专利名称：选择性裂解的全细胞疫苗的制作方法肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae ;肺炎双球菌)感染是世界范围内发病和死亡的主要原因，并在儿童和老年人中引发重病(包括肺炎、脑膜炎和菌血症)和一些不太严重的感染(如中耳炎)。在发展中国家，每年几乎有一百万儿童死于肺炎双球菌疾病的感染。肺炎链球菌多药耐药菌株的快速出现限制了抗生素的效力并鼓舞了利用疫苗预防肺炎双球菌感染的新一轮兴趣。获批的肺炎双球菌疫苗由血清型特异性的荚膜多糖或荚膜多糖-蛋白缀合物的可注射多价混合物组成，并因此仅对所包含的血清型有效。例如，尽管7价肺炎双球菌缀合物疫苗(PCV7)显著地降低了疫苗型(VT)菌株引起的侵袭性肺炎双球菌疾病的发病率，但是最近的研究显示出非VT血清型逐步取代了 VT血清型，潜在地限制了疫苗的有用性。这使得对如下内容进行了评估是否可通过血清型非依赖性抗原(serotype-independent antigens)的免疫接种来预防肺炎双球菌的定殖。例如,用在整个肺炎链球菌种中广泛保守的某些蛋白进行的粘膜免疫显示出诱发全身性的、粘膜抗体并赋予了针对肺炎双球菌疾病和定殖的防护作用。继续对免疫原性组合物(包含肺炎链球菌多糖和蛋白)的鉴定进行研究，所述组合物针对所有血清型均引起抗体介导的免疫应答和T淋巴细胞介导的强免疫应答这两种免疫应答。可选策略使用了灭活的肺炎双球菌细胞(提呈多种血清型非依赖性的抗原)作为廉价疫苗，但是此前未对这些组合物的免疫原性进行足够的探究。因此，对制备全细胞肺炎双球菌疫苗的新策略和了解相关免疫机理存在需要
本文中给出的实施方式提供了包括革兰氏阳性细菌(例如肺炎双球菌)细胞制剂的免疫原性组合物，所述制剂已通过具有如下特点的方法灭活增加了经传统方法灭活的制剂中未发现的免疫原性组分的暴露，并且保留了细菌尺寸颗粒的优点用于抗原摄取。所述免疫原性组合物包括灭活的、全细胞制剂的细胞部分(cellular fraction)和上清液(例如，溶剂或水相)部分，该组合物与分别给予的细胞部分和可溶部分(soluble fraction)相t匕，显示出协同的免疫原性性质。这些免疫原性组合物并不依赖于肺炎双球菌的荚膜多糖，提供荚膜血清型非依赖性的免疫原性在某些实施方式中，所述肺炎双球菌为无荚膜的变体。在某些实施方式中，所述肺炎双球菌为缺乏IytA基因(指定(specifies)主要的自溶素)的变体，因此，这一肺炎双球菌变体的培养物可生长到相对高的密度而不自溶。在其它实施方式中，已对肺炎链球菌溶血素(PdT，细胞毒素)的基因进行了取代以指定突变的蛋白PdT，所述突变蛋白PdT无毒，但仍然是TLR4激动剂(具有引发(engage)固有免疫系统的能力)。在本发明的一个实施方式中，用试剂(如￠-丙内酯(BPL))对肺炎双球菌细胞进行处理(灭活)(a)该试剂以释放出多种保护性免疫原的方式使细胞部分裂解，所述免疫原经验证为可溶分子；(b)该试剂可被除去而不用对收集的细胞进行漂洗，从而使释放入悬浮液中的免疫原可容易地被保留在制剂中；以及(C)该试剂维持了肺炎双球菌细胞的整体结构，以促进通过对具有TLR配体的细菌尺寸颗粒进行应答的免疫系统的传入支(afferent limb)的那些组件进行的摄取。在类似的实施方式中，所述试剂为氯仿或三氯乙烯。在另一实施方式中，通过包括声波处理的方法来制备所述全细胞免疫原性组合物制剂。可通过注射、也可通过鼻腔途径、舌下途径、颊(buccal)途径或透皮途径给予本发明的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可与适当的佐剂(如铝佐剂(alum)或肠毒素相关分子(例如霍乱毒素))联合使用。本文所述的肺炎双球菌免疫原性组合物制造起来相对简单且廉价，并且比之前所述的肺炎双球菌疫苗更加有效。