专利名称：螺旋藻多糖免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗的制作方法图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化； 图2为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价；图3为不同接种组在接种后7天内的体重增长情况； 图4为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价。下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。 实施例1纳米乳剂载体的制备1)按下列质量比备料3g注射用水，3g注射用大豆油，2g聚乙二醇400，1.2g Tween80,0. 8g Span80 ；2)向混合搅拌瓶内加入1.2g Tween80,0. 8g Span80，及2g聚乙二醇400，在转速为200 转/分钟，室温条件下，持续搅拌1 10分钟，混勻后加入3g注射用大豆油，混合均勻得混 合物；3)在上述2)的混合物中滴入3g注射用水，同时在转速为200转/分钟，室温下，搅拌 混合物至液体为透明，得到纳米乳剂；4)对3)制得的纳米乳剂进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为 28. 985 56. 493nm,合格；2.经3000rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格； 3.经4°C放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例21)称取市购的螺旋藻多糖10mg，溶于ΙΟΟΟμΙ无水乙醇中，制成螺旋藻多糖溶液，备用；2)将上述1)制备的螺旋藻多糖溶液与1075μ1市购的Η3Ν2流感病毒裂解疫苗(血凝 素含量为43. 67Pg/ml)混合，然后再向其混合物中加入925μ1生理盐水，得总体积为3000μ1 的含螺旋藻多糖的流感疫苗，备用；3)称取3g注射用大豆油，2g聚乙二醇400，1.2g Tween80,0. 8g Span80于搅拌瓶 中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌1 10分钟，至充分混勻，得混合溶液；4)在上述3)的混合溶液中缓慢滴入2)的含螺旋藻多糖的流感疫苗3000μ1，同时维持 转速在200转/分钟，搅拌至呈淡红棕色的透明溶液，得到以螺旋藻多糖、纳米乳剂为佐剂 的流感病毒疫苗。其中螺旋藻多糖的质量比为0. 143%，载体质量比为99. 857% ；螺旋藻多 糖纳米佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为149467。用实施例2制备的螺旋藻多糖纳米乳剂流感病毒疫苗肌肉注射标准体重昆明种 雌性小鼠，每只小鼠200μ1。此200μ1注射疫苗中流感疫苗血凝素含量为0. 94gg，螺旋藻多 糖0. 2mgo同时设立注射等量的生理盐水空白对照组、等血凝素含量的Al (OH)3佐剂流感疫 苗的佐剂对照组、等血凝素含量的单独流感疫苗对照组。间隔3周，免疫2次。于首次免疫 后第一周开始，每隔7天采尾血，分离血清测定血凝抑制抗体效价。所测结果显示藻多糖纳 米乳剂型佐剂疫苗组血凝抑制抗体效价水平整体明显高于铝佐剂组及单独疫苗组，具体结 果见附图1。实施例31)称取市购的螺旋藻多糖7.6mg，溶于400μ1无水乙醇中，得螺旋藻多糖溶液，备用；2)将1)的螺旋藻多糖溶液与3.4ml市购的H3N2流感病毒裂解疫苗(血凝素含量 43. 67μδ/πι1)混合，得3. 8ml含螺旋藻多糖的流感疫苗；3)取1.Ig聚氧乙烯蓖麻油，1.6g Span80, 6g 1，2-丙二醇，3g肉豆蔻酸异丙酯放于 搅拌瓶中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌10分钟，至充分混勻，得混合溶液；4)在上述3)的混合溶液中缓慢滴入2)制备的含螺旋藻多糖的流感疫苗3.8ml,同时 维持转速在200转/分钟，搅拌至溶液为淡黄色透明，得到以螺旋藻多糖、纳米乳剂载体为 佐剂的流感病毒疫苗，其中螺旋藻多糖的质量比为0. 065%，载体质量比为99. 935% ；螺旋 藻多糖纳米乳剂与流感疫苗血凝素的质量比为78850。
