序列Val pro Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr1 5 10 15Ile Val Xaa Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Xaa Ser Val Ser Xaa20 25 30Xaa Gln Xaa Val Xaa Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu Xaa Pro Xaa35 40 45Leu Xaa Leu Ser Xaa Met Asp Gln Thr Leu Ala Xaa Tyr Gln Gln Xaa50 55 60Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asn Xaa Xaa Gln Ile Xaa Xaa Asp Leu65 70 75 80Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Xaa Leu Ala Xaa Ser Lys Ser Cys85 90 95Xaa Leu Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Xaa Xaa100 105 110Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg115 120 125Leu Gln Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Asp Xaa Ser Pro130 135 140Xaa Cys145(SEQ ID NO20)，其中任选地Xaa3可以是Ile或Cys，Xaa4可以是Arg、Trp、Gln或His，Xaa5可以是Lys、Arg或Ile，Xaa6可以是Val或Phe，Xaa19可以是Ala或Thr，Xaa28可以是Gln或肽键，Xaa32可以是Ser或Ala，Xaa33可以是Lys或Arg，Xaa35可以是Arg或Lys，Xaa37可以是Ala或Thr，Xaa46可以是Gln或His，Xaa48可以是Val、Ile或Lys，Xaa50可以是Ser或Thr，Xaa53可以是Arg、Lys或Gln，Xaa60可以是Ile或Val，Xaa64可以是Ile或Val，Xaa66可以是Ash、Thr、Ile或Ala，Xaa67可以是Leu或Met，Xaa68可以是Leu或Met，Xaa69可以是His或Pro，Xaa71可以是Arg或Gln，Xaa73可以是Val或Met，Xaa74可以是Val、Ile或Leu，Xaa77可以是Ser或Ala，Xaa78可以是Ash或His，Xaa89可以是Leu或Val，Xaa92可以是Ser、Phe或Ala，Xaa97可以是Pro、His或Ser，Xaa100可以是arg、Qln、Try或Leu，Xaa101可以是Ala、Val或Thr，Xaa102可以是Arg或Ser，Xaa103可以是Gly或Ala，Xaa105可以是Glu或Gln，Xaa106可以是Thr、Ser或Lys，Xaa107可以是Phe、Leu或Pro，Xaa108可以是Glu或Asp，Xaa111可以是Gly或Asp，Xaa112可以是Gly、Asp或Val，Xaa118可以是Leu或Gly，Xaa131可以是Ala、Gly或Arg，Xaa132可以是Ala或Ser，Xaa136可以是Met或Ile，Xaa138可以是Arg、Trp或Qln，Xaa139可以是Arg或Gln，Xaa142可以是Leu或Val，或Xaa145可以是Gly或Glu。
在优选的实施方案中，该靶蛋白包括全长、成熟瘦素序列。编码和定义人或鼠瘦素蛋白质的该核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ IDNO1-4。
此处所示的靶蛋白表达为伴同免疫球蛋白Fc区的融合蛋白。已知每个免疫球蛋白重链恒定区含有4或5个结构域。该结构域顺序命名如下CH1-铰链区-CH2-CH3(-CH4)。免疫球蛋白种类中重链结构域的DNA序列具有交叉同源性，例如IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域及IgM和IgE的CH3结构域具有同源性。
在此应用的术语“免疫球蛋白Fc区”理解为免疫球蛋白链恒定区，优选免疫球蛋白重链恒定区，或其片段的羧基端部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包括1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或5)两个或更多结构域和免疫球蛋白铰链区的结合体。在优选的实施方案中该免疫球蛋白Fc区至少含有免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选缺少CH1结构域。
IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)是目前优选的衍生该重链恒定区的免疫球蛋白种类。人FCγ-1的核苷酸和氨基酸序列见SEQ IDNOS5和6所示。鼠FCγ-1的核苷酸和氨基酸序列SEQ ID NOS7和8所示。可以应用其他的免疫球蛋白种类，IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。在美国专利号5,541,087和5,726,044中详细讨论了免疫球蛋白重链恒定区的恰当选择。自某些免疫球蛋白种类和亚类中选择特定免疫球蛋白重链恒定区，以获得特定结果(的技术)在本领域技术范围内。编码该免疫球蛋白Fc区的DNA构建体部分优选至少含有部分铰链区，并且优选至少部分Fcγ的CH3结构域或在任何IgA、IgD、IgE和IgM中的同源结构域。
依据该申请，可应用来源除人类以外的其他种类，例如，小鼠和大鼠的恒定区基因。在DNA构建体中作为融合伴侣的免疫球蛋白Fc区一般来自任何哺乳动物种类。为避免在宿主细胞或动物中诱导抗该Fc区的免疫反应，可从相同宿主细胞或动物中获得Fc区。例如，当该宿主动物或细胞是人的话，可用人免疫球蛋白Fc区；同样地，当该宿主动物或细胞是鼠的话，可用小鼠免疫球蛋白Fc区。
用于本发明实践中的编码和定义人或鼠瘦素蛋白质的核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NOS5-8。然而考虑通过由Genbank和/或EMBL基因库的核苷酸序列编码的序列可发现其他用于本发明实践的免疫球蛋白Fc区序列，例如，AF045536.1(Macacafuscicularis)、AF045537.1(恒河猴)、AB016710(猫)、K00752(Oryctolagus cuniculus)、U03780(野猪)、Z48947(双峰驼)、X62916(牛)、L07789(鼬属)、X69797(绵羊属)、U17166(Circetulus migratorius)、X07189(大鼠)、AF57619.1(狐狸)，或AF035195(Mohodephis domestica)，其内容在此处引用以供参考。
而且，考虑在本发明的实践中，在免疫球蛋白的重链不变区氨基酸的替换和缺失可以是有用。一实施例将在上游CH2导入替代氨基酸而产生与Fc受体亲和性降低的Fc变异体(Cole等人.(1997)免疫学杂志(J.IMMUNOL.)1593613)。本领域普通技术人员能应用广知的分子生物学技术制备这些构建体。
应用人Fcγ1作为Fc区序列具有几个好处。例如，如果将该Fc融合蛋白用作生物制药，该Fcγ1结构域可使该融和蛋白具有效应区功能活性。该效应区功能活性包括生物活性例如胎盘转移和血清半衰期延长。该免疫球蛋白Fc区也提供抗-Fc ELISA的检测方法和通过与金黄色葡萄球菌蛋白质A(“蛋白质A”)结合进行纯化的方法。但是，在某些申请中，需要从该免疫球蛋白Fc区删除某些效应区功能，例如Fc受体结合和/或补体固定。
在本发明的融和蛋白中，免疫球蛋白Fc区促进瘦素蛋白质的折叠以产生活性瘦素蛋白质和至少在细胞外基质中使活性基团具有可溶性。因为免疫球蛋白Fc区是亲水性的，不像在细菌宿主中表达的瘦素，含有融和蛋白的瘦素是可溶性的。DiMarchi等人(美国专利号5,719,266)通过将某些氨基酸残基突变为天冬氨酸和谷氨酸提高了瘦素的溶解性，并将瘦素的等电点(PI)由5.84降至5.5。将免疫球蛋白Fc区用作融合伴侣降低了产生pI较低的突变瘦素的需要，因为Fc发生糖基化并在生理PI下高度带电，因此作为溶解瘦素的载体。结果，含有融合蛋白的瘦素在水溶液例如，药用载体中是可溶的。
可理解本发明利用传统重组DNA方法学以产生用于本发明实践的Fc融合蛋白。该Fc融合构建体优选在DNA水平生成，并将产生的DNAs整合至表达载体，并表达以产生本发明的融和蛋白。在此应用的术语“载体”理解为包括能掺入宿主细胞中并重组和整合至宿主细胞基因组中、或作为附加体自我复制的核苷酸序列的任何核酸。这些载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体和类似物。非-限制性病毒载体示例包括逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。在此应用的术语，靶蛋白的“基因表达”或“表达”，理解为DNA序列的转录、该mRNA转录产物的翻译和Fc融合蛋白产物的分泌。
一个有用的表达载体是pdCs(Lo等人.(1988)蛋白质工程11495，其内容在此引用以作参考)，其中Fc-X基因的转录利用人巨细胞病毒增强子/启动子和SV40多聚腺苷酸信号。人巨细胞病毒的该增强子和启动子序列来源于Boshart等人(1985)细胞41521中提供的核苷酸-601至+7的序列，其内容在此引用作为参考。该载体含有作为选择标志的突变的二氢叶酸还原酶基因(Simonsen和Levinson(1983)美国国家科学院院报802495，其内容在此应用作为参考)。
可以用本发明的DNA序列转化或转染适宜的宿主细胞，并进行表达和/或分泌靶蛋白。目前优选用于本发明的宿主细胞包括不死性杂交瘤细胞、NS/O骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HELA细胞和COS细胞。
在哺乳动物细胞中，用于高水平表达融和蛋白的表达系统是在5’-3’方向编码分泌盒和靶蛋白的DNA构建体，该外泌盒包括信号序列和免疫球蛋白Fc区。一些靶蛋白已在该系统中成功表达，包括例如，IL2、CD26、Tat、Rev、OSF-2、βIG-H3、IgE受体、PSMA和gp120。这些表达构建体见Lo等人的美国专利号5,541,087和5,726,044所示，其内容在此引用以供参考。