例如，少至I. g的剂量显著地使小鼠免于致死实验性肺炎。图IA显示出在所示剂量时(X轴)，与经乙醇处理的细胞制备的肺炎双球菌全细胞(WC)疫苗(WCE)相比，使用氯仿处理的细胞制备的肺炎双球菌全细胞(WC)疫苗(WCC)增强的保护作用。每隔一周，将疫苗以所示剂量经鼻内给予小鼠，共给予两次，所述疫苗使用Iug的霍乱毒素(CT)作为佐剂。在最后一次免疫接种3周后，用不同的血清型(血清型6B)经鼻内对小鼠进行激发(challenged)。在激发I周后，对每鼻腔洗涤物的菌落形成单位(CFU)进行测定。在比WCE的剂量低10-100倍时，WCC具有显著的保护作用。图IB显示出在IO8剂量时WCB (使用3 -丙内酯制备的WC疫苗)的保护作用(图6A和图6B显示出其在单独的测试中具有与WCC等同的效力)。图IC给出了 WCE、WCC以及WCC离心后的上清液部分(WCCsu)的比较；剂量为IO8的WCE或IO8的WCC或等价量的WCC上清液。所示的组接受CT (霍乱毒素)作为佐剂；一个对照组接受盐水而不是CT ；WCCsu的保护作用大于WCE，具有统计显著性。图ID显示出裂解物具有同等的保护作用，图IE显示出通过血细胞检测的，该裂解物同等地在体外致敏了 IL-17A的应答，IL-17A为定殖模型中的保护作用的相关物(correlate)。图2A-图2B显示出激发前免疫应答与定殖和吸入性脓毒病模型中的保护作用的关系。将剂量为Iy g、10yg或IOOiIg的WCB(使用￠-丙内酯制备的WCV)吸附至Al (OH) 3 (0. 2Img Al/剂)，并每隔两周经皮下注射一次，共注射三次。图2A显示出血清型6B的定殖与IL-17A应答的关系；定殖与IL-17A的激发前浓度呈反相关。图2B显示出吸入性脓毒病模型中的存活率与抗WCA (全细胞抗原)IgG的激发前滴度范围的关系。在第三次给药8天后，将小鼠用异氟醚麻醉并经鼻内(i. n.)给予处于100 u L PBS中的IO6CFU的血清型3菌株WU2。这一模型一般在激发后的I周内在大多数(> 90%)首次接受试验的小鼠(naivemice)体内诱发脓毒病。存活率随滴度升高而增高，并且在滴度> 10，000任意单位(arbitrary units)时，存活率为 100%。图3A和图3B显示出由肺炎双球菌细胞(具体地，RM200细胞)释放的蛋白的 SDS-PAGE的放射显影照片。图3A显示出经氯仿灭活的细胞悬液离心(16，OOOXg ；5min)后的上清液(su) (WCCsu)或经另一有机溶剂三氯乙烯灭活的细胞悬液离心(16，OOOXg;5min)后的上清液(WCTsu);这两种制剂在灭活后均未漂洗。将其与用乙醇灭活的疫苗悬液的上清液(WCEsu)进行比较，该疫苗在传统疫苗制备过程中进行了漂洗；仅残余了痕量的上清液蛋白。图3B显示出经P -丙内酯灭活的细胞的上清液(WCBsu)，类似地，该上清液在灭活后未漂洗。图4A和图4B显示出通过WCB上清液或沉淀物(pellet)(细胞)部分的诱导，致敏IL-17A对WCA的应答(图4A)和抗体对WC抗原的应答(图4B)。通过在16，000 X g离心30min制备所述上清液(WCBsup)。将抗原吸附至Al (OH) 3(0. 24mg Al/剂)。各小鼠每次免疫接种时接受30 yg的剂量(蛋白含量)。将小鼠每隔两周进行免疫接种，共免疫接种两次，在第二次免疫接种I周后取血样用于分析。细胞部分在诱发IL-17A的应答中更加有效，而上清液在诱发抗体应答中同样有效或更有效。图5A-图5C显示出Al (OH)3吸附对WCC的免疫原性的影响。将抗原在4°C孵育18h，同时轻缓地混合，从而提供Iii g、IOiig或IOOiig的蛋白和0.21mg Al/0. 2ml剂。将吸附或未吸附的抗原或者单独的Al (OH)3每隔两周于下背区域(lower back area)的皮肤下注射到小鼠体内，共注射三次。