专利名称：一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体及其制备方法亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase)是反硝化过程中的关键作用酶，它催化亚硝酸盐还原，在氮循环过程中，它可以减少正常条件下生物体内亚硝态氮积累，降低因亚硝酸盐累积对生物体的毒害作用。近年来，人们已认识到由于土壤中氮肥的流失和生活污水的含氮量过高已导致了水体富营养化，进而给人们生存的环境带来的严重而深远的影响。 通过微生物亚硝酸盐还原酶的作用可有效减轻水体中的氮污染。大肠杆菌亚硝酸盐还原酶的研究较深入，已经获得了负责编码大肠杆菌亚硝酸盐还原酶的DNA片段——NrfA基因序列。但NrfA表达蛋白的多克隆抗体制备方法未见报道。NrfA表达蛋白的多克隆抗体对于研究NrfA基因表达的机理有重要的作用，为进一步深入研究微生物亚硝酸盐还原酶的作用机理与活性调节提供基础。该多克隆抗体可用于研究其他微生物中亚硝酸盐还原酶与大肠杆菌亚硝酸盐还原酶的之间的相关性与差别。
本发明的目的在于提供一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体及其制备方法和在检测其他细菌相关蛋白中的应用。本发明的原理如下首先以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到NrfA基因编码区，构建pET48a ( + )-NrfA表达载体，将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞；在大肠杆菌中经IPTG诱导后， 进行NrfA蛋白表达；表达后的重组蛋白经过本专利中摸索到的最佳转速即可获得较好的纯化效果；再将纯化后目的蛋白免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体；制得的多克隆抗体用 ELISA方法检测抗体的效价。本发明的技术方案一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体，通过如下方法制备(1)、大肠杆菌基因组DNA的提取按Omega公司细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法提取大肠杆菌基因组DNA ； 所述的大肠杆菌为BL21 (DE3)；(2)、目的基因NrfA的PCR扩增
参照GenBank CP001665. 1中报道的大肠杆菌NrfA基因全序列设计引物 上游引物为 CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG 下游引物为 GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC ；
以步骤(1)提取的大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增目的基因片段，PCR反应条件为94°C预变性^iin ；94°C变性45s，60°C退火45s，72 °C延伸45s，共30个循环；72°C延伸 lOmin，得PCR扩增产物；
用1%琼脂糖电泳检测PCR扩增的产物；
(3)、重组质粒pETj8a( + ) -NrfA的构建
将(2)所得的PCR扩增产物经BamH I和Biol I分别在GGATCC、CTCGAG位点双酶切， 回收目的片段NrfA，与经同样酶切并回收后的pETj8a ( + )表达载体在10 XT4连接酶缓冲液中采用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物再转化大肠杆菌TGl细胞，上述获得的重组质粒用PCR和双酶切方法鉴定，鉴定成功的重组质粒经北京六和华大基因科技股份有限公司进行序列测定，最终测序结果表明该重组质粒构建成功，并命名为重组质粒PETISa (+ ) -NrfA ；
其中连接产物转化大肠杆菌E. coli TGl细胞操作过程如下
①、取步骤(3)中所得的连接产物5yL，加到200yLΕ. coli TGl感受态细胞悬液中， 轻轻混勻，冰上放置30min ；
②、42°C水浴热激90sec，迅速取出置冰上冷却5min；
③、加入800μ L 37°C预热的LB液体培养基，混勻后37°C水浴lh，使细菌恢复正常生长状态；
④、4000r/m离心lOmin，弃800μ L上清，取剩余的200 μ L菌液均勻涂布于LB固体培养基平板上，37°C正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养8_12h ；
(4)、NrfA蛋白的表达、纯化
将步骤(3)所得的重组质粒pET48a ( + )_NrfA转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行表达，挑取单克隆培养后，所得的阳性克隆培养物以洲接种量接种于卡那霉素含量为50mg/ml的LB 培养基，37°C摇床培养至对数生长期，加入终浓度为lmmol/1的IPTG进行诱导，37°C、220r/ m摇床培养4h ；离心收集菌体，菌体经pH7. 4的PBS洗涤三次，超声波裂解细胞，离心收集沉淀；
沉淀依次经洗涤液I、洗涤液II、溶解液III分别洗涤三次，每次转速6000rpm，最后得到的沉淀部分即为粗NrfA目的蛋白；
所述的洗涤液 I 为 50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，1% TrionX-IOO，pH8. O ； 所述的洗涤液 II 为 20mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，4mol/ L 尿素，pH8. O ； 所述的洗涤剂 III 为 50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA,8mol/ L 尿素，5mmol / L3-巯基乙醇，pH8. O ；
将粗NrfA目的蛋白经超滤管离心超滤脱去脲素即得NrfA目的蛋白； 重组质粒ρΕΤ48ει ( + )_NrfA转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞操作过程同步骤(3)中的连接产物转化大肠杆菌E. coli TGl细胞的操作过程；