在此应用的术语“信号序列”理解为指导该瘦素融合蛋白分泌，并且在该宿主细胞中于翻译后断裂的片段。本发明的信号序列编码氨基酸序列的聚核苷酸，该氨基酸序列启动蛋白质通过内质网膜而转运。用于本发明的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如，抗体14.18(Gillies等人(1989)免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)125191)、抗体重链信号序列，例如，MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人(1980)自然2865774)和其他本领域已知的任何序列(见，如Waston(1984)核酸研究(Nucleic Acids Research)125154)。这些在此引用以供参考。
本领域信号序列具有明显特征，已知一般含有16-30个氨基酸残基，并可含有更多或更少的氨基酸残基。一般的信号肽由三个区组成碱性N-端区、中心疏水区和更极性的C-端区。该中心疏水区含有4-12疏水残基，在新生多肽转运时，其将该信号肽锚定贯穿于膜脂质双层上。在启动后，该信号肽一般在内质网腔中由称为信号肽酶的细胞酶断裂。该信号肽的可能切割位点一般遵循“(-3，-1)规则”。这样，典型的信号肽在-1和-3位点具有小的、中性的氨基酸残基并且在此区域缺少脯氨酸。该信号肽酶将在该-1和+1氨基酸之间切割此信号肽。这样，在分泌时可以将该信号肽从该融合蛋白的氨基端断裂。这造成由免疫球蛋白Fc区和靶蛋白组成的Fc融合蛋白的分泌。von Heijine(1986)核酸研究.144683提供详细的信号肽序列，其内容在此引用以作参考。
对本领域技术人员来说，显然需要一些常规的试验(来验证)用于该分泌盒的某些信号序列恰当与否。这些试验将包括测定该信号肽序列指导Fc融合蛋白分泌的能力，以及确定所用序列的合适结构、基因组或cDNA以获得有效分泌量的Fc融和蛋白。另外，本领域技术人员能够按照上面参考的Von Heijne提出的规则产生合成的信号肽，并通过常规实验测试该合成的信号序列的效力。信号序列也可称为“信号肽”、“先导序列”、或“先导肽”。
信号序列和免疫球蛋白Fc区的融合有时在此称为分泌盒。在本发明的实践中有用的示例性分泌盒是以5’到3’方向编码免疫球蛋白轻链基因的信号序列和人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1区的多核苷酸。该免疫球蛋白Fcγ1基因的Fcγ1区优选包括至少部分铰链区和至少CH3结构域，或更优选至少部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域。此处所用的“部分”免疫球蛋白铰链区理解为指含有至少一个，优选两个能够形成链间二硫键的半胱氨酸残基的铰链区的一部分。编码该分泌盒的DNA可以在其基因组结构或其cDNA结构内。某些情况下，自人免疫球蛋白Fcγ2重链序列产生Fc区是有利的。尽管在小鼠中基于人免疫球蛋白γ1和γ2序列的Fc融合物性质类似，基于γ2序列的Fc融合物可在人类中表现出更好的药代动力学(特性)。
另一实施方案中，该DNA序列编码介于分泌盒和靶蛋白之间的蛋白质分解性断裂位点。断裂位点允许所编码融和蛋白发生蛋白分解性的断裂，以便从靶蛋白分离Fc结构域。此处所用的“蛋白质分解性断裂位点”理解为指优先由蛋白酶或其他蛋白分解性断裂剂断裂的氨基酸序列。有用的蛋白分解性断裂位点包括由蛋白酶比如胰酶、纤溶酶原激活物或肠激酶K识别的氨基酸序列。许多断裂位点/断裂剂对是已知的。见如，美国专利第5,726,044号，其内容在此引入供参。
在此处所示的实施例中，产生高水平的Fc-瘦素融和蛋白。最初的克隆产生约50μg/mLFc-瘦素，该Fc-瘦素可便利地通过蛋白质A层析纯化成均质成分。表达水平常常可通过亚克隆提高数倍。另外，可断裂该Fc融和蛋白并进一步例如通过亲和纯化纯化之。如上提及，发现当瘦素作为Fc融合分子表达时，得到高水平的表达，这可能是因为Fc部分作为载体有助于C一端的多肽正确折叠并有效分泌。另外，Fc区发生糖基化并在生理pH下高度带电，因此Fc区可帮助疏水蛋白质溶解。
除表达水平增高外，瘦素融和蛋白比瘦素本身表现出更长的血清半衰期，这部分由于其分子体积增大所致。例如，鼠Fc-鼠瘦素在小鼠中的循环半衰期是8.8小时，而鼠瘦素是18分钟(见如下面的实施例14)。分子量约为16kD的瘦素很小，可通过肾脏滤过有效地清除。相反，由于有两个瘦素基团分别连到免疫球蛋白Fc区，Fc-瘦素融和蛋白的分子量约为90kD，其中该Fc区以共价键彼此连接。此嵌合结构应与瘦素受体具有更高的结合亲和力，其序列表明其包括两个配基结合结构域(Tartaglia等人(1995)细胞(CELL)831263)。由于瘦素活性似乎是由受体介导的，瘦素融和蛋白比瘦素本身将具有更强的效力。
而且，已知许多蛋白质配体与其受体以二聚体的形式结合。如果瘦素属于二聚体蛋白质配体一类，该免疫球蛋白Fc区给予瘦素的物理约束将使二聚体化变为细胞内过程，因此使其平衡向有利于二聚体(的方向)转化并且提高其与受体的结合。应用标准的重组DNA技术，在适宜的位点也能将半胱氨酸残基插入该单体以稳定通过共价二硫键连接的该二聚体。