在第三次注射2周后，用肺炎双球菌6B型菌株0603激发小鼠。在激发10天后，对从鼻腔洗涤物样品中回收的CFU进行测定。在第8列数据中，WCC-Al (OH)3制剂在37°C孵育了 I个月，在注射前储存于4°C( A标出)。图5A显示出通过第二次注射两周后所取血样检测的在体外致敏IL-17A对WCA的应答；图5B为在那些血样中通过ELISA测定的抗WCA的IgG抗体。图5C显示出将血清型6B从鼻咽的清除。除非标明，在该图和随后的图中，通过Mann-Whitney U计算出的与单独的佐剂相比较的差异显著性以星号示出:*P〈0. 05，**p〈0. 01和***p〈0. 001。依据所有三个标准，Al (OH)3都使得免疫原性极大地增高。图6A-图6B给出了 WCC与@ -丙内酯灭活细胞(WCB)制成的抗原之间的比较；以及CD4+细胞在定殖模型中的作用。实验安排、分析和激发与图5中一样。图6A显示出IL-17A的致敏；剂量-应答显示出WCB与WCC的免疫原性相当。图6B显示出对将血清型6B菌株从鼻咽的清除；依据这一标准，WCB和WCC同样有效。通过在激发前I天和激发后2天、5天、8天给予⑶4抗血清，对WCC免疫动物组的⑶4+细胞依赖性进行评价(在标注α -⑶4的列中)；在这些动物中，上述增强的清除被消除。图7Α-图7C显示出WCB的3次注射实验安排或2次注射实验安排对致死的血清型3吸入性脓毒病的影响。将剂量为I μ g、10 μ g或100 μ g的WCB吸附至Al (OH)3CO. 2ImgAl/剂)并每隔两周给予。图7A显示出在3次注射实验安排中，在第三次给药8天后，将小鼠用异氟醚麻醉并经鼻内给予处于IOOyL PBS中的IO6CFU的菌株WU2。示出了存活曲线。将7天后仍活着的小鼠处死，并培养以验证肺炎双球菌菌血症仅有的菌血症动物为单用Al (OH)3的三个对照中的两个。与100 μ g的剂量一样，IOyg的剂量具有完全的保护作用。在所示组中评价保护作用对CD4+细胞的依赖性，在激发前I天和激发后3天向所 示组给予CD4抗血清；与定殖模型相反，没有可检测到的保护作用的消除，表明单独的抗体应答对保护作用来说是足够的。图7B和图7C显示出更简单的2次注射实验安排。图7C显示出在激发前2天所取的血浆样品中，给予了 100 yg剂量的所有动物具有超过10，000的滴度，而给予了 10 μ g剂量的动物中并非所有的动物都具有超过10，000的滴度。在第二次给药9天后，小鼠被激发，如同图7A中一样将存活率绘制成图表；对于10μ g剂量，保护作用是部分的，对于100 μ g剂量，保护作用是完全的，这与抗体应答的情况一致。图8A-图SC显示出兔子免疫接种研究的结果。在第I天、第15天和第29天，经肌内注射向各包括三只雌性新西兰白兔的组分别给予盐水；单独的Al (OH)3 (O. 6mg Al);剂量为50 μ g、500 μ g或5000 μ g的Al (OH)3吸附的WCB ;或DTwP疫苗(毒性对照)。在免疫接种前和在第43天取血清。图8A显示出在第43天时抗WCA的血清IgG抗体的滴度剂量依赖性地增高。图8B反映了被动保护利用来自兔子的第45天的混合血清(pools of sera)检测血清型3小鼠肺炎模型中的被动保护，所述兔子用Al (OH) 3和Al (OH) 3吸附的WCB以500 μ g的剂量进行了免疫接种。将血清在56°C加热30min以使补体失活。如图7A中所述，在用菌株WU2激发前一天，经腹膜内向小鼠给予200 μ L的其中一种混合血清和300 μ LPBS。存活曲线显示出了免疫血清的完全保护作用。图8C显示出调理吞卩遼(opsonophagocytic)灭活分析。将来自于用单独的铝佐剂或铝佐剂吸附的WCB (500 yg/剂)免疫接种了三次的兔子的血清经加热处理后，用于使用血清型6B肺炎双球菌菌株(0603 )进行的表面灭活分析中。