(5)、多克隆抗体的制备与鉴定多克隆抗体的制备
步骤(4)所得的NrfA目的蛋白经pH7. 4的PBS溶液调整，使其终浓度为0. 2mg/ml，再以1 :1比例与弗氏完全佐剂混合，常规方法免疫新西兰雄兔1次，按同样方法，1 :1比例与弗氏不完全佐剂(FIA)混合，再免疫雄兔2次，然后颈动脉取血，分离血清，即得到一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体。
多克隆抗体的鉴定
上述一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体用ELISA检测其效价为其效价为1 204900。本发明的有益效果
本发明的一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体，对于研究NrfA基因表达的机理有重要的作用，为进一步深入研究微生物亚硝酸盐还原酶的作用机理与活性调节提供基础。该多克隆抗体也可用于研究其他微生物中亚硝酸盐还原酶与大肠杆菌亚硝酸盐还原酶的之间的相关性与差别。


图1、NrfA基因PCR扩增图，图中M为DNA分子量标准，1为阴性对照，2为NrfA 基因PCR扩增产物；
图2、pET-28a ( + ) -NrfA重组载体双酶切鉴定图，图中M为DNA分子量标准，1为重组质粒，2为双酶切重组质粒；
图3、pET-28a ( + ) -NrfA重组载体PCR鉴定图，M为DNA分子量标准，1为阴性对照，2为质粒PCR扩增产物；
图4、重组蛋白纯化SDS-PAGE图，图中M为低分子量蛋白标准，1为纯化的重组蛋白；
图5、多克隆抗体效价测定结果图6、多克隆抗体的Western blotting分析图，图中M为低分子量蛋白标准，1为纯化的重组蛋白；
图7、重组质粒pET-28a ( + ) -NrfA图。

本发明用的E. coli TGl作为克隆宿主菌；
本发明用的E. coli BL21 (DE3)作为目的基因NrfA表达菌和用作大肠杆菌基因组DNA 的提取。大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体用ELISA检测其效价。该方法参考文献如下陈俊峰，贾敬亮，张红艳.酶联免疫法检测生鲜乳中三聚氰胺的研究[J].《乳业科学与技术》，2011，1:30-32.张存政，杨春龙，刘贤进，陈敏等.酶联免疫法检测新型除草剂双甲胺草磷[J]. 《分析化学(FENXI HUAXUE)研究报告》，2011, 39(2) 225-230.张金凤，刘春娃.溶血标本对酶联免疫法检测HBsAg的影响[J].《医学检验》，2011，18(7) :92.李玲，曾庆坤，唐艳.双抗体夹心酶联免疫法测定水牛初乳中的IgG[J],《食品工业科技》，2011，3:382-384.
发明测定方法中所用主要试剂蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物购自Oxoid公司(英国)；IPTG、Kanamycin购自上海生工生物公司；DNA回收试剂盒购自Biomiga公司；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH K Xho I及其配套缓冲液购自i^ermentas公司；HRP标记的羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术公司；PVDF膜为美国Millipore公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯。本发明所用主要测定仪器高速离心机、96孔板、多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；SYQ-DSX-280型灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；PHSJ-4A型PH计(上海大中分析仪器厂)；SHP-150型C02恒温培养箱(上海精宏设备有限公司)。实施例1
一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体，通过如下方法制备
(1)、大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA的提取
按Omega公司细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法提取大肠杆菌基因组DNA ；
(2)、目的基因NrfA的PCR扩增
参照GenBank CP001665. 1中报道的大肠杆菌NrfA基因全序列设计引物； 上游引物为 CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG ； (BamH I) 下游引物为 GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC (Xhol I)。以步骤(1)提取的大肠杆菌BL21 (DE3)的基因组为模板，PCR扩增目的基因片段； PCR扩增反应条件为94 V预变性^iin ；94 V变性45s，60 V退火45s，72°C延伸45s，共
30个循环；72°C延伸IOmin ；
用1%琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，NrfA基因PCR扩增图见图1所示，从图1中可以看出已成功扩增出与目的片段NrfA大小(1437bp)相符的DNA片段；
(3)、重组质粒pETj8a( + ) -NrfA的构建
将步骤(2)所得的PCR扩增产物用BamH I和)(hol I分别在GGATCC、CTCGAG位点双酶切，回收目的片段NrfA，与经同样酶和同样位点酶切并回收后的pETj8a ( + )表达载体连接，
连接反应如下
回收_切pET-32a(+)载体 6μΙ·
回收的目的基因片段2μ
T4DNA SSiI1μΧ
10 ΧΤ4连誦缓沖液1μ