本发明的融合蛋白具有几项重要的临床价值。如在ob/ob小鼠模型中所证实的，与5-20mg/kg/day由细菌产生的瘦素(Pelleymounter等人.(1995)科学269540；Hallas等人(1995)科学269543；Chebab等人(1996)自然遗传学12318；Mounzih等人.(1997)内分泌学(Endocrinology)1381190)相比，腹腔内或皮下注射0.1mg/kg/day鼠Fc-鼠瘦素形式的鼠瘦素足以使体重下降同等程度。如果采用0.25mg/kg的剂量，注射的次数可减为一星期3次。而且ob/ob小鼠如果每日注射0.25mg/kg的鼠Fc-鼠瘦素达4个月以上，仍对该治疗反应良好，而未发现副作用。实际上这些小鼠都很健康，食欲降低，产热和运动能力增加。依据这些结果，构建本发明Fc-瘦素多种构型的能力提供可表明比天然抗-肥胖蛋白质效力更高的分子。
通过注射连续5天给予起始体重至少为50克的ob/ob小鼠约0.25mg/kg/day剂量的本发明融合蛋白，比起始体重降低大约10％(大约5克)、更优选地大约12％(大约6克)或甚至更优选地大约15％(大约7.5克)。更优选地，通过注射给予起始体重至少50克的ob/ob小鼠本发明的该融合蛋白0.1mg/kg/day 5天后，比起始体重降低大约10％(大约5克)、更优选地大约12％(大约6克)或甚至更优选地大约15％(大约7.5克)。此剂量优选导致体重10-20％的下降。
本发明其它的少数方案提供具有多种构型的构建体，例如，二价或多价构建体、二聚或多聚构建体，及其组合。本发明的分子这些功能构型使得瘦素和其它抗-肥胖蛋白质的协同效应可应用于动物模型中。
本发明还提供制备非-人类瘦素的方法，如Fc融合蛋白。非-人类瘦素蛋白质对于瘦素的前临床研究是有用的，因为在人类中进行实验以前，必须在动物模型系统中进行蛋白质药物的有效性和毒性研究。在某些情况下，因为人类蛋白质可引发免疫反应和/或表现不同的药物动力学而使实验结果出现偏差，该蛋白质在小鼠模型中可能不起作用。因此，在某些情况下，等价小鼠蛋白质可作为该人类蛋白质更好的代用品而用于在小鼠模型中的实验。
本发明提供通过给予具有该类疾病的哺乳动物该本发明之DNA、RNA或蛋白质治疗肥胖和相关疾病及其病因的方法。相关疾病可包括，但不限于，糖尿病、高血压、心脏疾病、肿瘤和相关疾患。根据瘦素在调整神经内分泌反应方面发挥的多种作用(Freidman和Halaas(1998)自然395763)，本发明也提供治疗该疾病的方法，通过给予瘦素缓解该疾病。这些方法包括给予患有该疾病的哺乳动物本发明的有效剂量的成分，这些疾病与肥胖可直接或非直接相关。
本发明的蛋白质不仅用作治疗制剂，本领域技术人员认识到该蛋白质在制备诊断用途的抗体方面的用途。而且，在本发明中所用的方法包括该DNA或RNA的适宜给予，例如，在载体中或用于该用途的其他转运系统中。再者，在哺乳动物中，本发明的构建体对于为美容控制体重是有用的。美容的目的是寻求控制哺乳动物的体重以改善身体的外观。该哺乳动物毋须肥胖。这些美容用途是本发明的一部分。还有，应用来源其他哺乳动物的Fc-瘦素例如，牛和猪，用于饲养肉食用途的瘦肉型动物。
尚不知该Fc-瘦素融合蛋白是否能通过该血-脑屏障到达在下丘脑中的受体。如果该Fc-瘦素融合蛋白不通过血脑屏障，其作为抗-肥胖试剂的高度功效提示新的反应机制或在大脑外具有瘦素受体。作为具有免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，尤其根据其长血清半衰期和可给予的大剂量的该可溶性蛋白质，Fc-瘦素融合蛋白可具有非常有利的组织分布和稍稍不同的作用模式以达到临床效力甚至克服瘦素抵抗。在小鼠中皮下注射的数据提示在人类中肌内注射同样有效。也可需要将Fc-瘦素融合蛋白作为鼻用喷雾剂、吸入制剂、皮肤贴剂或滴眼液来应用。如果以吸入制剂的方式给予Fc-瘦素融合蛋白，制备该融合蛋白以将其聚合成可以通过转细胞作用而通过肺脏上皮的小颗粒。
也可以将本发明的DNA构建体(或基因构建体)用作基因治疗的部分方法，来转运编码瘦素或其融合蛋白构建体的核酸。本发明的特点为用于体内转染的表达载体和在某些细胞类型中瘦素及其融合蛋白构建体的表达以便重构或补充瘦素的功能。可以在任何生物效应载体中，例如，能在体内将该瘦素基因或其融合蛋白构建体高效转运至细胞的任何制剂和组分，给予瘦素或其融合蛋白构建体的表达构建体。方法包括在病毒载体中插入该受试基因，病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒-1，或重组细菌或真核质粒。
考虑通过任何适宜的方式，直接(例如，局部，如通过注射、植入或向组织局部给药)或全身(例如，肠胃外或口服)地将本发明的组合物提供给动物。肠胃外提供该组合物时，例如通过静脉、皮下、眼、腹腔内、肌内、口腔、直肠、阴道、眶内、脑内、颅内、脊内、心室内、鞘内、池内、囊内、鼻内或喷雾给药，该组合物优选含有部分水的或生理相容性液体悬浮液或溶液。这样，该载体或溶媒为生理可接受的，从而除了向患者转运该所需组合物外，其并不会对患者的电解质和/或容量平衡产生负面影响。因此该试剂的液体介质可含有正常生理盐水。