实施例41)制备下列不同的佐剂或溶液a)取市购的螺旋藻多糖0. 2 mg，溶于30ul无水乙醇，然后与ΙΙΟμΙ生理盐水混合， 得140ul螺旋藻多糖溶液，备用；b)取浓度为15. 98 mg/ml的氢氧化铝12. 5 μ ，其中含AL(OH)3 0. 2mg，加入生理盐水 至体积为140 μ ，备用；c)140 μ 生理盐水，备用；d)200 μ 生理盐水，备用；2)制备下列不同的疫苗取血凝素含量为43. 67 μδ/πι1的市购Η3Ν2流感病毒裂解疫苗60μ1，分别和上述a、b、 c不同溶液混合，分别得到含有螺旋藻多糖免疫佐剂的流感疫苗样品A、含有AL(OH)3佐剂的流感疫苗样品B、单独的流感疫苗样品C、不加疫苗仅为生理盐水的空白对照样品D。所配 置的上述A、B、C、D四个样品均制备五份，体积均为200 μ ，备用；其中含有螺旋藻多糖的流 感疫苗样品A中螺旋藻多糖质量比为100%，载体质量比为0 % ；螺旋藻多糖免疫佐剂与流 感疫苗血凝素的质量比为76; 3)免疫接种及检测用上述2)所配的Α、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雌性昆明小鼠，每组5 只，每只肌肉注射200μ1，间隔3周，免疫2次。于加免后2周取尾血，分离血清测定血凝抑 制效价，所测结果显示螺旋藻多糖佐剂组血凝抑制抗体效价水平明显高于铝佐剂组及单独 疫苗组，具体结果见附图2。并于第一天接种前和接种后第8天对各组小鼠进行体重测量， 对7天内各组平均增长的体重进行计算，所测结果显示藻多糖佐剂组较之铝佐剂组及单独 疫苗组小鼠体重增长受影响最低，并与空白对照组相比，小鼠体重增长幅度反而较大，可能 是由于螺旋藻多糖本身具有一定的补益作用，具体结果见附图3。
实施例5Α、取市购的螺旋藻多糖0. 3 mg，溶于40μ1无水乙醇，再与130μ1生理盐水混合，然后加 入市购的Η3Ν2流感裂解疫苗30μ1至终体积为200 μ ，含Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量 为1.3lPg，得含有螺旋藻多糖的流感病毒疫苗，备用；其中螺旋藻多糖的质量比为100%， 载体质量比为0 % ；螺旋藻多糖佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为2四。
B、取H3N2流感裂解疫苗60 μ ，其中含血凝素2. 62μδ,与140 μ 生理盐水混合至 终体积为200 μ ，作为单独疫苗对照组，备用；C、取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝佐剂12. 5 μ ，其中含OJmg AL(OH)3，与含血凝 素为2. 62Pg的流感疫苗60 μ 混合，然后加入生理盐水至终体积200 PlJtSAL(OH)3K 剂疫苗对照组，备用D、生理盐水200μ ，为空白对照组，备用； F、免疫接种及抗体检测将上述配好的A、B、C、D四个样品分别免疫标准体重昆明雌性小鼠，肌肉注射，每只200 μ ，每组5只，间隔3周，免疫2次，于加免后2周进行尾部采血，分离血清，检测血凝抑制抗 体效价，所测结果显示，即使在螺旋藻多糖佐剂疫苗组HA (1. 31ug)含量减半的情况下，所 产生的血凝抑制抗体效价水平也稍微高于HA含量为2. 62ug的铝佐剂组及单独疫苗组，说 明螺旋藻多糖佐剂能明显降低疫苗抗原用量，具体结果见附图4。


本发明提供一种螺旋藻多糖免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗，其特征在于所述螺旋藻多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成螺旋藻多糖0.001～100%，载体0～99.999%。可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量，以螺旋藻多糖为佐剂使用的疫苗抗原用量，仅是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，同样可以达到理想的免疫保护效果，且其安全性高、副作用小，用螺旋藻多糖为佐剂的流感疫苗，制备方法简便，疫苗质量容易控制。