室温反应30min，然后80°C保温10 min,冷却后4°C，再用连接产物转化大肠杆菌 E. coli TGl细胞，获得重组质粒PETj8a( + )-NrfA，其结果见图7 ；获得的重组质粒ρΕΤ48ει (+ ) -NrfA用PCR和双酶切方法鉴定
pET-28a ( + )_NrfA重组载体PCR鉴定图如图3所示，从图3中可以看出构建好的载体经NrfA基因序列的上、下游引物PCR扩增成功；
pET-28a ( + )_NrfA重组载体双酶切鉴定图见图2所示，从图2中可以看出构建好的载
6体经BamH I和Biol I分别在GGATCC、CTCGAG位点双酶切成功；
用DNA测序仪常规方法测定重组质粒的序列。测序结果表明该重组质粒构建成功，并命名为重组质粒pETj8a ( + ) -NrfA ；
其中连接产物转化大肠杆菌E. coli TGl细胞操作过程如下
①、取连接产物5yL，加到200μ Ε. coli TGl细胞悬液中，轻轻混勻，冰上放置 30min ；
②、42°C水浴热激90sec，迅速取出置冰上冷却5min；
③、加入800μ L 37°C预热的LB液体培养基，混勻后37°C水浴lh，使细菌恢复正常生长状态；
④、4000r/m离心lOmin，弃800μ L上清，取剩余的200 μ L菌液均勻涂布于LB固体培养基平板上，37°C正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养8_12h ；
(4)、NrfA蛋白的表达、纯化、
将步骤(3)构建成功的重组质粒ρΕΤ48ει ( + ) -NrfA转化到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，挑取单克隆培养后用与步骤(2)中相同的PCR条件进行扩增鉴定，阳性克隆培养物以洲接种量接种LB培养基(50mg/ml卡那霉素)，37°C摇床培养至对数生长期，加入终浓度为lmmol/1的IPTG进行诱导，37°C、220rpm摇床培养4h ；离心收集菌体，菌体经pH7. 4的 PBS重悬并重复洗涤三次，超声波裂解细胞，离心收集沉淀，沉淀依次经洗涤液I (50mmol/ L Tris-HCl, lmmol / L EDTA ,1% TrionX-IOO，ρΗ8· 0)、洗涤液II (20mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，4mol/ L 尿素，pH8. 0)、溶解液(50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA, 8mol/ L尿素，5mmol / L β -巯基乙醇，pH8. 0)分别洗涤三次，每次转速6000rpm，最后得到的沉淀部分即为粗NrfA目的蛋白；
粗NrfA目的蛋白SDS-PAGE图见图4所示，从图4中可以看出经纯化后的粗NrfA目的蛋白已经获得较好的纯化效果。将纯化后的粗NrfA目的蛋白再经超滤管离心超滤脱去脲素，得NrfA目的蛋白，具体操作方法为
将NrfA目的蛋白溶液经pH7. 4的PBS溶液10倍稀释后，与pH7. 4的PBS溶液1 1混合，经超滤管于3500g，4°C下离心lOmin，得到的蛋白溶液继续以1:1比例与pH7. 4的PBS 溶液混合，经相同条件超滤，重复此操作，直至最后剩余的蛋白溶液体积为Iml左右，即得 NrfA目的蛋白；
其中重组质粒ρΕΤ48ει ( + )-NrfA转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞操作过程同步骤(3) 中连接产物转化大肠杆菌E. coli TGl细胞的操作过程。(5)、多克隆抗体的制备与鉴定
多克隆抗体的制备
步骤(4)所得的NrfA目的蛋白用pH7. 4的PBS溶液调整，使其终浓度为0. 2mg/ml，再以1 :1比例与弗氏完全佐剂(FCA)混合，常规方法免疫新西兰雄兔1次，按同样方法，1 :1 比例与弗氏不完全佐剂(FIA)混合，免疫雄兔2次。然后颈动脉取血，分离血清，得到一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体；
多克隆抗体的鉴定
将制得的多克隆抗体，用ELISA检测其效价，最终所得的多克隆抗体的效价为1 204900，其结果见图5，从图5中可以看出制得的多克隆抗体具有较高的效价；得到的多克隆抗体经Western blotting分析，其结果见图6，从图6中可以看出抗体的特异性较好。以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。以下是本发明中出现的核苷酸序列的总结 seq id no:广2是本发明所用的引物序列 sequnce listing
(110)上海应用技术学院
〈120〉一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体及其制备方法 〈160〉 2 < 210 > 1
<211 > 30
<212 >
<213 >
<400 > 1
cgggatccat gacaaggata aaaataaacg ；
<210 > 2
<211 > 27
<212 >
<213 >
<400 > 2
ggcctcgagt tattggctta ACAGACC0


一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白的多克隆抗体制备方法以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到NrfA基因编码区，构建pET-28a(+)-NrfA表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白；再免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体；免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测，其效价为1204900，经Westernblotting分析，抗体的特异性较好。该多克隆抗体可用于研究其他微生物中亚硝酸盐还原酶与大肠杆菌亚硝酸盐还原酶之间的相关结构与功能。也为进一步深入研究大肠杆菌亚硝酸盐还原酶的作用机理与活性调节提供基础。