每次给予本发明的融合蛋白的优选剂量范围是50ng/m2到1g/m2，更优选5μg/m2到200mg/m2，最优选100μg/m2到10mg/m2。每次给予编码本发明融合蛋白的核酸的优选剂量范围是1μg/m2到100mg/m2，更优选20μg/m2到10mg/m2，最优选400μg/m2到4mg/m2。然而考虑通过本领域技术水平内常规的实验可确定最佳给药路径和剂量。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例实施例1.鼠Fc-鼠瘦素的表达自正常的C57/BL6小鼠的脂肪细胞制备mRNA样品，用逆转录酶将该mRNA进行逆转录。用产生的cDNA作为模板进行聚合酶链反应(PCR)以克隆和衔接鼠瘦素cDNA，表达鼠Fc-鼠瘦素融合蛋白。正向引物是5’C CCG GGT AAA GTG CCT ATC CAG AAA GTC C(SEQ IDNO9)，其中TAAA之前的序列CCC编码(XmaI限制位点)免疫球蛋白重链的羧基端。黑体序列编码鼠瘦素的N-端。反向引物是5’CTCGAG TCA GCA TTC AGG GCT AAC ATC(SEQ ID NO10)，其编码瘦素C-端序列并含有翻译终止密码子(反密码子，TCA)，随后是XhoI位点(CTCGAG)。产生的450碱基对的PCR产物得以克隆和测序。序列分析证明该产物编码适于表达的成熟的鼠瘦素，即其5’端具有XmaI位点，3’端具有XhoI位点。
如下构建表达载体pdCs-鼠Fc-鼠瘦素。然后根据Lo等人(蛋白质工程(1998)11495)(所述)，将含有鼠瘦素cDNA的XmaI-XhoI限制性片段与pdCs-鼠Fc载体的XmaI-XhoI片段相连接。鼠Fc是鼠免疫球蛋白γ2a的鼠Fc片段。产生的载体pdCs-鼠Fc-鼠瘦素用来转染哺乳细胞以便表达鼠Fc-鼠瘦素。实施例2.转染和蛋白质的表达若进行瞬间转染，通过用磷酸钙进行质粒DNA的共沉淀(Sambrook等人(1989)“分子克隆-实验室手册”冷泉港，纽约)或按照厂家说明用Lipofectamine Plus(生命科技，Gaithersburg，MD)将质粒导入人肾293细胞中。
为得到稳定转染的克隆，通过电穿孔法将质粒DNA导入小鼠骨髓瘤NS/O细胞NEI。在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养NS/O细胞。取约5×106个细胞用PBS洗一次，重悬于0.5mlPBS中。然后使10μg线性质粒DNA与该细胞在基因脉冲槽(0.4cm电极槽，BioRad)中冰上孵育10分钟。以0.25V和500μF的设置用基因脉冲(BioRad，Hercules，CA)进行电穿孔。使细胞冰上恢复10分钟，然后重悬于生长培养基中，再种入两个96孔板。通过在含有100nM氨甲喋呤(MTX)的培养基中的生长状况来筛选稳定转染的克隆(MTX在转染后两天加入)。每3天加入2-3次，2-3周后出现MTX抗性克隆。用抗Fc ELISA分析克隆上清以便鉴别高产量者。分离高产克隆，在含100nM MTX的生长培养基中扩增之。
为常规鉴别电穿孔(所得融合蛋白)，在蛋白质A琼脂糖上(Repl igen，剑桥，MA)俘获条件培养基中的Fc-融合蛋白，然后通过在含有或没有2-巯基乙醇的蛋白质样品缓冲液中煮沸使之洗脱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级后，考马斯亮蓝染色观察蛋白带。鼠Fc-鼠瘦素经SDS-PAGE具有约50kD的分子量。
为进行纯化，使融合蛋白结合到蛋白质A琼脂糖上，随即在磷酸钠缓冲液中(100mM NaH2PO4，pH3，和150mM NaCl)洗脱。然后立即用0.1倍体积的2M Tris-盐酸，pH 8中和洗脱液。实施例3.ELISA步骤ELISA用来确定MTX-抗性克隆和其他测试样品的上清中蛋白质产物的浓度。分别用抗人Fc ELISA和抗鼠Fc ELISA确定含有人Fc和鼠Fc的蛋白质的数量。抗人Fc ELISA详述如下A包被平板用溶于PBS的5μg/ml的亲和纯化的山羊抗人IgG(H＋L)(Jackson免疫研究实验室，West Grove，PA)包被ELISA 96孔板(Nunc-Immunoplate，Maxisorp)，100μl/孔。盖上包被板，4℃孵育过夜。然后用含0.05％吐温(吐温20)的PBS洗板4次，并用含1％BSA/1％山羊血清的PBS封闭，200μl/孔。37℃用封闭缓冲液温育两小时后，用含0.05％吐温的PBS洗板4次，在纸巾上吸干。B与测试样品和二级抗体温育用含1％BSA/1％山羊血清/0.05％吐温的PBS样品缓冲液将测试样品稀释到合适的浓度。应用已知浓度的嵌合抗体(含人Fc)制备标准曲线。制备标准曲线的样品缓冲液中的系列稀释度范围是125ng/ml至3.9ng/ml。将稀释的样品和标准品加到板内，100μl/孔，在37℃温育2小时。温育后，用含0.05％吐温的PBS洗板8次。然后每孔加入100μl二级抗体，辣根过氧化酶-偶联的抗人IgG(Jackson免疫研究)，该抗体用样品缓冲液稀释约12,000倍。针对每批HRP标记的抗人IgG，应确定确切的二级抗体的稀释度。37℃温育2小时后，用含0.05％吐温的PBS洗板8次。C显色以100μl/孔加入底物溶液。该底物溶液的制备方法是将30mgOPD(邻苯二胺二盐酸盐；一片)溶于15ml含0.03％新加入的H2O2的0.025M柠檬酸/0.05M Na2HPO4缓冲液(pH5)中。室温避光显色30分钟。显色时间视包被板、二级抗体等批间差异而变。观察标准曲线中的颜色变化，以确定何时终止反应。通过加入4N H2SO4，100μl/孔终止反应。用酶标仪读板，波长设置为490nm和650nm，使OD490nm减去背景OD650nm。
