志贺氏菌多价结合疫苗的制作方法一、[0002]志贺氏菌是导致人体发生细菌性痢疾的病原菌，是一种常见病和多发病，每年全球的患者达到1.6亿，造成110万死亡，其中约80%的病例发生于亚洲。我国属于细菌性痢疾发病状况较严重地区，据疫情监测资料统计，在法定甲、乙类传染病中，细菌性痢疾的发病率位于第四位，每年发病人数超过20万。由于检测手段限制及漏报严重，实质的发病数远高于报告病例，如河南某地2003年细菌性痢疾的漏报率达到98.92%，河北正定2002年的一项调查发现监测病例是报告病例的10倍，河南某县2010年的调查显示实际病例是报告病例的18倍。近年来，随着人民生活水平的提高和卫生条件的改善，菌痢的发病率大幅下降，但暴发疫情仍层出不穷，在2008 - 2011年期间，国内报告的暴发疫情就达到82起，发病数3805例，暴发原因以食源性污染为主，多集中于学校和农村。[0003]志贺菌属分四个血清群，A群痢疾志贺菌，B群福氏志贺菌，C群鲍氏志贺菌和D群宋内氏志贺菌，其中A群又可分为15个血清型，B群16个血清型，C群20个血清型，D群I个血清型。由痢疾志贺I型引起的菌痢最为严重，常常引起爆发流行，有部分患者还能发展为致命的溶血尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS);福氏志贺菌和宋内志贺菌是引起菌痢的最常见菌型，占分离菌的90%左右，其中发达国家以D群为主，发展中国家以B群为主；鲍氏志贺菌和其它痢疾志贺菌引起的病例相对较少。我国菌痢的优势血清群一直是B群，二十世纪以福氏2a型为主，可占到绝大多数，自二十世纪末，血清型呈现多样化趋势，福氏4c、la、2b、X变种等血清型大幅上升。除了 B群内部血清型的变化外，D群也上升迅速，尤其是2005年以后，在一些地区D群甚至成为引起菌痢的优势菌群。由于志贺氏菌的优势血清型是B群和D群，B群虽有多个血清型，但因共同O抗原骨架的存在，一些血清型间有交叉，因此，数个血清型就能交叉保护到基本所有B群的血清型别，再加上常引起爆发流行的痢疾志贺I型，包括痢疾志贺I型、福氏2a、福氏3a、福氏6型和宋内志贺菌的志贺氏疫苗，就基本可以涵盖所有流行的志贺菌血清型。[0004]目前还没有针对志贺菌感染的免疫预防制剂，研发中的候选物有多个，主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗两种途径，灭活疫苗包括全菌体疫苗、组分疫苗和结合疫苗。本发明是一种志贺氏菌结合疫苗制剂，是以志贺菌的O-特异性多糖与载体蛋白质共价偶联制备而成。国内外都曾报道过对痢疾志贺I型、福氏2a型、宋内志贺氏菌制备的单价结合疫苗的研制情况，也有福氏宋内氏双价痢疾结合疫苗研制的报导，有些甚至开展了人体效果观察，证明都能诱导产生高效价的特异性抗体应答。在以色列的临床试验证明，宋内志贺氏结合疫苗能产生74%的对型保护。[0005]细菌的O-特异 性多糖是来源于革兰氏阴性细菌脂多糖的抗原成分。革兰氏阴性细菌的脂多糖是一种毒性成分，也是细菌的保护性抗原，它的抗原决定簇位于脂多糖的O-特异性多糖侧链部分。通过化学方法可将志贺氏菌的O-特异性多糖从菌体中分离出来，但O-特异性多糖分子量一般在I万道尔顿左右，是半抗原，而且它的结构也是单元重复类型，属于典型的T细胞非依赖型抗原，可以采用氨还原、氰化物活化或其他适宜的方法，将O-特异性多糖成分与载体蛋白质共价偶联，使其转化为T细胞依赖性抗原，制备出不同型的细菌性痢疾单价结合物，用以研制细菌性痢疾的预防制剂。但志贺氏菌属有四十多个血清型，常见的流行型也有数种，志贺氏疫苗的研制必须要考虑如何最大限度的覆盖流行血清型，以保证研制疫苗的适用性和有效性。多价疫苗是扩大疫苗血清型别覆盖率的最直接、最有效手段，如4价流脑多糖疫苗、13价肺炎球菌结合疫苗、23价肺炎球菌多糖疫苗等就是多价疫苗的典型代表。但由于细菌的血清型别众多，多价疫苗也不可能覆盖所有血清型，如肺炎球菌血清型有90个以上，因此，都通过选择菌型间更常见的优势型别，确保以尽量少的价次提供最广泛的保护效果，如23价肺炎球菌多糖疫苗包括的血清型可对90%肺炎链球菌侵袭性感染提供预防保护。志贺氏菌属分为四个血清群，四十多种血清型，但分离到的流行菌多属于B群和D群，占90%左右，因此，只要预防了志贺氏菌属的B群和D群，就可以预防90%的志贺氏菌感染。D群仅一个血清型，B群虽有多个血清型，但因共同O抗原骨架的存在，血清型间有交叉，仅需选择O抗原骨架不同的几个代表型，就基本覆盖了 B血清群。鉴于此，选择D群的宋内氏志贺氏菌，B群的福氏志贺氏2a、福氏3a和福氏6型组成了志贺氏疫苗的基本型别。再加上虽不常见，但会引起爆发流行的痢疾志贺I型。这种包括痢疾志贺I型、福氏2a、福氏3a、福氏6型和宋内志贺菌的志贺氏疫苗，就基本可以涵盖所有流行的志贺菌血清型。[0006]研制多价疫苗最大的问题是抗原间是否存在免疫干扰，有报导称一个含6组分金黄色葡萄球菌疫苗的抗原间就存在免疫干扰。本发明制备的多价疫苗所含5种血清型结合物在小鼠中免疫原性良好，各抗原都能诱导相应的免疫应答，抗原间无干扰。三、
[0007]本发明提供一种志贺氏菌多价结合疫苗组合物，所述疫苗为多价疫苗，即包括多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗。
[0008]本发明的多种抗不同型的志贺氏菌感染的疫苗组合物中，包括以下组分:
[0009]