在所测试的三个稀释度(1/5、1/20和1/80)下，与处在同样稀释度的免疫前血清相比，免疫血清显著地增高了肺炎双球菌的调理吞噬灭活。通过Mann-Whitney U检验，**P〈0. 008。图9A-图9B详细地示出了小鼠对Al (OH) 3吸附的WCB (通过皮下注射给予三次)的剂量-应答。图9A :IgG抗体应答；图9B :IL-17A应答。依据这两种标准，基于灭活前的活细胞计数，最佳剂量为3. 3E7，对应的蛋白剂量为33 μ g。通过3. 3yg而非Iyg产生了统计上显著的IL-17A应答，而显著的抗体应答是由少至I μ g产生的。除非另作说明，如本文所使用的并贯穿本申请文件的E5=105、E6=106、E7=107、E8=108、E9=109、E10=101CI，依此类推。图10A-10B显示出在所示剂量时,经颊途径和舌下途径的WCC抗原的免疫原性(基于灭活前的活细胞计数)，利用 ο μ g双重突变的LT佐剂R192G/L211A (dmLT)—起进行测试。以周为间隔免疫接种三次。如图2中所述进行激发。图10A绘制了抗全细胞抗原(WCA)血浆抗体的滴度(这里，颊途径被称作“ 口腔”途径)；如左侧所示，尽管比皮下途径低得多，但是经上述两种途径都存在着可测的对WCC的抗体应答；图IOB反映了通过血细胞检测的在体外致敏IL-17A对WCA的应答(pg/ml，y轴)；上述两种途径都存在着剂量依赖的应答。图IlA显示出颊途径和舌下途径都诱导了剂量依赖性地增高的将血清型6B从鼻咽的清除。图IlB显示出IL-17A生成和定殖之间的相关性。图IlC显示出血清型应答和定殖之间的相关性。图12A和图12B给出了当将WCC与大肠杆菌(E. coli)不耐热毒素(LT) 一起给予时的免疫原性数据(抗WCA IgG和IL-17A)。图12C和图12D显示出超声产生的WCC片段经透皮途径(TCI)的免疫原性。以等同于IO8细胞的剂量，将在纱布贴剂中的平均直径为IOOnm或20nm的片段连同I μ gLT佐剂(如果示出)一起施用到被轻轻摩擦以去除角质层的背部皮肤上。将所述贴剂留在原位18h。以两周为间隔将这一免疫接种进行三次。在第三次免疫接种10天后取血样用于IL-17A的分析，在6天后进行肺炎双球菌的激发。图12C显示出对于经TCI和经i. η.给予，通过血细胞检测的在体外致敏IL-17A对WC抗原的应答的数据的比较。图12D :TCI给药和i. η.给药间的血清型6Β定殖清除数据的比较。对于其他细节，参见图 IA-图 IE 的描述。*Ρ〈0· 05、**Ρ〈0. 005、***Ρ〈0. 0005。图13Α-图13C显示出免疫接种的次数和剂量与抗体应答(图13Α)、IL-17A应答(图13Β)以及定殖(图13C)之间的关系。图14显示出IL-17A刺激(stimulation)数据,其中，“sup”表示利用WCB离心后收集的上清液进行刺激。图15显示出与盐水相比，单独给予的佐剂显示出了加速肺炎双球菌清除的迹象(虽然统计学上并不显著)，该迹象为这一模型中的预期结果，在这一模型中接种和激发通过相同的途径进行。然而，当和IO8的WCE —起给予时，mLT可提供出色的保护作用。的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围只通过权利要求进行限定。除非上下文中清楚地另有所示，本文和权利要求中所使用的单数形式包括复数的情况，反之亦然。除了在操作实施例中以外，或另有所示，本文所使用的所有表示成分的量或反应条件的数字均应被理解为在所有情况下由术语“大约”修饰。为了描述和公开的目的，所有的专利和其它已确定的出版物在此明确地引入本文作为参考，例如，所述出版物中描述的方法学的使用可能与本发明相关。这些出版物仅因为它们的公开早于本发明的申请日而提供。