抗鼠Fc ELISA步骤与前类似，只是该ELISA板用5μg/ml(PBS中)的亲和纯化的山羊抗鼠IgG(南方生物公司，伯明翰，AL)，稀释度为5000。实施例4.人Fc-人瘦素的表达人脂肪细胞快速克隆cDNA(CLOTECH，PALO ALTO，CA)用作摸班进行PCR以便克隆和衔接人瘦素cDNA，表达人Fc-人瘦素融和蛋白。正向引物是5’C CCG GG T AAA GTG CCC ATC CAA AAA GTC CA(SEQ ID NO11)，其中序列C CCG GGT AAA(SEQ ID NO12)编码免疫球蛋白重链的羧基端，然后是编码成熟的瘦素N-端的序列(黑体)。C CCG GG序列是通过沉默突变导入的XMAI限制性位点(Lo等人(1998)蛋白质工程11495)。反向引物是5’CTC GAG TCA GCACCC AGG GCT GAG GTC(SEQ ID NO13)，编码瘦素羧基端的反义序列，并含有翻译终止密码子(反密码子TCA)然后是XhoI位点(CTCGAG)。产生的450碱基对PCR产物得以克隆和测序。序列分析证实该产物编码适于表达的成熟的人瘦素，即其5’端含有XmaI位点，3’端含有XhoI位点。
如下构建表达载体，pdCs-人Fc-人瘦素。根据Lo等人(蛋白质工程(1998)11495)使含人瘦素cDNA的XmaI-XhoI限制性片段与pdCs-人Fc载体的XmaI-XhoI片段相连接。人Fc是人免疫球蛋白γ1的人Fc片段。产生的载体，pdCs-人Fc-人瘦素用于转染哺乳类细胞以便表达人Fc-人瘦素。实施例5鼠瘦素、鼠-Fc和瘦素-甘氨酸-丝氨酸连接物-鼠-Fc表达载体的构建通过PCR使鼠瘦素cDNA衔接以便作为鼠瘦素-鼠Fc融合蛋白进行表达。正向引物5’C TTA AGC GTG CCT ATC CAG AAA GTC CA(SEQID NO14)导入AflII(CTTAAG)位点以便连接编码成熟鼠瘦素N端的序列(黑体序列)，和编码信号肽的DNA。反向引物，3’GAT ATCGCA TTC AGG GCT AAC ATC(SEQ ID NO15)导入EcoRV位点，该位点位于编码鼠瘦素羧基端而不含终止密码子(黑体反义序列)的序列的立即下游区。如下提及，EcoRV位点是鼠瘦素与鼠Fc进行框内融合的连接物-衔接子。产生的450碱基对的PCR产物得以克隆并全部测序。然后用编码成熟的鼠瘦素的AflII-EcoRV片段来构建pdCs-鼠瘦素-鼠Fc表达载体。
将编码成熟鼠瘦素的AflII-EcoRV片段与编码免疫球蛋白轻链信号肽的XbaI-AflII片段(Lo等人(1998)蛋白质工程11495)的连接产物进行亚克隆。产生的XbaI-EcoRV片段编码信号肽，其后是成熟的鼠瘦素，没有终止密码子。
为使EcoRV位点与鼠FcDNA的5’端衔接，将编码鼠Fc的AflII-XhoI片段(Lo等人)与下列连接物-衔接子的连接产物亚克隆至EcoRI-XhoI克隆载体。EcoRI粘端5’AATTC GAT ATC(SEQ ID NO16)3’G CTA TAG AATT(SEQ ID NO17)AflII粘端上述连接物-衔接子含有EcoRI和AflII粘端，也含有EcoRV位点(GATATC)。亚克隆后，分离含有终止密码子的编码鼠Fc片段的EcoRV-XhoI片段。然后使该片段与编码信号肽和成熟的鼠瘦素的XbaI-EcoRV片段(如上所述)和XbaI-XhoI酶切的pdCs载体片段连接起来。产生的表达质粒用来转染哺乳细胞，该质粒称为pdCs-鼠瘦素-鼠Fc。
为构建pdCs-鼠瘦素-甘氨酸-丝氨酸-连接物-鼠Fc，在唯一的EcoRV位点使pdCs-鼠瘦素-鼠Fc DNA变成线性，通过连接插入下列未磷酸化的连接物5’GGC GCA GGA GGT TCT GGC GGA TCC 3’ (SEQ ID NO18)3’CCG CGT CCT CCA AGA CCG CCT AGG 5’ (SEQ ID NO19)正确的构建通过DNA测序得以证实，以确保正确的连接序列已按照合适的方向插入。产生的载体，pdCs-鼠瘦素-甘氨酸-丝氨酸-连接物-鼠Fc用来转染哺乳细胞。实施例6.鼠瘦素-鼠Fc和鼠瘦素-甘氨酸-丝氨酸-连接物-鼠Fc的表达水平降低由于瘦素C端半胱氨酸残基可与半胱氨酸-117形成分子内二硫键，若将瘦素制成瘦素-Fc融和蛋白的话，会在蛋白质折叠和随后的分泌方面产生问题。为验证这是否属实，如实施例5所述构建鼠瘦素-鼠Fc和鼠瘦素-甘氨酸-丝氨酸-连接物-鼠Fc表达载体。后一构建体表达位于瘦素和Fc之间的富甘氨酸和丝氨酸残基的弹性连接物，以便使瘦素更易于形成二硫键并正确折叠。用抗-鼠Fc ELISA分析293细胞中的瞬间表达，用抗-鼠Fc抗体(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，Fcγ，购自Jackson免疫研究)和抗鼠瘦素抗体(生物素化的抗小鼠瘦素多抗，购自R&D系统Minneapolis，MN)。每一构建体上清中检测到的表达水平很低。对全部细胞裂解物进行分析发现，多数鼠瘦素-鼠Fc和鼠瘦素-甘氨酸-丝氨酸-连接物-鼠Fc存留于细胞内。同样分离稳定的NS/0克隆。鼠瘦素-鼠Fc有或无连接物的表达水平最多约是鼠Fc-鼠瘦素的10％。
还有，随后的研究表明瘦素-Fc融合蛋白在体内不如Fc-瘦素融合蛋白活性高(见图6)。以0.25mg/kg/天腹腔内注射瘦素-Fc给ob/ob小鼠时，未发现明显的体重下降。令人惊讶的是Fc-瘦素比瘦素-Fc更有效，因为这些融合蛋白含有同样的基因，只是每一肽链中基团的顺序有差别而已。实施例7.通过腹腔内(IP)注射鼠Fc-鼠瘦素来治疗ob/ob小鼠5-到6周龄的C57 BL/6Job/obIJ小鼠购自JacksonLaboratories，Barr Harbor，ME，该小鼠为肥胖基因突变的纯合子(ob/ob小鼠)。每组两只小鼠接受鼠Fc-鼠瘦素或仅PBS。鼠Fc-鼠瘦素溶于PBS，每天腹腔内给药(前12天每天；随后仅周一至周五给药)。所注射的瘦素量调整到0.25mg瘦素每kg小鼠体重。对照组仅给予PBS。所有小鼠可自由进食和喝水，每天在注射前测量体重。
经过4个月，对照组(图3中的方块)体重持续增加了40％(从50g到70g)。每天腹腔内注射鼠Fc-鼠瘦素的组别经过头一个月体重下降了45％(从50.5g到28g)，然后体重稳定在约27-31g(图3中菱形)。由于周末未接受治疗，其体重到周一时增加到超过30g，但每天治疗使体重到周五时稳定下降到约27-28g。如图3所示，经过4个月鼠Fc-鼠瘦素是有效的。
注意在治疗的头两周，食物的摄入在检测限以下。3到4周后，当体重减到约30g且脂肪组织明显减少时，小鼠的食物消耗量平均为每只小鼠每天大约3g。这与Mounzih等人(Mounzih等人(1997)内分泌学1381190)的结果一致，该结果表明接受20mg/kg瘦素治疗的ob/ob小鼠的食物消耗量在第45天恢复到约2.6-3.2g。实施例8.通过皮下(SC)注射鼠Fc-鼠瘦素来治疗ob/ob小鼠皮下注射鼠Fc-鼠瘦素与腹腔内注射一样可有效减少ob/ob小鼠的体重。5到6周龄的ob/ob小鼠(每组3只)每天皮下注射鼠Fc-鼠瘦素(仅周一到周五)。所注射的瘦素的量调整到0.25或0.1mg瘦素每kg小鼠体重。所有小鼠可自由摄入食物和水分，每天在注射前测量体重。17天后，接受0.1和0.25mg瘦素/kg的小鼠体重分别下降了14％和22％，而接受PBS的对照小鼠体重增加了15％。与接受同等剂量的IP注射的小鼠相似，接受SC注射的小鼠的食物摄入量下降。实施例9.通过静脉内(IV)注射鼠Fc-鼠瘦素治疗ob/ob小鼠发现静脉内(IV)注射鼠Fc-鼠瘦素同样可有效降低ob/ob小鼠的体重。按照每kg0.25或1mg瘦素的剂量每天IV注射鼠Fc-鼠瘦素或PBS来治疗ob/ob小鼠(每组两只)。使所有小鼠自由摄入食物和水分，每天注射前测量体重。5天后停止治疗，但每天继续记录体重。如图4所示，作为鼠Fc-鼠瘦素以0.25mg和1mg/kg(分别是三角形和圆形)瘦素的剂量进行治疗时，分别导致体重继续下降48和72小时。这些结果表明鼠Fc-鼠瘦素比鼠瘦素的循环半衰期长得多，因为为降低体重需要经常且高剂量地给予瘦素。实施例10.每周3次或每4天一次用鼠Fc-鼠瘦素治疗ob/ob小鼠图5表示不同剂量日程对ob/ob小鼠体重的影响。具体地，一组3只ob/ob小鼠(实心菱形)每天从周一到周五直至A点通过SC注射鼠Fc-鼠瘦素接受0.25mg/kg鼠瘦素；从A点到B点注射次数降至仅周一和周五；然后数提高到每周3次(周一、周三和周五)。也由3只ob/ob小鼠组成的另一组(方块)每天从周一到周五直至C点通过SC注射鼠Fc-鼠瘦素接受0.1mg/kg鼠瘦素；从C点到D点注射次数降至每周3次(周一、周三和周五)；但在D点后将剂量提高到1mg/kg，每4天一次。对照的3只ob/ob小鼠(三角)每天从周一到周五接受PBS。使所有小鼠自由摄入食物和水分，每天注射前测量体重。
如图5所示，每周3次(周一、周三和周五)SC注射0.25mg/kg鼠Fc-鼠瘦素可有效地使体重维持在约36-39g超过9周，每4天SC注射一次1mg/kg在4周内使体重从51g降低到34g，其后稳定于30-33g。每周3次给予0.1mg/kg不能降低体重。这些结果表明，考虑到以合适剂量注射鼠Fc-鼠瘦素时其持续效应很长，无需每天注射。实施例11.用鼠Fc-鼠瘦素治疗消瘦小鼠和db/db小鼠为与ob/ob小鼠比较，向正常的C57BL/6J、C57BL/KS和Balb/C小鼠和糖尿病C57BL/KSdb/db小鼠(均购自Jackson实验室，BarrHarbor，ME)每天(周一到周五)腹腔内或皮下注射溶于PBS的鼠Fc-鼠瘦素。所注射的瘦素量调整到每kg小鼠体重0.25mg或1mg瘦素。如表1所示，两种剂量水平的鼠Fc-鼠瘦素对缺乏瘦素受体的db/db小鼠没有影响。就正常的C57BL/6J、C57BL/KS和Balb/C小鼠而言，低剂量(鼠Fc-鼠瘦素)效应适中。而不论小鼠年龄如何，高剂量可在19天内使体重明显下降(表1)。
表1每天(周一到周五)腹腔内(IP)或皮下(SC)注射0、0.25或1mg/kg鼠Fc-鼠瘦素治疗小鼠(每组3只)19天所致体重变化的百分比。