这方面的任何内容不应视为承认发明者没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。除非另有定义，本文所使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常的理解相同的、与本发明有关的含义。尽管任何已知的方法、设备和原料可被用于本发明的实际操作或测试中，就这一点而言，本文已对这些方法、设备和原料进行了描述。本发明与全细胞肺炎双球菌制剂的选择性裂解有关。尽管在本领域中已知许多微、生物失活试剂，但是本发明以如下方式提供选择性裂解和失活使得在诱发T-淋巴细胞介导的免疫应答和抗体介导的免疫应答中高度有效的免疫原制剂成为可能。以本文所述的方式利用技术和试剂使细菌制剂选择性失活和裂解并显示出出乎意料的免疫原性，这在本领域中并不是已知的。在低收入国家中，肺炎链球菌(肺炎双球菌)在儿童中造成了主要的疾病负担(O’Brien等，Lancet，374，893 (2009))。荚膜多糖缀合物疫苗提供了血清型特异性保护，但该疫苗具有如下缺点有限的血清型覆盖度；血清型替代；以及高的生产、贮存成本；和注射(Hanage, Future Microbio. 23 (2008) ；Ray, Vaccines, 1,65 (2002))。因此，开始探索基于种共有的(species-common)蛋白抗原的、可能更经济的血清型非依赖性疫苗(serotype-independent vaccines) (Tai,Crit. Rev. Microbio.,32,139 (2006))。在一种这类方法中，出于最大化地暴露种共有的荚膜下抗原的目的，对无荚膜肺炎双球菌的灭活 细胞进行了研究。已经熟知可将失活的细菌细胞用作疫苗；已将通过加热、酚、甲醛或紫外辐射灭活用于这类失活。然而，对于肺炎双球菌的无荚膜细胞，比起传统的失活方法(如力口热等)，用70% (体积/体积)乙醇在4°C灭活该细胞产生了免疫原性更强的抗原。这一抗原制剂被称作“全细胞抗原”(WCA)，当用合适的佐剂进行配制时，被称作“全细胞疫苗”(WCV)。这里要澄清的是，这一抗原被叫做WCE是为了表示用乙醇进行了失活。因为鼻内(i. η)应用途径对诱导全身性免疫和粘膜免疫都是有效的，因此最初对鼻内(i. η)应用进行了检测。利用WCE外加作为粘膜佐剂的霍乱毒素(CT)进行的鼻内免疫接种预防了大鼠中致死的血清型3肺炎，并减少了用血清型6Β肺炎双球菌进行的小鼠的非致死鼻内激发产生的鼻咽(NP)定殖(Malley等，Infect. Immun. ,69,4870 (2001))。后一激发之所以有意义是因为，众所周知的是，鼻咽定殖是肺炎双球菌感染中必要的第一步骤(Austrian, J. Antimicrob.Chemother.，18 (A)，35 (1986))。无论是通过血清型6B的菌株还是通过血清型23F的菌株，这一激发引起中耳定殖和NP定殖，二者均可通过WCE得以减少(Malley等，Infect.Immun.，72，4290(2004))。尽管通过i. η.接种提高了血清抗体的水平，但是在无抗体时，通过CD4T细胞依赖的、白细胞介素17Α (IL-17A)介导的机制，在小鼠体内诱导了针对定殖的防护作用(Lu 等，PLoS Pathog. ,4, el000159 (2008) ;Malley 等，PNAS，102，4848 (2005))。在该定殖模型中，少至IO7个细胞(大约IOyg蛋白)的WCE (顺序给予三次)具有保护作用(Trzcinski等，Infect. Immun. , 76, 2678 (2008))。这些在先研究中，用表达天然肺炎链球菌溶血素(有效的溶细胞素)的菌株RxlAL制得WCE。