路径年龄溶媒 0.25mg/kg 1mg/kgob/ob IP2月龄+14.7-23.3 -17.4**db/db SC2月龄+7.21+6.78 +5.01db/db IP5月龄+1.82+5.66 +5.28C57BL/6J IP5月龄+1.03-1.69 -13.9C57BL/KS IP5月龄+0.22-0.13 -16.9Balb/CIP2月龄+9.18-5.4 -9.19**5天后停止用1mg/kg治疗ob/ob小鼠，因为发现0.25mg/kg的低剂量也同样有效。实施例12.腹腔内(IP)注射人Fc-人瘦素治疗ob/ob小鼠IP而非SC给予人Fc-人瘦素可减少小鼠的免疫原性。通过每天IP注射(头17天，然后仅从周一到周五)人Fc-人瘦素使一ob/ob小鼠接受0.1mg/kg人瘦素。另一ob/ob小鼠每天(头17天，然后仅从周一到周五)接受0.5mg/kg的较高剂量直至第33天，然后注射次数减至每周3次(周一、周三和周五)。对照组每天(头17天，然后仅从周一到周五)接受PBS。所有小鼠可自由摄入食物和水分，每天在注射前测量体重。
图6表明人Fc-人瘦素与鼠Fc-鼠瘦素一样可有效减少ob/ob小鼠的体重。另一组两个较大龄的ob/ob小鼠每天(头10天，然后仅周一至周五)接受0.25mg/kg的中间剂量。其体重在23天内从65g下降到31g(-51.4％)，然后其体重浮动在约31g(周一)到约26g(周五)之间(数据未列)。值得注意的是，经过近两个月的治疗后，人Fc-人瘦素仍保持其效力而似乎没有受到可能产生的抗人类蛋白质的任何免疫反应的负面影响。
用更大(数目)的小鼠组别重复该实验(n＝8)。另外，ob/ob小鼠已用Fc-瘦素治疗了15个多月，结果这些小鼠的体重保持在20-30g之间。在此期间，这些小鼠未出现明显的负反应。
其他实验也表明，每天通过腹腔内注射皮下注射和静脉内注射来给予Fc-瘦素都产生类似的效果。这样，衡量Fc-瘦素在ob/ob小鼠体内的活性时，给药路径看起来并不重要。实施例13.通过腹腔内(IP)注射鼠Fc-鼠瘦素来治疗ob/ob小鼠的不育症每天给ob/ob雌鼠和ob/ob雄鼠IP注射0.25mg/kg鼠Fc-鼠瘦素。每只雄鼠起初与一只ob/ob雌鼠和正常C57BL/6J雌鼠同居。当体重显著增加从而提示怀孕时，隔离孕鼠。约2-4周的治疗后，所有六个ob/ob雄鼠的生育缺陷得以矫正并使正常和/或ob/ob小鼠怀孕。所有正常的C57BL/6J母鼠正常生产并哺育其幼崽。六个怀孕的ob/ob雌鼠中有四个正常生产，产生同种的ob/ob小鼠。然而，由于ob/ob母鼠不能正常哺乳，没有一个幼崽活过一天。实施例1 4.药代动力学比较了鼠Fc-鼠瘦素和鼠瘦素(R&D系统，Minneapolis，MN)的药代动力学。Ob/ob小鼠(每组6只)通过尾静脉注射。将所注射的瘦素量调整到1mg每kg小鼠体重。注射后立即通过眼眶后滴血来取血，并在注射后0.1、0.5、1、2、4、8、24、48小时取血。在含肝素的管子中收集血样以防血凝。通过在Effendorf高速微离心机离心4分钟去除细胞。应用小鼠瘦素免疫分析试剂盒(R&D系统，Minneapolis，MN)测量血浆中小鼠瘦素的浓度。测得鼠Fc-鼠瘦素和鼠瘦素的循环半衰期分别为8.8小时和18分钟。
同样，发现人Fc-人瘦素在小鼠中的循环半衰期超过10小时。实施例1 5.人Fc(N→Q突变)-人瘦素的构建为检测免疫球蛋白Fc区N-连接的糖基化是否影响人Fc-人瘦素的血清半衰期，产生重组的人Fc-人瘦素突变体，其中Fc区糖基化位点的天冬酰胺残基突变成谷氨酰胺。简而言之，通过应用正向引物5’GAG CAG TAC CAA AGT ACG TAC CGT GTG GTC AGC(SEQ ID NO16)和反向引物5’ACG GTA CGT ACT TTG GTA CTG CTC CTC CCG CG(SEQID NO17)的PCR使人Fc-人瘦素DNA中编码唯一的N-糖基化位点(Asn-Ser-Thr)发生突变。该引物所编码的序列使Asn-Ser-Thr变为Gln(CAA)-Ser-Thr，后者不再是N-糖基化位点。另外，该引物通过沉默突变导入SnaBI位点(TACGTA)以便筛选Asn到Gln(N到Q)的突变体。PCR突变后，通过DNA测序证实含N到Q替代体的SacII-SmaI片段，并用该片段替代pdCs-人Fc-人瘦素中的相应片段，产生pdCs-人Fc(N→Q)-人瘦素。
如实施例2所述将pdCs-人Fc(N→Q)-人瘦素表达质粒转染到哺乳细胞内。然后按照实施例14所述对纯化的人Fc(N→Q)-人瘦素蛋白质作药代动力学研究。为直接比较，将同样数量的人Fc-人瘦素(1mg瘦素/kg)或人Fc(N→Q)-人瘦素(1mg瘦素/kg)平行注射到小鼠内。通过实施例3所述的抗-人Fc ELISA测量小鼠血清中人Fc(N→Q)-人瘦素和人Fc-人瘦素的浓度。图7所示结果表明人Fc-人瘦素(菱形)比人Fc(N→Q)-人瘦素(方形)的半衰期要长。
等价物本发明也包括其他不偏离其精神和基本特点的具体形式。因此应认为上述实施方案是各方面的示例而此处所述的发明并不限于此。这样本发明范围由附录的权利要求而非上述说明书来体现，这样包含在与权利要求等价的意义与范围内的所有变化都包括在内。

1.编码融和蛋白的核酸，其中该融和蛋白包括(a)信号系列；(b)免疫球蛋白Fc区；和(c)包括瘦素的靶蛋白序列。
2.权利要求1的核酸，其中所述信号序列、免疫球蛋白Fc区和靶蛋白序列以5’到3’方向顺序编码。
3.权利要求1的核酸，其中所述信号序列、靶蛋白序列和免疫球蛋白Fc区以5’到3’