作为本文所述的可选策略并预期了人类研究，可使用具有突变W433F、D385N和C428G的肺炎链球菌溶血素(PdT)的衍生物，所述突变致使分子变为非溶血性的并且不能激活补体(Berry等，Infect. Immun. ,63,1969(1995))，但是维持了其TLR4激动剂性质(Malley等，PNAS，100，1966 (2003))。此前，细胞在Todd-Hewitt-酵母肉汤中生长，该肉汤含有牛心浸液。此外，为避免牛成分的任何危害，可使用生长在大豆基培养基(Liberman 等，J. Ind. Microbio. Biotech. ,35,1441 (2009))中的细胞。WCE的一个缺点是必须从灭活细胞中分离出上述的70%乙醇，例如通过离心分离。本发明还提供了规避安全操控和处理大体积乙醇的挑战的技术，提供了至少三种可选的在低浓度下具有杀菌性的失活试剂氯仿、三氯乙烯和丙内酯。由于氯仿和三氯乙烯二者均是高挥发性的、而β_丙内酯可通过加热失活，所以无需在失活后将细胞从水相中分离，便可将这些试剂除去，这也使得首次可方便地对由所述灭活细胞释放的可溶组分进行检测。如本文所给出的，还对由声波处理产生的可溶组分进行了检测。肠毒素作为佐剂的可能的副作用(Mutsch等，N. Engl. J. Med. ,350,896 (2004))以及鼻内接种的其它问题促使对遗传上去毒的肠毒素衍生物和颊给药途径及舌下给药途径进行考虑。还用声波处理的抗原制剂对透皮免疫接种进行了检测。检测了这些不同的免疫接种程序对定殖的防护作用，证实加速了用血清型6B菌株进行鼻内激发后的鼻咽定殖清除(Lu等，2008)。本文给出的结果表明了可通过多种试剂使细胞失活以生成有效的全细胞抗原，可以多种方式给予所述全细胞抗原从而顺应具体接种计划的偏好。例如，将丙内酯(BPL)用于无荚膜全细胞肺炎链球菌菌株的裂解。BPL处理产生具有免疫原活性的两种组分。在BPL处理后，部分裂解的细胞作为细胞部分在结构上仍然是完整的。这一细胞部分在抗体诱导中略微有效，而在IL-17A诱导中极其有效，因此，促进了病原细菌的吞噬灭活(例如通过多形核白细胞)及随后的抗原提呈。此外，肺炎链球菌的BPL裂解使抗原释放入可溶(水性的)部分中，所述可溶部分以血清型非依赖性的方式发挥保护作用。通过水解BPL、并取消将它们从细胞中除去所需要的步骤，可将这些可溶组分保留在免疫原性组合物中。本文还在实验上证明了这一可溶部分的有效性。因此，当接种经处理的细菌制剂时，引发了独特且血清型非依赖性的双管齐下的(two-pronged)、T淋巴细胞介导的免疫和抗体介导的免疫。此前，用与肠毒素相关佐剂一起给予的灭活全细胞肺炎双球菌疫苗进行的粘膜免疫已经显示出，赋予了抗小鼠体内的中耳定殖和鼻咽定殖的多血清型保护作用。除可能难以实施的新的粘膜免疫策略外，本发明的实施方式提供皮下注射或肌内注射。例如，将肺炎双球菌菌株RM200进行工程化，使之无荚膜、无自溶素、并表达无毒的突变型肺炎链球菌溶血素类毒素(pneumolysoid)。培养物在无牛成分的大豆基培养基中生长,用氯仿或β-丙内酯进行灭活，并注射入C57131/6小鼠中，同时注射或不注射铝佐剂。在激发时，定殖防护作用从机理上取决于⑶4+Τ细胞的存在；相比之下，在3型吸入性脓毒病模型中，在激发时对于保护作用来说不需要CD4+T细胞，表明单独的抗体足以抵御这一模型中的死亡。在试验性的毒性研究中，接受了顺序肌内注射的兔子在注射部位表现出局部反应原性但无临床征象。由此产生的兔抗血清在体外吞噬灭活分析中有活性，并在3型吸入性脓毒病模型中对小鼠进行被动保护。本发明解决了肺炎双球菌疫苗领域中的主要需求现行的疫苗组合物利用了血清型特异性荚膜多糖以对特异的血清型进行免疫，而本发明并不是基于荚膜多糖诱导的应答。因此，可联合使用所得到的裂解细胞和可溶抗原以赋予多血清型疫苗可应用性的优点。特别是在其它疫苗由于血清型选择性而对覆盖度的缺口敏感时，这一点十分有用。其次,_ 11￡